Visualización de rayos X del tratamiento ablativo intraductal a base de etanol para la prevención del cáncer de mama en modelos de rata

El cáncer de mama es una enfermedad prevalente y mortal con estrategias de prevención limitadas que vienen con efectos secundarios negativos graves. Para proporcionar un método con efectos secundarios reducidos, hemos desarrollado una técnica para la inyección intraductal de una solución ablativa a base de etanol en el árbol ductal mamario de rata que permite la obtención simultánea de imágenes in vivo y la prevención del cáncer de mama. Esto se basa en trabajos previos en ratones en los que la inyección directamente en la abertura del pezón permite dirigirse a las células epiteliales mamarias con un daño tisular colateral mínimo.

Tanto los ratones como las ratas tienen glándulas mamarias que contienen un solo árbol ductal que se origina en la abertura del pezón. Las ratas son más grandes que los ratones y permiten la inyección de un mayor volumen de etanol para el estudio del éxito de la ablación para demostrar la escalabilidad del modelo. Otro refinamiento de este método es la adición de etilcelulosa a la solución ablativa.

La etilcelulosa se ha utilizado previamente en otros enfoques clínicos para reducir la propagación del etanol lejos del área a la que se dirige. Esto se logra a través de la naturaleza del compuesto, lo que hace que se gelifique cuando entra en contacto con el líquido en el tejido. Hay cinco pasos clave involucrados en este método de prevención del cáncer de mama verificado por imágenes.

Primero debemos comenzar a dosificar a los animales con carprofeno por vía oral utilizando vasos de gel de sucralosa preparados en el laboratorio. Este tratamiento antiinflamatorio extendido se mantiene pre y post procedimiento. A continuación, retiramos el pelaje de la zona que rodea los pezones para inyectarlo con crema depilatoria para preparar al animal para las inyecciones.

Las inyecciones intraductales se realizan con un estereoscopio que ayuda a la visualización de la abertura del pezón para la inserción de la aguja. Los animales son escaneados o evaluados por microCT o fluoroscopia después de la inyección para determinar el éxito de las inyecciones. Las microtomografías computarizadas se pueden procesar para crear reconstrucciones 3D del árbol ductal mamario inyectado para un análisis adicional del llenado exitoso.

El carprofeno stock se diluye primero en PVS a la concentración requerida. Se puede agregar colorante alimentario estéril a la mezcla para confirmar mejor la mezcla completa del medicamento en la sucralosa de la taza. Las tazas se calientan en un baño de agua a 60 grados centígrados durante 15 minutos.

Secar las tazas al retirar y limpiar la tapa de la taza con etanol al 70% reduce el riesgo de contaminación. La solución de carprofeno se puede inyectar directamente en la taza usando una jeringa para perforar la tapa. En este caso, necesitamos inyectar 500 microlitros para obtener el resultado deseado.

Selle el agujero con una pegatina antes de agitar la taza durante 15 segundos y luego hacer vórtice durante 15 segundos adicionales. La mezcla homogénea se puede evaluar buscando grupos de azul oscuro. Las tazas se pueden refrigerar hasta que sea necesario.

Los animales deben prepararse dos o tres días antes de que se produzcan las inyecciones. Anestesiar al animal con isoflurano inhalante. Transfiera la rata anestesiada a un cono nasal en una almohadilla de calentamiento.

Aplique lubricante para los ojos a la rata mientras está en el cono de la nariz y luego coloque al animal boca arriba. La crema depilatoria se puede aplicar en el área de los pezones que planea inyectar con un aplicador con punta de algodón. Se puede lograr un aflojamiento más rápido del pelaje frotando el aplicador hacia arriba y hacia abajo sobre la piel del animal en el área deseada.

Es importante dejar la crema en la rata durante el menor tiempo posible para evitar quemar la piel. Las ratas son aún más sensibles que los ratones a este procedimiento. Después de 10 a 30 segundos de aplicación, use agua tibia en una gasa para eliminar completamente la crema.

Use de tres a cuatro enjuagues para asegurar la eliminación completa antes de secar la piel con una gasa limpia. Confirme una buena visibilidad y acceso a los pezones en las áreas de eliminación de piel. Repita el procedimiento depilatorio si es necesario.

Coloque a la rata en una jaula de recuperación limpia en una almohadilla de calentamiento para recuperarse de la anestesia. Dé una taza de carprofeno a las ratas preparadas en su jaula doméstica después de la recuperación. Comenzará anestesiando al animal con anestesia con isoflurano inhalante y moverá a la rata a un cono nasal una vez que haya sido completamente inducida.

Se debe aplicar lubricante ocular antes de colocar al animal boca arriba para las inyecciones. Puede ser útil pegar con cinta adhesiva las piernas cerca de los pezones que se inyectarán pero no es necesario. Una vez que haya preparado la jeringa con el volumen deseado de solución inyectable, prepare el pezón eliminando cualquier piel muerta visible con fórceps de punta fina si es posible.

El área de preocupación más común es la abertura del pezón. Las ratas a menudo tienen un tapón que sobresale de la abertura. La eliminación de este tapón puede ayudar a una mejor canulación .

Con el bisel de la aguja visible, inserte la aguja en la punta del pezón con la ayuda de la guía de pinzas de punta fina. Tenga cuidado de seguir el camino de la abertura del pezón. Los pezones de rata tienden a tener más grasa alrededor de la abertura, lo que facilita la perforación de esta grasa y creen erróneamente que ha logrado la canulación debido al avance de la aguja.

Una vez que el bisel de la aguja esté completamente rodeado por el pezón, comience a inyectar lentamente la solución. La tasa deseada es de aproximadamente 100 microlitros por minuto en ratas. Evite inyectar más rápidamente que esto para evitar posibles daños al árbol ductal.

Después de completar la inyección, espere 30 segundos antes de retirar la aguja del pezón con la ayuda de los fórceps. Esto disminuirá la probabilidad de fugas del pezón. Si se produce una fuga, use una gasa humedecida o una toallita de etanol para limpiar la solución.

El contraste y la solución derramada pueden distorsionar las imágenes adquiridas. Aquí vemos un video magnificado de la secuencia de inyección que se acaba de mostrar. Observe que la respiración del animal hace que sea difícil mantener el pezón en un solo plano focal.

Esto puede dificultar la inyección ya que el pezón no permanece en una ubicación constante. Este problema se ve agravado por la proximidad a la caja torácica y los tres pares de glándulas superiores. El tapón en la abertura del pezón ahora se ha retirado para una mejor canulación .

La aguja ahora puede orientarse hacia arriba para avanzar hacia el pezón con la ayuda de los fórceps. Una vez que el bisel está completamente insertado, puede comenzar la inyección. Si observa cuidadosamente el lado izquierdo del pezón, puede notar un aumento en el tinte azul donde la solución inyectable es ligeramente visible extendiéndose a través del árbol ductal.

Esto es mucho menos visible en la rata debido a la piel más gruesa. Aquí podemos ver la extracción de la aguja 30 segundos después de que la inyección se haya completado y la solución resultante se derrame fuera del pezón. La solución adicional se limpia, lo que permite la evaluación del área donde no vemos ningún trauma en el pezón o la cúpula del área, lo que indicaría una inyección de almohadilla de grasa.

Si se inyecta una solución que contiene etanol, se debe tener cuidado para evitar la intoxicación por alcohol. Esto requiere saber cuánto etanol se puede inyectar en una sesión y administrar una solución IP que contenga sacarosa durante el procedimiento para contrarrestar los efectos. Después de la inyección, los animales pueden recuperarse en una jaula limpia en una almohadilla térmica o trasladarse a la microTC para obtener imágenes del éxito de la inyección.

Después de mover al animal inyectado al instrumento de microTC, continúe administrando isoflurano para mantener la anestesia durante la toma de imágenes. El aumento del tamaño de la rata requiere una manipulación de posición adicional para lograr una buena imagen. El enderezamiento de la columna vertebral antes de pegar las piernas cerca del sitio para obtener imágenes es útil para generar imágenes consistentes.

Pegar las piernas con cinta adhesiva en una posición extendida puede evitar que los huesos se conviertan en el punto focal de la imagen. También hemos encontrado que la cinta adhesiva a través del abdomen de la rata puede ayudar en la reducción del artefacto de respiración para las glándulas inferiores. Varios parámetros de escaneo son aceptables para la visualización del tratamiento ductal.

Sin embargo, la dosis de radiación siempre debe considerarse al seleccionar los parámetros. La dosis de radiación resultante de estas exploraciones no debe exceder los límites de radiación para una cepa dada de ratas. El análisis fluoroscópico, en lugar de la adquisición de imágenes, puede reducir en gran medida la carga general de radiación.

Una vez que se hayan realizado todas las exploraciones o evaluaciones, el animal puede ser devuelto a una jaula de recuperación limpia en una almohadilla de calentamiento. El animal debe ser monitoreado hasta que esté completamente recuperado y devuelto a la jaula del hogar. Las copas de carprofeno deben proporcionarse hasta al menos siete días después de la inyección.

El software del instrumento microCT que utilizamos permite la creación de interpretaciones rápidas para evaluar el éxito de la inyección sin un análisis formal. Esta característica tiene un control deslizante de contraste simple que permite una reducción razonable de señal a ruido. El principal defecto de estas representaciones es que toda la imagen debe tener un umbral simultáneo.

Esto permite que las señales brillantes que claramente no forman parte del árbol ductal, como el hierro en la dieta, permanezcan en la imagen. En algunos casos, la señal verdadera como se ve aquí es tan tenue como el fondo y puede ser fácilmente eliminada de la imagen. Se pueden hacer mejores representaciones formales utilizando un software de análisis más sofisticado que permita la segmentación del área de interés.

Es mejor segmentar la almohadilla de grasa mamaria para un mayor procesamiento de imágenes con el fin de obtener la mejor interpretación del árbol ductal inyectado. El límite oscuro de la almohadilla de grasa mamaria se puede trazar a lo largo del grosor completo del animal para lograr esta segmentación. Rastrear cada tercera rebanada y propagar el objeto es suficiente para capturar la totalidad del conducto en nuestra experiencia.

En este punto, es posible establecer un umbral de la representación utilizando una rabia dada para mostrar solo el contraste contenido dentro de la almohadilla de grasa mamaria. Esto debe incluir la solución dentro del árbol ductal, así como cualquier fuga en las inmediaciones. Las soluciones de óxido de tantalio generalmente se muestran bien en un rango de 300 a 3000 HU. Se puede realizar un análisis adicional una vez que haya creado una reconstrucción del árbol ductal.

Si no se desean imágenes longitudinales, se pueden adquirir imágenes de mayor resolución que capturen mejor la compleja arquitectura del árbol ductal. Las diferencias entre animales pueden hacer que la inyección sea más o menos difícil. No podemos hablar de variabilidad de cepa a cepa, ya que actualmente trabajamos exclusivamente con ratas Sprague Dawley.

Algunos animales tendrán pezones con perfiles bajos, como el que se muestra aquí, lo que dificulta la manipulación y el logro de una canulación exitosa. Otros tendrán pezones con un perfil más alto, como el que se muestra aquí, que serán más susceptibles a la canulación . Aquí se representa un pezón canulado con éxito.

La dificultad para canular puede resultar en un trauma en el pezón como se muestra aquí. La adquisición de imágenes de microTC inmediatamente después de la inyección puede informar mejor a los investigadores sobre el éxito de una inyección, así como ayudar a identificar las propiedades de llenado de ciertas soluciones. Aquí vemos diferentes aspectos de las glándulas abdominales de la misma rata inyectada con el mismo volumen de una solución ablativa que contiene 70% de etanol con contraste proporcionado por óxido de tantalio milimolar 100.

La solución utilizada en la glándula superior que se muestra también contenía 1% de celulosa de etilo. Vemos estructuras en forma de pared en los extremos de las ramas ductales. Estos son brotes terminales llenos de la solución y que no se derraman.

En la fila inferior, vemos extremos ductales menos definidos que indican el escape de la solución del árbol ductal. Esto, junto con daños colaterales más limitados en el examen histológico. parece indicar una mejor retención de soluciones que contienen etilcelulosa en el árbol ductal.

Este método proporciona un paso hacia la escalabilidad de un método menos invasivo de prevención del cáncer de mama para ofrecer una alternativa para la mastectomía profiláctica. Se ha demostrado una ablación epitelial exitosa en un modelo de roedor más grande con efectos secundarios mínimos para el animal. La adición de etilcelulosa a la solución ablativa permite una mejor retención de la solución en el área de inyección, lo que resulta en una reducción del daño colateral.

El uso novedoso de soluciones que han sido clínicamente probadas y la capacidad adicional de visualizar el éxito de la entrega con modalidades de imagen comunes permite una traducción rápida a la clínica.