Name: Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos para el estudio de la dinámica estructural de la alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Aprende espectrometría de masas de intercambio hidrógeno/deuterio en milisegundos para estudiar la dinámica estructural de alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas. Este método automatizado permite analizar proteínas intrínsecamente desordenadas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NS está financiado por la Beca Del Jubileo de Diamante del Consejo Universitario. JJP cuenta con el apoyo de una beca UKRI Future Leaders Fellowship [Número de subvención: MR/T02223X/1].

1. Expresión proteica y purificación de aSyn
<ol><li>Prepare aSyn siguiendo un informe publicado anteriormente9.</li>
	<li>Dializar en un tampón de almacenamiento seguro (por ejemplo, Tris, pH 7.2 ).</li>
	<li>Si es necesario, concentre la muestra (por ejemplo, tubos de microcentrífuga de filtro de espín utilizando 3 kDa MWCO, 14,000 x g durante aproximadamente 10-30 min, consulte la Tabla de materiales). NOTA: Se aconseja no concentrarse excesivamente. La integridad del conjunto de monómeros no se ha verificado más allá de 25 μM.</li>
	<li>Alícuota y conservación a −80 °C NOTA: La proteína monómero aSyn es estable hasta por 1 año en estas condiciones de almacenamiento.</li>
</ol>2. Preparación del búfer HDX
NOTA: Dado que Tris tiene un coeficiente de temperatura alto, la medición del pH debe ajustarse para la temperatura a la que se realizará la reacción HDX, que es de 20 ° C en este protocolo.
<ol><li>Prepare el amortiguador de equilibrio para el Estado A y el Estado B pesando 0.002 mol de Tris en 100 ml de agua de grado LC-MS. Para el Estado B, agregue 29.8 mg de KCl, 14.2 mg de MgCl2, 36.8 g de CaCl2 y 836 mg de NaCl al tampón Tris. Ajuste el pH a 7.40 ± 0.05. NOTA: El tampón de equilibrio debe contener las condiciones en las que se va a estudiar aSyn. En este caso, es de 20 mM Tris a pH 7.4 +/− sales.</li>
	<li>Prepare el tampón de etiquetado para el Estado A y el Estado B pesando 0.002 mol de Tris en 100 ml de agua deuterada. Para el Estado B, agregue 29.8 mg de KCl, 14.2 mg de MgCl2, 36.8 g de CaCl2 y 836 mg de NaCl al tampón de etiquetado Tris. El pD del tampón de etiquetado corresponde al pH del tampón de equilibrio. Dado que pH = pD - 0.41, ajuste para que el medidor de pH lea 6.99 ± 0.0523,24. NOTA: El tampón de etiquetado debe tener los mismos componentes que el tampón de equilibrio, excepto que se prepara con agua deuterada.</li>
	<li>Prepare el tampón de enfriamiento pesando 0.010 mol de Tris y 0.050 mol de urea y haga hasta 100 ml con agua de grado LC-MS. Ajuste el pH a 2.50 ± 0.05 a 0.5 ° C. NOTA: Se debe realizar una pantalla de búfer de enfriamiento antes de los experimentos HDX para identificar el mejor búfer de enfriamiento para la proteína de interés. Se examinan diferentes concentraciones y combinaciones de desnaturalizantes (por ejemplo, clorhidrato de urea y guanidinio) y agentes reductores (por ejemplo, tris(2-carboximetil)fosfina), junto con parámetros físicos como el volumen de captura y la temperatura, para desplegar y digerir eficazmente la proteína apagada. Un tampón de enfriamiento que comprende 100 mM Tris y 0.5 M de urea a pH 2.50 es óptimo para el presente estudio.</li>
	<li>Prepare el tampón de lavado de la columna de digestión pesando 0.125 mol de clorhidrato de guanidinio en una botella de vidrio Duran. Añadir 25 ml de metanol y 250 μL de ácido fórmico. Enfríe hasta 250 ml con agua de grado LC-MS. NOTA: Para la columna de pepsina Enzymate BEH (consulte la Tabla de materiales), use un tampón de lavado de columna de 0.5 M de clorhidrato de guanidinio, 10% (v / v) de metanol y 0.1% (v / v) de ácido fórmico.</li>
	<li>Prepare el lavado débil de la jeringa pipeteando 0.5 μL de ácido fórmico en 249.5 mL de agua de grado LC-MS.</li>
	<li>Prepare el lavado fuerte de la jeringa mezclando partes iguales de agua de grado LC-MS, metanol, acetonitrilo e isopropanol. Agregue ácido fórmico a una concentración final de 2% (v / v). NOTA: Para evitar la contaminación cruzada entre los diversos tampones y la proteína y para permitir la limpieza del puerto de inyección, es fundamental que se preparen soluciones de lavado de jeringas y que la ruta de flujo a la válvula (a menudo llamada "forro de lavado") esté completamente cebada con líquido. El ácido fórmico es opcional para el lavado débil de la jeringa.</li>
</ol>3. Procedimiento de mapeo de péptidos
<ol><li>Prepare el ejemplo siguiendo el paso siguiente.<ol>
<li>Filtro descongelado aSyn protein stock del congelador de -80 °C con filtros de jeringa de 0,22 μm. Mida la absorbancia de la proteína madre filtrada a 280 nm para determinar la concentración según la ley de Beer-Lambert. Diluir la proteína a una concentración de 5 μM en el tampón de equilibrio (paso 2.1.). NOTA: La ley de Beer-Lambert: A = εcl, donde A es absorbancia, ε es el coeficiente de extinción de la proteína en la longitud de onda medida (280 nm aquí) con unidades M−1cm−1, c es la concentración de proteína en M, y l es la longitud de la trayectoria en cm. Para aSyn26 de tipo salvaje, ε = 5960 M−1cm−1.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure el método de cromatografía líquida.<ol>
<li>Cree un archivo de entrada con un tiempo de carga / captura de 3 min a una presión de 7000-9000 psi, seguido de un gradiente de 5% de acetonitrilo a 40% de acetonitrilo en 7 min, seguido de pasos de lavado repetidos de 5% -95% de acetonitrilo-agua durante 10 min.</li>
		<li>Asegúrese de que el spray de bloqueo (por ejemplo, leucina encefalina, consulte la Tabla de materiales) fluya a 2000 psi y esté conectado a la sonda de pulverización de bloqueo de fuente del espectrómetro de masas.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure los métodos MSE de espectrometría de masas. NOTA: MSE es un método de adquisición independiente de los datos de banda ancha sin aislamiento masivo de precursores. Por lo tanto, todos los iones dentro del rango m/z seleccionado se fragmentan aún más mediante disociación inducida por colisión (CID)27.<ol>
<li>En el archivo de método MS, elija MSE Continuum y configure un tiempo de adquisición entre 2-10 min, fuente de electrospray y modo de resolución positiva. Adquirir MSE sobre 50-2000 Da, escaneando cada 0.3 s.</li>
		<li>Para la función 1 (baja energía), configure la trampa y transfiera las energías de colisión para que sean de 4 V. Para la función 2 (alta energía), configure la energía de colisión de transferencia de rampa para que sea constante a 4V y la energía de colisión de trampa para que sea como se indica en la Tabla 1 para cada nivel de energía de mapeo. NOTA: También se pueden utilizar métodos MSE de movilidad iónica. Se pueden utilizar métodos alternativos de mapeo (por ejemplo, adquisición dependiente de datos o DDA) a discreción del usuario.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure el robot de muestreo automático (consulte la Tabla de materiales).<ol>
<li>Añadir 50 μL de la proteína de 5 μM a un vial de recuperación total. Coloque el vial en una posición de muestra en la cámara derecha de HDX. Asegúrese de que esta cámara esté a 0,5 °C.</li>
		<li>Agregue un vial de reactivo de tampón de equilibrio y dos viales de reactivo de tampón de etiquetado a las posiciones de reactivo uno, dos y tres en la cámara izquierda de HDX. Asegúrese de que esta cámara esté a 20 °C ajustando el controlador de temperatura Peltier (consulte la Tabla de materiales). Agregue un vial de reactivo de tampón de enfriamiento a la posición uno del reactivo en la cámara derecha HDX.</li>
		<li>Añadir ocho viales de recuperación total en las posiciones de reacción de la cámara izquierda HDX y ocho viales de recuperación máxima en las posiciones de reacción de la cámara derecha HDX. NOTA: Para garantizar una limpieza completa y la máxima reproducibilidad de los volúmenes dispensados, se recomienda realizar un lavado de jeringa y un lavado primario en las jeringas de automuestreador. Por ejemplo, ejecute una secuencia de (1) lavado débil, (2) lavado fuerte, (3) lavado débil antes de comenzar los experimentos de mapeo. Esta secuencia se puede repetir ampliamente, y se recomienda hacerlo hasta 20 veces o hasta que la jeringa esté completamente mojada.</li>
		<li>Configure una lista de ejemplo con los métodos LC y MS apropiados en el software de programación e inicie la programación. NOTA: Para el presente estudio, Chronos se utiliza como software de programación (ver Tabla de Materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Procese los datos de mapeo.<ol>
<li>Identifique los péptidos de los archivos del experimento de mapeo utilizando el software apropiado (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Importe datos de identificación de péptidos en DynamX (consulte la Tabla de materiales) utilizando los siguientes parámetros de umbral de péptidos: intensidad mínima = 5000, longitud mínima de secuencia = 0, longitud máxima de secuencia = 40, productos mínimos = 1, productos mínimos por aminoácido = 0,25, productos consecutivos mínimos = 2, intensidad de suma mínima para productos = 0, puntuación mínima = 0 y error MH+ máximo (ppm) = 0. NOTA: Alternativamente, derive la configuración optimizada de acuerdo con un flujo de trabajo recomendado28.</li>
		<li>Seleccione Datos en el menú y haga clic en Importar resultados de PLGS. Haga clic en Agregar para elegir los archivos de datos relevantes para la asignación espectral. Cuando se hayan agregado todos, haga clic en Siguiente e ingrese la configuración del filtro anterior. Luego, haga clic en Finalizar.</li>
		<li>Seleccionar manualmente las asignaciones isotópicas para obtener el mapa final de cobertura peptídica de aSyn en DynamX.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Estudio de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos
<ol><li>Limpie el prototipo de instrumento FastHDX (consulte la Tabla de materiales) antes de iniciar los experimentos HDX.<ol>
<li>Abra la GUI de software HDX compatible y permita que el sistema se inicialice.</li>
		<li>Introduzca la temperatura de la cámara de muestra como 20 °C y la cámara de enfriamiento como 0,5 °C. Haga clic en Establecer para aplicar las nuevas temperaturas.</li>
		<li>Instale los tubos de la centrífuga con agua de grado LC-MS en todas las entradas.</li>
		<li>En la pestaña Entrega de plomería del valorador , verifique las jeringas izquierda y derecha y haga clic en Prime para eliminar cualquier burbuja de aire latente en los tubos. Repita hasta que todas las burbujas se hayan ido.</li>
		<li>En la pestaña Macros , marque todas las casillas de las jeringas. Haga clic en Calibrar jeringas Posición de inicio. Haga clic en Wash Syringe Load Loop. Haga clic en Lavar todos los volúmenes del bucle de mezcla.</li>
		<li>Repita el paso 4.1.5. 1x más.</li>
		<li>Si aparece alguna burbuja en las jeringas tampón, desgasifique desconectando la jeringa y expulsando la burbuja verticalmente. Reemplace la jeringa y recalibre a la posición cero.</li>
	</ol></li>
	<li>Configure el prototipo de instrumento FastHDX para experimentos HDX.<ol>
<li>Agregue 500 uL de aSyn filtrado de 5 μM en un vial de recuperación total y colóquelo dentro de un refrigerador de mesa para evitar la oligomerización y agregación inducidas por la temperatura.</li>
		<li>Agregue 50 ml de búferes de equilibrio, etiquetado y enfriamiento a cada búfer (2. Pasos de preparación del búfer HDX 1-3) entrada en las cámaras izquierda y derecha.</li>
		<li>Añadir 50 ml de tampón de lavado de columna (2. HDX buffer preparación paso 4) a la entrada de lavado de pepsina.</li>
		<li>Para cebar las líneas de lavado de proteínas y columnas 1x, verifique las jeringas izquierda y derecha en la pestaña Entrega de plomería del valorador y haga clic en Prime una vez. NOTA: Cualquier clic posterior en Prime causará repeticiones adicionales del proceso de prime, lo que resultará en el consumo de grandes cantidades de muestra de proteína. Se recomienda tener cuidado para evitar esto, incluso cuando hay un retraso en el software después de que se haya intentado hacer clic en un botón.</li>
		<li>Repita los pasos 4.1.5. 1x.</li>
		<li>En la ficha Flujo de enfriamiento manual , introduzca la configuración necesaria, que se explica en los pasos 4.2.7.-4.2.10.</li>
		<li>Para un experimento de curso de tiempo, ingrese los tiempos en milisegundos usando el botón Puntos simbólicos . Si se requieren réplicas, agregue el mismo punto de tiempo varias veces, por ejemplo, para un triplicado de 50 ms, se debe ingresar 50 50 50. La lista de muestra en el software del espectrómetro de masas (MassLynx se utiliza aquí, consulte la Tabla de materiales) debe coincidir exactamente con esos puntos de tiempo. NOTA: Los nombres de archivo de la lista de muestra del espectrómetro de masas y / o el texto de muestra deben usarse para garantizar un registro permanente de los tiempos de etiquetado HDX correspondientes a los ingresados en la GUI del software FastHDX. Los tiempos de etiquetado para cada ejecución de muestra no se almacenarán en ningún otro lugar.</li>
		<li>Establezca el tiempo de captura (minutos) como la duración del tiempo de captura. Aquí, son las 3.00.</li>
		<li>Establezca Wait for HPLC (mins) = (tiempo de captura + tiempo de ejecución + 1,5 min).. NOTA: Por ejemplo, para un experimento con 3 minutos de captura y 17 minutos de gradiente, esto será 21.50 min.</li>
		<li>Haga clic en el cuadro Ejecutar en blanco solo si ejecuta experimentos en blanco entre ejecuciones de ejemplo. En caso afirmativo, asegúrese de una entrada (es decir, una fila válida en la lista de ejemplo) en el software para la ejecución en blanco después de cada ejecución de muestra.</li>
		<li>Una vez que la lista de muestra esté lista en el software, resalte las entradas apropiadas e inicie la ejecución en el software haciendo clic en el botón Reproducir y FastHDX en el software. NOTA: Debido a la lucha de hidrógeno / deuterio, los métodos de solo EM o técnicas de fragmentación suave (disociación por transferencia de electrones, disociación por captura de electrones y fotodisociación ultravioleta) solo se pueden usar29. Para aSyn a un pH fisiológico de 7.40, los puntos de tiempo que van desde 50 ms a 300 s son los más aplicables, ya que cubren toda la curva de absorción de deuterio8.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Tratamiento de datos
<ol><li>Cargue el archivo de péptidos asignados espectralmente de los experimentos de mapeo de péptidos. Abra el menú Archivo y haga clic en Abrir en el software DynamX (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Importe archivos sin procesar en el software de medición de masa preferido (por ejemplo, DynamX, HDExaminer, etc.). Abra el menú "Datos" y haga clic en MS Files. Haga clic en Nuevo estado para crear estados para cada condición de proteína estudiada.<ol>
<li>Haga clic en Nueva exposición para agregar cada punto de tiempo HDX. Haga clic en Nuevo RAW para importar los archivos .raw. Arrastre cada archivo .raw a la posición correcta. Haga clic en Aceptar cuando haya terminado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asigne isótopos automáticamente primero (esto es automático siguiendo el paso 5.2. anterior), luego seleccione manualmente la asignación isotópica para garantizar una alta calidad de los datos.</li>
	<li>Exporte los datos del clúster a un archivo .csv con columnas en el siguiente orden: nombre de proteína, número de inicio de secuencia, número de fin de secuencia, secuencia, modificación, fragmento, absorción máxima posible, masa de especies monoisotópicas, nombre de estado, tiempo de exposición, nombre de archivo, carga, tiempo de retención, intensidad y centroide.</li>
	<li>Abra el menú Datos en el software de medición masiva y haga clic en Exportar datos de clúster.</li>
</ol>6. Análisis de datos
<ol><li>Cargue los datos de clúster exportados en el software de análisis HDX preferido. Aquí, HDfleX se utiliza30 (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Ajuste los datos experimentales para todos los péptidos y estados, seleccionando los métodos de corrección de intercambio posterior apropiados para obtener las constantes de velocidad observadas para la reacción HDX.</li>
	<li>Calcule un umbral de significancia global por el método preferido (HDfleX admite varias opciones para esto) y realice pruebas de significación híbridas para determinar las diferencias significativas entre los estados en comparación con31,32. NOTA: Si la diferencia observada es mayor que el umbral global y el valor p es menor que el nivel de confianza elegido (por ejemplo, 95%), la diferencia se considera significativa.</li>
</ol>

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

En el presente artículo, se describen los siguientes procedimientos: (1) realizar experimentos de mapeo de péptidos en aSyn monomérico para obtener la mayor cobertura de secuencia, (2) adquirir datos de HDX-MS de milisegundos en aSyn monomérico en condiciones fisiológicas, y (3) realizar análisis de datos e interpretación de los datos hdX-MS resultantes. Los procedimientos proporcionados son generalmente fáciles de ejecutar, cada experimento de etiquetado generalmente dura solo alrededor de 8 h para tres réplicas y ocho ...

La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa que afecta a millones de personas en todo el mundo1. Se caracteriza por la formación de inclusiones citoplasmáticas conocidas como cuerpos de Lewy y neuritas de Lewy en la región de la sustancia negra pars compacta del cerebro. Se ha encontrado que estas inclusiones citoplasmáticas contienen agregados de la proteína intrínsecamente desordenada aSyn2. En la EP y otras sinucleinopatías, aSyn se transforma de un estado desordenado soluble en un estado enfermo insoluble y altamente estructurado. En su forma nativa, aSyn monomérico adopta una amplia gama de conformaciones estabilizadas por interacciones electrostáticas de largo alcance entre su N- y C-termini e interacciones hidrofóbicas entre su región C-terminal y el componente beta no amiloide (NAC) 3,4,5,6. Cualquier interrupción en esas interacciones estabilizadoras, como mutaciones, modificaciones post-traduccionales y cambios en el entorno local, puede conducir al plegamiento incorrecto del monómero, desencadenando así el proceso de agregación7.
Si bien existe una gran cantidad de investigación sobre las formas oligomérica y fibrilar de aSyn 8,9,10,11, existe una necesidad crucial de estudiar la forma monomérica de la proteína y comprender mejor qué conformadores son funcionales (y cómo) y cuáles son propensos a agregar 8,9,10,11 . Al ser intrínsecamente desordenado, de solo 14 kDa de tamaño y difícil de cristalizar, el monómero aSyn no es susceptible a la mayoría de las técnicas biológicas estructurales. Sin embargo, una técnica capaz de medir la dinámica conformacional de aSyn monomérico es el HDX-MS de milisegundos, que recientemente ha generado importantes observaciones estructurales que serían desafiantes o imposibles de obtener de otra manera 12,13,14. Millisegundo HDX-MS mide sensiblemente el promedio del conjunto conformacional de proteínas mediante el monitoreo del intercambio isotópico en hidrógenos amida, lo que indica la accesibilidad al solvente y la participación en la red de enlace de hidrógeno de una región proteica particular en la escala de tiempo de milisegundos. Es necesario enfatizar el aspecto de milisegundos del HDX-MS ya que, debido a su naturaleza metaestable y desplegada de forma nativa, aSyn exhibe una cinética de intercambio de hidrógeno muy rápida que se manifiesta muy por debajo del límite inferior de los sistemas HDX-MS convencionales. Por ejemplo, la mayor parte de la molécula aSyn ha intercambiado completamente hidrógeno por deuterio en condiciones intracelulares en menos de 1 s. Varios laboratorios han construido instrumentación de mezcla rápida; en este caso, se utiliza un prototipo de instrumento de flujo de enfriamiento de mezcla rápida capaz de realizar HDX-MS con un tiempo muerto de 50 ms y una resolución temporal de 1 ms15. Si bien HDX-MS de milisegundos ha sido recientemente muy importante en el estudio de aSyn, puede ser valioso para estudiar proteínas / regiones intrínsecamente desordenadas más ampliamente y una gran cantidad de proteínas con asas / regiones que solo son débilmente estables. Por ejemplo, medicamentos peptídicos (por ejemplo, insulina; GLP-1/glucagón; tirzepatida) y las proteínas de fusión peptídica (por ejemplo, el inhibidor del VIH FN3-L35-T1144) son los principales formatos de fármacos en los que la información estructural y de estabilidad en fase de solución puede ser un insumo crítico para las decisiones de desarrollo de fármacos y, sin embargo, la fracción peptídica a menudo solo es débilmente estable e intratable por HDX-MS en la escala de tiempo de segundos 16,17,18,19,20 . Se ha demostrado que los métodos emergentes HDX-MS con etiquetado en los dominios de segundos/minutos derivan información estructural para los G-cuadrúplex de ADN, pero debería ser posible extender esto a estructuras de oligonucleótidos más diversas mediante la aplicación de HDX-MS21 de milisegundos.
Los experimentos hdX-MS se pueden realizar en tres niveles diferentes: (1) de abajo hacia arriba (por lo que la proteína marcada se digiere proteolíticamente), (2) de medio hacia abajo (por lo que la proteína marcada se digiere proteolíticamente y los péptidos resultantes se fragmentan aún más mediante técnicas de fragmentación suave) y (3) de arriba hacia abajo (mediante la cual las técnicas de fragmentación suave fragmentan directamente la proteína marcada)22 . Por lo tanto, los datos submoleculares de HDX-MS nos permiten localizar el comportamiento de intercambio a regiones específicas de una proteína, por lo que es fundamental tener una cobertura de secuencia adecuada para tales experimentos. La resolución estructural de cualquier experimento HDX-MS se basa en el número de péptidos proteolíticos o fragmentos derivados de la proteína en la digestión o la fragmentación suave, respectivamente. En cada uno de los tres tipos de experimentos descritos anteriormente, el cambio en el intercambio de amida en cada péptido / fragmento se mapea de nuevo en la estructura primaria de la proteína para indicar el comportamiento de las regiones localizadas de la proteína. Si bien la resolución estructural más alta se logra a través de la fragmentación suave, la descripción de estos experimentos está fuera del alcance del estudio actual, que se centra en la medición de conformaciones de monómeros aSyn. Se pueden obtener excelentes resultados con el flujo de trabajo "de abajo hacia arriba" comúnmente aplicado que se describe aquí.
Aquí, se proporcionan procedimientos sobre (1) cómo preparar y manejar muestras de aSyn y búferes HDX-MS, (2) cómo realizar el mapeo de péptidos para un experimento HDX-MS de abajo hacia arriba, (3) cómo adquirir datos HDX-MS en aSyn monomérico en condiciones fisiológicas, específicamente en el dominio del tiempo de milisegundos (utilizando un instrumento personalizado; también se han descrito instrumentos alternativos para el etiquetado de milisegundos), y (4) cómo procesar y analizar los datos de HDX-MS. Los métodos que utilizan aSyn monomérico a pH fisiológico (7.40) en dos condiciones de solución se ejemplifican aquí. Si bien son críticamente útiles en el estudio de aSyn, estos procedimientos se pueden aplicar a cualquier proteína y no se limitan a proteínas intrínsecamente desordenadas.

<table><tbody><tr><td>1 y veces; 100 mm ACQUITY BEH 1.7 &mu; m Columna C18&nbsp;</td><td>Columna</td> analítica <td>186002346</td><td>Waters Corporation</td></tr><tr><td>Acetonitrilo Grado de HPLC >99,9% HiPerSolv</td><td>VWR</td><td>20060.420</td><td>Para fases móviles LC</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Sal para tampones HDX</td></tr><tr><td>Chronos</td><td>Axel Semrau (Comprado a Waters Corporation)</td><td>667006090</td><td>Software de programación para habilitar múltiples inyecciones de muestras HDX-MS automáticamente. Hay software alternativo disponible de otros proveedores, por ejemplo, HDXDirector o LEAP Shell</td></tr><tr><td>Cloruro de deuterio</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-2-50</td><td>Para tampones de etiquetado HDX</td></tr><tr><td>Óxido de deuterio (99,9% D2O)</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-4</td><td>Agua deuterada</td></tr><tr><td>DynamX 3.0</td><td>Waters Corporation</td><td>176016027</td><td>Asignación isotópica y cálculo de la incorporación de deuterio</td></tr><tr><td>Enzymate BEH Columna de pepsina</td><td>Waters Corporation</td><td>186007233</td><td>Columna de digestión de pepsina</td></tr><tr><td>Ácido fórmico, 99.0% Grado LC/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>10596814</td><td>para fases móviles LC</td></tr><tr><td>Clorhidrato de guanidinio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RDD001-500G</td><td>Chaotrope/Desnaturalizante</td></tr><tr><td>HDfleX</td><td>Universidad de Exeter</td><td>N/A</td><td>https://ore.exeter.ac.uk/repository/handle/10871/127982</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>Sal para tampones HDX</td></tr><tr><td>LEAP HDX-2 CTC Robot de muestreo PAL</td><td>Waters Corporation</td><td>725000637</td><td>Robot muestreador automático</td></tr><tr><td>Leucina encefalina Waters</td><td>Corporation</td><td>186006013</td><td>Para la calibración de espectrometría de masas lockspray</td></tr><tr><td>MassLynx</td><td>Waters Corporation</td><td>667004007</td><td>Software de control de métodos de entrada y espectrómetro de masas</td></tr><tr><td>Viales de máxima recuperación</td><td>Waters Corporation</td><td>600000670CV</td><td>Paquete de 100 con tapas incluidas: utilizado para bandeja de enfriamiento en LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Sal para tampones HDX</td></tr><tr><td>Millipore 0.22 y micro; m filtros de jeringa</td><td>Millipore</td><td>N9CA7069B</td><td>Filtros de jeringa</td></tr><tr><td>ms2min</td><td>Applied Photophysics Ltd</td><td>N/A</td><td>de mezcla rápida de flujo de enfriamiento de milisegundos instrumento hdx</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>Sal para tampones HDX</td></tr><tr><td>controlador de temperatura Peltier</td><td>LEAP Technologies Inc.</td><td>Controlador Peltier HP115-COOL/D</td><td>para ajustar con precisión la temperatura de las cámaras en el robot LEAP.</td></tr><tr><td>ProteinLynx Global Server 3.0</td><td>Waters Corporation</td><td>715001030</td><td>Software de identificación de péptidos. Hay software alternativo disponible de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Envases de reactivos</td> Paquete de <td>100</td><td>186004632</td> de <td>Waters Corporation</td></tr><tr><td>Bote de reactivos para LEAP HDX-2 Paquete de</td> 100 de <td>Waters 186001420Corporation</td>, <td></td><td>excluyendo los tapones, utilizados para tampones en LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>Óxido de deutero sódico (99,5% en D2O)</td><td>Goss Scientific (Cambridge Isotope Laboratories)</td><td>DLM-57</td><td>Para tampones de etiquetado HDX</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga con filtro de centrifugado giratorio (3 kDa MWCO)</td><td>Amicon (Merck Sigma Aldrich)</td><td>UFC5003</td><td>Micro tubos centrífugos para concentrar proteínas. Esto facilita el intercambio de tampones y la carga precisa de muestras para experimentos HDX-MS.</td></tr><tr><td>Synapt G2-Si espectrómetro de masas</td><td>Waters Corporation</td><td>176850035</td><td>Espectrómetro</td></tr><tr><td>de masas Viales de recuperación total</td><td>Waters Corporation</td><td>600000671CV</td><td>Paquete de 100 con tapones incluidos - utilizado para etiquetar la bandeja en LEAP HDX-2</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich T3253-250G</td><td></td><td>Tampón</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T60040-B2005</td><td>Tampón</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U5378-1KG</td><td>Chaotrope/Desnaturalizante</td></tr><tr><td>VanGuard 2,1 x 5 mm Columna ACQUITY BEH C18&nbsp;</td><td>Columna de desalinización de trampas</td> <td>186004623</td> de <td>Waters Corporation</td></tr></tbody></table>

espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos para el estudio de la dinámica estructural de la alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas

Millisecond Hydrogen/Deuterium-Exchange Mass Spectrometry for the Study of Alpha-Synuclein Structural Dynamics Under Physiological Conditions

La alfa-sinucleína (aSyn) es una proteína intrínsecamente desordenada cuyos agregados fibrilares son abundantes en los cuerpos de Lewy y las neuritas, que son las características distintivas de la enfermedad de Parkinson. Sin embargo, gran parte de su actividad biológica, así como su agregación, involucra centralmente la forma de monómero soluble de la proteína. La elucidación de los mecanismos moleculares de la biología y fisiopatología de aSyn requiere métodos estructuralmente altamente resueltos y es sensible a las condiciones biológicas. Sus estructuras metaestables desplegadas de forma nativa hacen que el aSyn monomérico sea intratable para muchas técnicas de biología estructural. Aquí, se describe la aplicación de uno de estos enfoques: espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX-MS) en la escala de tiempo de milisegundos para el estudio de proteínas con baja estabilidad termodinámica y factores de protección débiles, como aSyn. En la escala de tiempo de milisegundos, los datos de HDX-MS contienen información sobre la accesibilidad al disolvente y la estructura unida al hidrógeno de aSyn, que se pierden en tiempos de etiquetado más largos, lo que en última instancia produce una resolución estructural hasta el nivel de aminoácidos. Por lo tanto, HDX-MS puede proporcionar información a altas resoluciones estructurales y temporales sobre dinámica conformacional y termodinámica, interacciones intra e intermoleculares, y el impacto estructural de mutaciones o alteraciones en las condiciones ambientales. Si bien es ampliamente aplicable, se demuestra cómo adquirir, analizar e interpretar mediciones de HDX-MS de milisegundos en aSyn monomérica.

Debido a su naturaleza intrínsecamente desordenada, es difícil capturar los intrincados cambios estructurales en aSyn a pH fisiológico. HDX-MS monitorea el intercambio isotópico en los hidrógenos de amida de la columna vertebral, sondeando la dinámica e interacciones conformacionales de las proteínas. Es una de las pocas técnicas para adquirir esta información a altas resoluciones estructurales y temporales. Este protocolo es ampliamente aplicable a una amplia gama de proteínas y condiciones tampón, y esto se ejemplifica...

El conjunto estructural de la alfa-sinucleína monomérica afecta su función fisiológica y sus propiedades fisicoquímicas. El presente protocolo describe cómo realizar espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos y análisis de datos posteriores para determinar información conformacional sobre el monómero de esta proteína intrínsecamente desordenada en condiciones fisiológicas.

Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos para el estudio de la dinámica estructural de la alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas

Alpha-synuclein (aSyn) is an intrinsically disordered protein whose fibrillar aggregates are abundant in Lewy bodies and neurites, which are the hallmarks ...

Todos los organismos tienen desorden en su proteoma, estimado hasta un 33%Estas regiones son observables por espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio, pero solo en el rango de tiempo de milisegundos. Nuestro protocolo le mostrará cómo hacer esto con éxito. Esta es una técnica analítica totalmente automatizada.Simplemente configura todo, programa las mediciones de tiempo deseadas, presiona ir y aléjate. Esta técnica abre la emocionante oportunidad de detectar compuestos que estabilicen confirmaciones específicas de proteínas intrínsecamente desordenadas como la alfa-sinucleína. Para comenzar la preparación de la muestra para el mapeo de péptidos, primero tome un vial de proteína alfa-sinucleína almacenada del congelador de menos 80 grados centígrados.Y una vez descongelado, filtre con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. Luego mida la absorbancia de la solución a 218 nanómetros para determinar la concentración de proteína utilizando la ley de Beer-Lambert, y diluya la proteína con un tampón de equilibrio a una concentración final de cinco micromolares. A continuación, para configurar el robot de automuestreo, agregue 50 microlitros de la solución de proteína de cinco micromolares a un vial de recuperación total y coloque el vial en la posición de muestra en la cámara derecha del intercambio de hidrógeno / deuterio, o HDX, robótica en línea con el espectrómetro de masas.Luego coloque un vial de tampón de equilibrio y dos viales de tampón de lavado de pepsina en las posiciones de reactivo uno, cuatro y cinco de las cámaras izquierdas y un vial de tampón de enfriamiento para colocar uno en la cámara derecha hdX y ajuste la temperatura a 20 grados Celsius usando el controlador de temperatura Peltier. A continuación, agregue un número igual de viales de recuperación total y viales de recuperación máxima en las mismas posiciones de reacción de la cámara izquierda HDX y la cámara derecha HDX, respectivamente. A continuación, configure una lista de ejemplo con los métodos LC y MS apropiados en el software de programación e inicie la programación.Para obtener el mapa final de cobertura de péptidos, seleccione manualmente las asignaciones isotópicas en el software de análisis de datos DynamX HDX. Después de limpiar el prototipo de instrumento Fast HDX, abra la interfaz gráfica de usuario del software HDX compatible para inicializar el sistema. Introduzca 20 grados Celsius y 0,5 grados Celsius como temperaturas de la cámara de muestra y de la cámara de enfriamiento respectivamente, seguido de hacer clic en establecer para aplicar las nuevas temperaturas.Para limpiar y preparar el instrumento, configure los tubos de la centrífuga con agua de grado LC / MS en todas las entradas, luego verifique las jeringas izquierda y derecha en la pestaña de entrega de plomería del valorador y continúe haciendo clic en la imprimación hasta que todas las burbujas de aire latentes en los tubos desaparezcan. Para marcar todas las casillas de jeringas, primero vaya a la pestaña macros y haga clic en calibrar jeringas en la posición de inicio, luego primero haga clic en el bucle de carga de la jeringa de lavado, seguido de lavar todos los volúmenes del bucle de mezcla. Si hay alguna burbuja en una jeringa tampón, desconecte la jeringa y desgasifá desgasificándola verticalmente.Antes de recalibrar a la posición cero, reemplace la jeringa. Para configurar el prototipo de instrumento Fast HDX para experimentos HDX, primero inserte el tubo de entrada de valoración izquierdo en el vial de recuperación total. Para evitar la oligomerización y agregación inducida por la temperatura, coloque el tubo en un refrigerador de mesa.A continuación, agregue 50 mililitros de equilibrio, etiquetado, enfriamiento y tampones de lavado de pepsina a las respectivas entradas de tampón en las cámaras derecha e izquierda del instrumento, seguido de agregar 50 mililitros de tampón de lavado de columna a la entrada de lavado de pepsina. Para cebar las líneas de lavado de proteínas y columnas, verifique las jeringas derecha e izquierda en la pestaña de entrega de plomería del valorador y haga clic en cebar una vez. Después de marcar todas las casillas de jeringas como se demostró anteriormente, vaya a la pestaña de flujo de enfriamiento manual para ingresar la configuración requerida.Para un experimento de curso de tiempo, use el botón de punto simbólico para ingresar los tiempos en milisegundos. A continuación, establezca el tiempo de captura en tres y la espera a que HPLC recoja el tiempo más el tiempo de ejecución más 1,5 minutos. Si se ejecutan experimentos en blanco entre ejecuciones de muestra, haga clic en el cuadro en blanco Ejecutar después de asegurarse de que haya una entrada en el software de adquisición para la ejecución en blanco después de cada ejecución de muestra.Una vez que la lista de muestra esté lista y se hayan resaltado las entradas apropiadas, inicie la ejecución haciendo clic en reproducir y Fast HDX en el software. Para el procesamiento de datos, abra el menú de archivos del archivo de péptidos asignados espectralmente de los experimentos de mapeo de péptidos y haga clic en abrir en el software DynamX, luego importe los archivos sin procesar al software DynamX. Después de abrir el menú de datos, haga clic en MS Files.Para crear estados para cada condición de proteína que se está estudiando, haga clic en nuevo estado. Para agregar cada punto de tiempo HDX, haga clic en nueva exposición y, a continuación, haga clic en nuevo raw. Para importar archivos sin procesar, arrastre cada archivo a la posición correcta y haga clic en Aceptar cuando haya terminado.Después de asignar automáticamente isótopos, seleccione manualmente la asignación isotópica para garantizar una alta calidad de los datos. Exporte los datos del clúster en un archivo csv con el orden de columnas como se describe en el manuscrito. Abra el menú de datos en el software de medición de masa y haga clic en exportar datos de clúster.Para el análisis de datos, primero cargue los datos agrupados exportados en el software de análisis HDX HDfleX. Para ajustar los datos experimentales de todos los experimentos y estados, seleccione los métodos de corrección de intercambio posterior apropiados para obtener las constantes de velocidad observadas para la reacción HDX. Luego calcule un umbral de significancia global utilizando un método preferido en HDfleX y realice pruebas de significación híbridas para determinar las diferencias significativas entre los estados comparados.El experimento de mapeo en alfa-sinucleína generó un mapa de cobertura peptídica que cubrió el 100% de la secuencia de proteínas con una redundancia promedio de 3.79. Además, este protocolo permitió la generación de curvas de captación de deuterio para diferentes péptidos de alfa-sinucleína, que luego se expresaron como gráficos corregidos ajustados y de intercambio posterior. Fue evidente que la mayor parte del intercambio de hidrógeno / deuterio en alfa-sinucleína se realizó por un segundo.La diferencia conformacional entre los estados A y B de alfa-sinucleína también fue evidente a partir de la mayor absorción de deuterio por el estado B tanto a nivel de péptido como de aminoácidos. Para una técnica tan sensible, es importante utilizar pruebas de significación estadística robustas al comparar datos. Aquí, utilizamos nuestro software HDfleX.

millisecond-hydrogendeuterium-exchange-mass-spectrometry-for-study

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video demuestra el proceso de cuantificación de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas embrionarias de dopamina de ratón pretratadas con fibrillas preformadas de alfa-sinucleína. Describe los pasos para fijar, teñir y cuantificar las neuronas dopaminérgicas que contienen agregados de alfa-sinucleína mediante inmunofluorescencia.

Estudio de la acumulación de alfa-sinucleína en neuronas dopaminérgicas embrionarias primarias de ratón

Conformación de la proteína y la dinámica son claves para entender la relación entre estructura y función de proteínas. Intercambio de hidrógeno acoplada a espectrometría de masas de alta resolución es un método versátil para estudiar la dinámica conformacionales de proteínas, así como la caracterización de la proteína-ligando y proteína-proteína interacciones, incluidas las interfaces de contacto y los efectos alostéricos.

El análisis de dinámica de proteínas utilizando hidrógeno Intercambio de Espectrometría de Masas

flexibilidad conformacional desempeña un papel crítico en la función de la proteína. En este documento, se describe el uso de la espectrometría de masas de ionización por electrospray resuelta en el tiempo junto con el intercambio de hidrógeno-deuterio para sondear los rápidos cambios estructurales que impulsan función en proteínas ordenadas y desordenadas.

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

El objetivo de este protocolo es proporcionar un sistema celular que imita la formación de alfa-sinucleína agregados en vivo. Inclusiones intracelulares de alfa-sinucleína se siembran en las neuronas primarias por la internalización y propagación de exógenos administrados agregados de alfa-sinucleína microsomas asociados nativos aislados de ratones transgénicos de alfa-sinucleína enfermo.

Administración exógena de alfa-sinucleína asociada a microsomas agregados a las neuronas primarias como un modelo de celular de gran alcance de la formación de las fibrillas de

Las síntesis de lanthipeptide catalizan las reacciones multipaso durante la biosíntesis de productos naturales péptidos. Aquí, describimos un flujo de trabajo continuo, ascendente, de intercambio de hidrógeno-deuterio de espectrometría de masas (HDX-MS) que se puede emplear para estudiar la dinámica de conformación de las sintesis de lanthipeptide, así como otras enzimas similares implicadas en la biosíntesis de productos naturales péptidos.

Una plataforma de espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX-MS) para investigar enzimas biosintéticas péptidos

Aquí, presentamos un protocolo detallado para estudiar la acumulación de sinucleína neuronal en las neuronas primarias de dopamina de ratón. Los agregados de sinucleína fosforilada en las neuronas se inducen con fibrillas preformadas de sinucleína. Las imágenes automatizadas de células etiquetadas inmunofluorescentemente y análisis de imágenes imparciales hacen que este protocolo robusto sea adecuado para el cribado de rendimiento medio-alto de fármacos que inhiben la acumulación de sinucleína.

Estudio de la acumulación preformada de la dopamina fibril-sinucleina en las neuronas de dopamina de cerebro medio del ratón embrionario primario

La mejora de la fluorescencia inducida por proteínas de una sola molécula resuelta en el tiempo es un útil sensor de proximidad espectroscópico de fluorescencia sensible a los cambios estructurales locales en las proteínas. Aquí mostramos que se puede usar para descubrir conformaciones locales estables en α-sinucleína, que también se conoce como globularmente no estructurada e inestable cuando se mide utilizando la regla FRET de mayor alcance.

Utilizando la mejora de la fluorescencia inducida por proteínas resueltas en el tiempo para identificar conformaciones locales estables un monómero α-sinucleína a la vez

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de intercambio de hidrógeno / deuterio (HDX) basado en electroforesis capilar junto con espectrometría de masas de arriba hacia abajo. Este enfoque caracteriza la diferencia en las estructuras de orden superior entre diferentes especies de proteínas, incluidas proteínas en diferentes estados y diferentes proteoformas, mediante la realización de HDX diferencial concurrente y separación electroforética.

Intercambio de hidrógeno/deuterio basado en electroforesis capilar para la caracterización conformacional de proteínas con espectrometría de masas de arriba hacia abajo

La espectroscopia de retrodispersión de neutrones ofrece un acceso no destructivo y sin etiquetas a la dinámica ps-ns de las proteínas y su agua de hidratación. El flujo de trabajo se presenta con dos estudios sobre proteínas amiloides: sobre la dinámica resuelta en el tiempo de la lisozima durante la agregación y sobre la dinámica del agua de hidratación de tau en la formación de fibra.

Espectroscopía de neutrones de alta resolución para estudiar la dinámica de picosegundos-nanosegundos de proteínas y agua de hidratación

La enfermedad de Parkinson se ha relacionado con la exposición a plaguicidas. Aquí se muestra un método para entregar los pesticidas mediante un tubo gástrico a la concentración deseada y un método para analizar su efecto en la acumulación de alfa-sinucleína en el sistema nervioso entérico.

La administración oral de la rotenona con una sonda y Análisis de Imágenes de la alfa-sinucleína inclusiones en el sistema nervioso entérico

Aprende espectrometría de masas de intercambio hidrógeno/deuterio en milisegundos para estudiar la dinámica estructural de alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas. Este método automatizado permite analizar proteínas intrínsecamente desordenadas.

Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos para el estudio de la dinámica estructural de la alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas (Video) | JoVE Journal

Espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio de milisegundos para el estudio de la dinámica estructural de la alfa-sinucleína en condiciones fisiológicas

Explorar más videos