Name: Una tubería para investigar las estructuras y vías de señalización de los receptores de esfingosina 1-fosfato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Aprende a investigar las estructuras y vías de señalización de los receptores de esfingosina 1-fosfato mediante purificación proteica y criomicroscopía electrónica. Este método facilita el desarrollo de fármacos dirigidos.

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Los datos del complejo S1PRs-Gi se recolectaron en el Centro Cryo-EM de China Occidental en la Universidad de Sichuan y el Centro Cryo-EM en la Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur (SUSTech) y se procesaron en el Centro de Computación de Alto Rendimiento Duyu en la Universidad de Sichuan. Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Ciencias Naturales de China (32100965 a L.C., 32100988 a W.Y., 31972916 a Z.S.) y el Fondo de Investigación Postdoctoral a tiempo completo de la Universidad de Sichuan (2021SCU12003 a L.C.)

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<li>Brilot, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam-induced+motion+of+vitrified+specimen+on+holey+carbon+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Beam-induced motion of vitrified specimen on holey carbon film.</a> Journal of Structural Biology. 177 (3), 630-637 (2012).</li>
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<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+an+activated+VIP1+receptor-G+protein+complex+revealed+by+a+NanoBiT+tethering+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4121(2020).</li>
<li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+processing+workflow+with+cryoSPARC%2C+RELION%2C+and+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387(2022).</li>
<li>Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassays+of+adenosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+and+guanosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+using+acetylcholinesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase.</a> Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).</li>
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Los autores no tienen conflictos de intereses.

Este protocolo describe una tubería primaria para determinar las estructuras de S1PR mediante crio-EM y medir la potencia de activación de S1PR mediante un ensayo de inhibición de cAMP mediado por Gi. Algunos pasos son cruciales para el éxito del experimento.
Para purificar el complejo S1PRs-Gi, se debe prestar más atención a la calidad del virus y a la salud de las células sf9 . La expresión del receptor se reduce drásticamente en las células sf9 pobres. La salud de las célu...

La esfingosina-1-fosfato (S1P), un producto metabólico de los esfingolípidos en la membrana celular, es una molécula de señalización lisofosfatídica ubicua que involucra diversas actividades biológicas, incluyendo el tráfico de linfocitos, el desarrollo vascular, la integridad endotelial y la frecuencia cardíaca 1,2,3. S1P ejerce sus diversos efectos fisiológicos a través de cinco subtipos de receptores S1P (S1PRs 1-5); Los S1PR se encuentran en una variedad de tejidos y exhiben preferencias únicas por las proteínas G aguas abajo 4,5. S1PR1 se combina principalmente con la proteína Gi, que posteriormente inhibe la producción de cAMP; S1PR2 y S1PR3 están acoplados con Gi, Gq y G12/13, y S1PR4 y S1PR5 transducen la señal a través de Gi y G12/136.
La señalización S1P-S1PR es un objetivo terapéutico crítico para múltiples enfermedades, incluidos los trastornos autoinmunes7, la inflamación8, el cáncer9 e incluso COVID-1910. En 2010, el fingolimod (FTY720) fue autorizado como un fármaco de primera clase dirigido a S1PR para tratar la esclerosis múltiple (EM) de recaída11. Sin embargo, es capaz de unirse a todos los S1PR excepto a S1PR2, mientras que la unión no específica a S1PR3 produce edema de la corteza cerebral, constricción vascular y bronquial, y fuga epitelial pulmonar12. Como estrategia alternativa para aumentar la selectividad terapéutica, se han producido ligandos específicos de subtipo para el receptor. Siponimod (BAF312) fue aprobado en 2019 para el tratamiento de la EM en recaída13; se dirige eficazmente a S1PR1 y S1PR5, mientras que no tiene afinidad por S1PR3, exhibiendo menos efectos secundarios en la práctica clínica14. En 2020, la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos autorizó ozanimod para la terapia de EM15. Se ha informado que ozanimod tiene una selectividad 25 veces mayor para S1PR1 que para S1PR516. En particular, en el contexto de la actual pandemia de COVID-19, se ha descubierto que los fármacos agonistas dirigidos a S1PR pueden utilizarse para tratar COVID-19 mediante el uso de técnicas de terapia inmunomoduladora17. En comparación con el fingolimod, el ozanimod ha demostrado superioridad en la reducción de los síntomas en pacientes con COVID-19 y ahora está siendo sometido a ensayos clínicos10. Comprender la base estructural y la función de los S1PR establece una base significativa para desarrollar un fármaco que se dirija selectivamente a los S1PR18.
Se utilizan muchas técnicas para investigar la información estructural de las biomacromoléculas, incluida la cristalografía de rayos X, la resonancia magnética nuclear (RMN) y la microscopía electrónica (EM). A marzo de 2022, hay más de 180.000 estructuras depositadas en el Protein Databank (PDB), y la mayoría de ellas se han resuelto mediante cristalografía de rayos X. Sin embargo, con la primera estructura de resolución casi atómica de TPRV1 (resolución 3.4 Å) reportada por Yifan Cheng y David Julius en 201319, la microscopía crioelectrónica (crio-EM) se ha convertido en una técnica convencional para estructuras de proteínas, y el número total de estructuras EM PDB fue de más de 10,000. Las áreas críticas de avance son el desarrollo de nuevas cámaras para imágenes conocidas como cámaras de detección directa de electrones y nuevos algoritmos de procesamiento de imágenes. Cryo-EM ha revolucionado la biología de la estructura y el descubrimiento de fármacos basados en la estructura en la última década20. Como la comprensión de cómo los complejos macromoleculares cumplen sus complicadas funciones en la célula viva es un tema central en las ciencias biológicas, la crio-EM tiene el potencial de revelar conformaciones de complejos moleculares dinámicos, particularmente para proteínas transmembrana21. Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) son la superfamilia más grande de proteínas transmembrana y los objetivos de más del 30% de los productos farmacéuticos comercializados actualmente22. El desarrollo de crio-EM ha contribuido a una explosión de estructuras de alta resolución de complejos de proteínas GPCR-G, permitiendo la determinación estructural de objetivos "intratables" que aún no son accesibles para el análisis cristalográfico de rayos X en el diseño de fármacos23. Por lo tanto, la aplicación crio-EM proporciona la oportunidad de determinar la estructura tridimensional de los GPCR en condiciones casi nativas cercanas a la resolución atómica24. Los avances en crio-EM permiten visualizar los fundamentos mecanicistas de la estimulación o inhibición de GPCR, y un beneficio adicional en el descubrimiento de los nuevos sitios de unión para la creación de fármacos dirigidos a GPCR25.
Confiando en los tremendos avances de la tecnología crio-EM, hemos identificado estructuras de complejos de señalización S1PR1-, S1PR3- y S1PR5-Gi agonizantes recientemente26,27. En humanos, los S1PR se encuentran en varios tejidos y exhiben preferencias únicas por las proteínas G aguas abajo 4,5. S1PR1 se combina principalmente con la proteína Gi, que posteriormente inhibe la producción de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) 3′,5'. S1PR3 y S1PR5 también son capaces de acoplarse con Gi 6,28. Dado que la activación del receptor acoplado a Gi disminuye la producción de cAMP29, se introdujo un ensayo de inhibición de Gi-amp para medir los efectos de inhibición de cAMP para capturar alteraciones funcionales26,27. Utilizando una versión mutante de Photinus pyralis luciferase en la que se ha insertado una fracción de proteína de unión a cAMP, este ensayo de cAMP ofrece un método simple y confiable para monitorear la actividad de GPCR a través de cambios en la concentración intracelular de cAMP30. Es un ensayo funcional sensible y no radiactivo y puede aplicarse para monitorear la señalización descendente en tiempo real de una amplia gama de GPCR con fines de descubrimiento de fármacos31.
Aquí, se proporciona un resumen de los métodos críticos para resolver los modos de activación y reconocimiento de fármacos de S1PR, que incluyen principalmente manipulaciones crio-EM y un ensayo de cAMP de inhibición Gi. Este artículo tiene como objetivo proporcionar una guía experimental completa para futuras exploraciones en las estructuras y funciones de los GPCR.

<table><tbody><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro; Filtro M</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 42213-PS</td><td></td></tr><tr><td>Concentrador de corte de 100 kDa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88533</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>Cat# 43016</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>Cat# 3917</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 9087-70-1</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>Cat# M0398S</td><td></td></tr><tr><td>reactivo de transfección de baculovirus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10362100</td><td>Para la preparación de baculovirus P0</td></tr><tr><td>Benzamidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B6506</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C6512</td><td></td></tr><tr><td>CryoSPARC</td><td>Punjani, A., et al.,2017</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alfa; competente E.coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# EC0112</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferina-Sal de Potasio</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# 50227</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# D2438</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# S311-500</td><td></td></tr><tr><td>ESF921 medio de cultivo celular</td><td>Sistemas de expresión</td><td>Cat#&nbsp; 96-001</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>F12 medio</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Box</td><td>Cat# SAG-01U-02</td><td></td></tr><tr><td>Resina de bandera</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# A4596</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>APExBIO</td><td>Cat# B1421</td><td></td></tr><tr><td>Gctf</td><td>Zhang, 2016</td><td>&nbsp; https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td><td></td></tr> <tr><td>GDN</td><td>Anatrace</td><td>Cat# GDN101</td><td></td></tr><tr><td>Columna de filtración de gel</td><td>GE healthcare</td><td>Cat# 28990944</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 3.11</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Solarbio</td><td>Cat# L1312</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo GloSensor cAMP</td><td>Promega</td><td>Cat# E1291</td><td>Kit de ensayo cAMP de inhibición gi</td></tr><tr><td>Plásmido GloSensor</td><td>Promega</td><td>Cat# E2301</td><td>Sensor plásmido</td></tr><tr><td>Grace' s medio</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 11595030</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 8</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88284</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# H4034</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME Reactivo</td><td>Polyplus Transfection</td><td>Cat# 114-15</td><td>reactivo de transfección</td></tr><tr><td>Janamicina</td><td>Solarbio</td><td>Cat# K1030</td><td></td></tr><tr><td>LB medio</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 12780052</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L2884</td><td></td></tr><tr><td>LMNG</td><td>Anatrace</td><td>Cat# NG310</td><td></td></tr><tr><td>MotionCor2</td><td>(Zheng et al., 2017)</td><td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td><td></td></tr><tr><td>NanoCab</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 1121822</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-G&alpha; i</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBacdual-G&beta; 1&gamma; 2</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# K210003</td><td>Para la preparación de plásmidos y P0 baculovirus</td></tr><tr><td>Q5 kit de mutagénesis dirigido al sitio</td><td>NEB</td><td>Cat# E0554S</td><td>Para la preparación de plásmidos</td></tr><tr><td>Quantifoil</td><td>Quantifoil</td><td>Cat# 251448</td><td></td></tr><tr><td>RELION-3.1</td><td>(Zivanov et al., 2018)</td><td></td><td></td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</tr><tr><td>S1PRs ADNc</td><td>addgene</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>scFv16</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 703976</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Sistemas de expresión</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Siponimod</td><td>Selleck</td><td>Cat# S7179</td><td></td></tr><tr><td>colato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1254</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 lector de microplacas</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ADN SINTÉTICO T4L (secuencia)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctgcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccaagtgtga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtcattacaaaggacgaggcggagaaac tcttcaaccaagatgtagatgcggctctccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgtgt<br/& Gt; atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggtgagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcc agcaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatcagaaatcacacacc taaccgtgccaagcgtgtcatcactaccttccg tactggaacttgggacgcttac</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher Scientific Cat</td><td># 77720</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina</td><td>Solarbio</td><td>Cat# T8180</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

una tubería para investigar las estructuras y vías de señalización de los receptores de esfingosina 1-fosfato

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Los lisofosfolípidos (LPL) son lípidos bioactivos que incluyen esfingosina 1-fosfato (S1P), ácido lisofosfatídico, etc. S1P, un producto metabólico de los esfingolípidos en la membrana celular, es uno de los LPL mejor caracterizados que regula una variedad de respuestas fisiológicas celulares a través de vías de señalización mediadas por receptores de esfingosina 1-fosfato (S1PR). Esto implicó que el sistema de señalización S1P-S1PR es un objetivo terapéutico potencial notable para trastornos, incluida la esclerosis múltiple (EM), trastornos autoinmunes, cáncer, inflamación e incluso COVID-19. Los S1PR, un pequeño subconjunto de la familia de receptores acoplados a proteínas G (GPCR) de clase A, se componen de cinco subtipos: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 y S1PR5. Sin embargo, la falta de información estructural detallada impide el descubrimiento de fármacos dirigidos a los S1PR. Aquí, aplicamos el método de microscopía crioelectrónica para resolver la estructura del complejo S1P-S1PRs, y dilucidamos el mecanismo de activación, el reconocimiento selectivo de fármacos y el acoplamiento de proteínas G mediante el uso de ensayos funcionales basados en células. Otros receptores de lisofosfolípidos (LPLR) y GPCR también se pueden estudiar utilizando esta estrategia.

Antes de congelar la muestra del complejo S1PRs-Gi, la muestra purificada debe separarse mediante cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) y analizarse con cromatografía de filtración en gel. La figura 2 muestra el complejo S1PR3-Gi como ejemplo. La fracción pico del complejo homogéneo de proteínas GPCR-G generalmente se localizó en ~ 10.5 ml de la cromatografía de exclusión de tamaño (Figura 2A). El análisis de la página SDS del complejo S1PR3-Gi (<strong cla...

S1P ejerce sus diversos efectos fisiológicos a través de la subfamilia de receptores S1P (S1PRs). Aquí, se describe una tubería para exponer las estructuras y la función de los S1PR.

Una tubería para investigar las estructuras y vías de señalización de los receptores de esfingosina 1-fosfato

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Abordamos los estados de ánimo de activación y recálculo de drogas de S1PRS por parte de la tripulación, las manipulaciones EM y el estado de rehabilitación gastrointestinal A M P A y una base menos significativa para desarrollar un medicamento que se dirija sólidamente a S1PRS Los avances en hacen posible virulizar las pinturas magnísticas de la estimulación o habitación de GP ZR y otros beneficios en el descubrimiento de los sitios de unión normales para la creación de medicamentos dirigidos a T BCR. La calidad de la muestra es la base de todo en el experimento EM correcto. Los factores esenciales para una preparación simple incluyen varios estados de producto de venta de línea SF y una concentración de N g Demostrando el procedimiento estará Heli Wang un estudiante graduado de mi nivel.Para la purificación de proteínas carga este dedo escena uno receptores de fosfato o S uno P R S G solución de complejo de proteína a una cromatografía de exclusión de tamaño o columna de filtración de gel S E C pre equilibrada con tampón S E C a una velocidad de flujo de 0,5 mililitros por minuto a cuatro grados centígrados. Para utilizar las fracciones recogidas para la criomicroscopía electrónica, concéntrelas utilizando un concentrador de corte de 100 kilodalton a 1.300 XG a cuatro grados centígrados. Durante el procesamiento de datos para la clasificación 2D en la clasificación preliminar de partículas, elija la función de clasificación 2D en el software Rely On y haga clic en buscar a la derecha del archivo de estrella de imágenes de entrada en la opción IO.A continuación, elija particles.star. A continuación, en la opción de optimización, establezca el número de clases en 100 y el diámetro de máscara A en 140. En la opción de cálculo, establezca el número de partículas agrupadas en 10 e introduzca el directorio desde una unidad local rápida y rápida en el campo copiar partícula a directorio de borrador.Para un procesamiento más rápido, seleccione sí para la aceleración de GPU utilizada. Para la selección de subconjuntos de buenos resultados 2D como plantillas, vaya a la opción IO de la función de selección de subconjuntos y haga clic en buscar a la derecha de seleccionar clases de model.star. A continuación, elija run_it025_model.Estrella como entrada y haga clic en Ejecutar en la ventana emergente Marque Ordenar imágenes y Ordenar inversamente. Luego haga clic en pantalla. Después de elegir buenos resultados 2D representativos como referencia para referencia de la función de selección automática, haga clic con el botón derecho y seleccione guardar las clases seleccionadas.Para usar la plantilla para la segunda ronda de selección automática, vaya a la opción IO de la función de selección automática. Haga clic en buscar a la derecha de las micrografías de entrada para la selección automática y elija micrographs.star. Luego haga clic en buscar a la derecha de referencias 2D y elija class_averages.star.Además, seleccione no para o use leplossian en de Gaussian. A continuación, realice la extracción de partículas utilizando el sufijo de subrayado de cordón underscore auto pick.star. Realizar clasificación 2D utilizando partículas.estrella, seguido de la selección de subconjuntos usando run subrayado cero 20 five_optimizer. star Para la extracción de partículas, después de hacer clic en Examinar a la derecha del archivo de estrella de micrografía en la opción IO, elija micrografías. Estrella y seleccione Sí para o Re extraer partículas refinadas.Después de hacer clic en examinar a la derecha del archivo de estrella de partículas refinadas, seleccione partículas. estrella para generar un modelo 3D inicial y un mapa de referencia, haga clic en examinar el modelo inicial 3D a la derecha del archivo de estrella de imágenes de entrada en la opción IO y elija el particles.star anterior. Luego, en la opción de optimización, establezca el número de clases en una y el diámetro de máscara A en 140.Para la clasificación 3D y la generación de un mapa 3D preliminar, después de seleccionar partículas. Estrella Como se demostró anteriormente, haga clic en Examinar a la derecha del mapa de referencia y elija el modelo de subrayado inicial punto MRC. A continuación, en la opción de optimización, establezca el número de clases de cuatro a seis y el diámetro de máscara A en 140.Para la generación de máscaras, después de seleccionar un buen mapa 3D como entrada en la opción IO, establezca el umbral de binarización inicial en 0.05 y extienda el mapa binario a esta cantidad de píxeles a tres. A continuación, vaya a la opción de máscara y configúrelo. Agregue borde suave a esta cantidad de píxeles a ocho.Para el siguiente procesamiento, abra el software Trino Spark, cree un nuevo espacio de trabajo y haga clic en el creador de trabajos para el primer trabajo. Para importar la pila de partículas, introduzca la ruta de la partícula en el campo de ruta meta de partículas y la ruta de películas en el campo de ruta de datos de partículas. A continuación, importe volúmenes 3D introduciendo la ruta del mejor volumen 3D generado antes en la ruta de datos del volumen y seleccionando máscara para el tipo de volumen que se importa.Para un refinamiento no uniforme, arrastre las partículas de subrayado importadas generadas previamente como la entrada de partículas de refinamiento no uniformes. Volumen de subrayado importado, subrayado uno como entrada de volumen de refinamientos no uniformes y máscara de subrayado importada subrayado uno como entrada de máscara de refinamientos no uniformes. Máscara. A continuación, haga clic en Q para iniciar el procesamiento y repita el procedimiento para obtener una buena resolución.Mapa 3D de S1PRGI. Después de la construcción del plásmido y la preparación para la transfección transitoria, agregue dos microgramos de ADN preparado en 200 microlitros de tampón de reactivo de transfección. Mezclar por vórtice durante 10 segundos y girar la mezcla brevemente antes de usar.Agregue cuatro microlitros de reactivo de transfección y mézclelo con vórtice y giro como se demostró anteriormente. Después de incubar el tubo a temperatura ambiente durante 15 minutos, deje caer lentamente 200 microlitros de la mezcla de transfección en cada pocillo de una placa de seis pocillos que contenga células CHOK one y agite suavemente la placa o mezcle bien. Después de cuatro a seis horas de incubación, reemplace el medio de transfección con el medio de crecimiento celular que consiste en medio F 12 y 10% fbs antes de devolver la placa a la incubadora.24 a 48 horas después de la recolección de la transección de las células, suspender las células en tres mililitros de un tampón SA con sal de potasio D luciferino. Luego, usando una pipeta multicanal, agregue 90 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos mezclada suavemente e incube a temperatura ambiente durante 40 minutos. Para la determinación de la señal de fluorescencia, primero, prepare 10 soluciones madre milimolares de siponimod en D M S O.Luego haga una dilución en serie en tampón H B S S que contiene 25 micromolares de forscalina y estimule las células con 10 microlitros de varias concentraciones de esta solución agonista durante 30 minutos.A continuación, cuente la señal de luminiscencia en un lector de microplacas seleccionando luminiscencia para el método de detección. Endpoint para tipo de lectura y fibra de luminiscencia para tipo óptico en el software asociado. Además, establezca la ganancia óptica en 255.A continuación, importe los valores de señal de fluorescencia obtenidos en un programa de hoja de cálculo y procese los datos utilizando la función de respuesta a la dosis de ajuste de la curva de regresión no lineal. El complejo GI S1PRS pudo purificarse con éxito mediante cromatografía de exclusión de tamaño, que fue verificada por la página SDS. Además, el protocolo de microscopía electrónica seguido en este estudio fue eficaz para diferenciar entre partículas S1PRSGI con clases 2D claras y bien definidas y partículas de mala calidad.Además, se podría generar un mapa de microscopía electrónica de S1PR3 GI con una buena resolución mediante la correlación de la cáscara del peletero a través del refinamiento no uniforme. Después del análisis estructural, se realizaron ensayos funcionales para S one P R tres mediante transfección de células C H O K ONE con plásmidos receptores y sensores, lo que reveló que la relación plásmido receptor a plásmido sensor de uno a tres produce resultados óptimos. Sin embargo, los resultados fueron menos realistas en 2 93 células En ese procesamiento, la elección de algoritmos en la sección de partículas y la sección de clasificación 2D y 3D es importante para resolver los complejos de proteínas MPS G, especialmente para modelar las fugas y ecfs.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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