Name: Una inyección de dos puntos establecida de manera estable de modelo de desmielinización focal inducida por lisofosfatidilcolina en ratones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Aprende a establecer un modelo de desmielinización focal en ratones mediante inyección de lisofosfatidilcolina usando marco estereotáxico. Este protocolo permite estudiar mecanismos de enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvenciones: 82071380, 81873743).

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité del Instituto de Cuidado Animal del Colegio Médico Tongji, Universidad de Ciencia y Tecnología de Huazhong, China. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos y hembras adultos C57BL/6 (tipo salvaje, WT; 20-25 g; 8-10 semanas de edad). Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de Materiales). Los ratones fueron alojados en una instalación animal específica libre de patógenos (SPF) con agua y alimentos suministrados ad libitum. Se mantuvieron en un período alterno de 12 h de ciclo de luz y oscuridad en las condiciones estándar de temperatura de 22 ° C y humedad relativa de 55% -60%.
1. Preparación de la solución de LPC
<ol><li>Disolver 25 mg de polvo de LPC (ver Tabla de Materiales) con 250 μL de cloroformo y solución mixta de metanol (1:1) para hacer una solución de LPC al 10% y transferirla a un tubo de centrífuga de 500 μL. NOTA: Si el LPC no está completamente disuelto, coloque el tubo de la centrífuga en un limpiador ultrasónico y ultrasonice a 40 kHz durante ~ 1 h para obtener una solución uniforme.</li>
	<li>Divida la solución en 3 μL/tubo y guárdela a -80 °C. NOTA: La solución se puede almacenar durante ~ 2 años.</li>
	<li>Antes de la cirugía, diluya la solución (paso 1.2.) con 27 μL de solución de NaCl al 0,9% y mantenga la solución en un baño de agua a temperatura constante a 37 °C. NOTA: Prepare la solución justo antes de comenzar la inyección.</li>
</ol>2. Preparación quirúrgica
<ol><li>Use una aguja de 32 G, 2 pulgadas para conectarla a una jeringa de 5 μL (consulte la Tabla de materiales). Asegúrese de que la jeringa de microlitro no esté obstruida. Retire 5 μL de solución de LPC para la preparación de la inyección.</li>
	<li>Anestesiar al ratón en una cámara de inducción conectada a un vaporizador de isoflurano con 3% de isoflurano mezclado con 100% de oxígeno a una velocidad de aproximadamente 0,3 L/min.</li>
	<li>Confirme la profundidad de la anestesia por la falta de reflejo de pellizco en el dedo del pie mientras la respiración es suave.</li>
	<li>Afeitar la cabeza del ratón entre las orejas con una afeitadora eléctrica. Aplique gotas lubricantes para los ojos para prevenir la sequedad corneal durante el procedimiento.</li>
	<li>Luego, coloque el mouse en un marco estereotáxico (consulte la Tabla de materiales) con el lado dorsal hacia arriba y asegure la cabeza con un cono nasal y una pinza dental. Mantenga la anestesia con 1.2% -1.6% de isoflurano a través de su nariz. NOTA: La concentración de isoflurano se puede ajustar de acuerdo con el estado respiratorio de los ratones.</li>
</ol>3. Procedimiento quirúrgico
NOTA: Los animales se colocan en una almohadilla térmica durante todos los procedimientos.
<ol><li>Fije el ratón al aparato estereotáxico con barras auriculares bilaterales. Asegúrese de que las barras para los oídos estén niveladas y que la cabeza esté horizontal y estable.</li>
	<li>Desinfecte la piel de la cabeza limpiándola varias veces con yodóforo seguido de alcohol en movimiento circular. Luego use un bisturí para cortar una pequeña incisión de aproximadamente 1,5 cm a lo largo de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo.</li>
	<li>Limpie el cráneo con un hisopo de algodón sumergido en peróxido de hidrógeno al 1% hasta que la bregma, la lambda y la fontanela posterior queden expuestas. Coloque la jeringa en el aparato estereotáxico. NOTA: Use peróxido de hidrógeno con cuidado y evite tocar los tejidos circundantes.</li>
	<li>Asegurar el posicionamiento horizontal de la cabeza del animal (tanto delantera como trasera e izquierda y derecha).<ol><li>Ajuste la perilla del eje Z del marco estereotáxico para que la punta de la aguja y el cráneo se toquen sin doblarse, luego mida la coordenada del eje Z. Compruebe las coordenadas Z de bregma y fontanela posterior.</li>
		<li>Ajuste la barra de la oreja para que la diferencia entre las coordenadas Z de bregma y fontanela posterior no sea más de 0,02 mm. Luego, siga el mismo método para medir las coordenadas Z de las posiciones correspondientes en los lados izquierdo y derecho de la línea media. Ajuste la barra del oído para asegurarse de que la izquierda y la derecha estén al mismo nivel.</li>
	</ol></li>
	<li>Localice el cuerpo calloso. Establezca el origen XYZ en bregma. NOTA: El primer sitio de inyección es de 1,0 mm lateral al bregma, 2,4 mm de profundidad y 1,1 mm anterior. El segundo sitio de inyección es de 1,0 mm lateral al bregma, 2,1 mm de profundidad y 0,6 mm anterior. Por ejemplo, la coordenada del bregma es (0,0,0). Mida la coordenada Z de la ubicación correspondiente marcada como (-1, 1.1, X) y (-1, 0.6, Y). Se puede determinar que la coordenada del primer sitio de inyección del cuerpo calloso es (-1, 1.1, −[X + 2.4]), y el segundo sitio de inyección es (-1, 0.6, −[Y + 2.1]).</li>
	<li>Una vez que se determine el sitio de inyección, haga una marca con un marcador estéril en el cráneo y registre las coordenadas.</li>
	<li>Perfore suavemente el sitio marcado con un taladro de cráneo (consulte la Tabla de materiales). Tenga cuidado de evitar cualquier sangrado.</li>
	<li>Mueva lentamente la aguja a las coordenadas dadas y comience la inyección. Para inducir la desmielinización del cuerpo calloso, inyecte 2 μL de solución de LPC (paso 1.) en cada sitio de inyección (paso 3.5.) a una velocidad de 0.4 μL/min.</li>
	<li>Después de la inyección, mantenga la aguja en cada sitio durante 10 minutos adicionales. NOTA: Asegúrese de que el intervalo de dos inyecciones no sea superior a 20 min.</li>
	<li>Sutura la piel con una sutura 4-0 y espere a que el animal se despierte dentro de los 10 minutos. Administrar analgésicos postoperatorios de acuerdo con las regulaciones institucionales de cuidado de animales. NOTA: El tiempo recomendado para la eutanasia se puede determinar de acuerdo con el propósito del experimento.</li>
</ol>4. Extracción de muestras para la desmielinización focal
NOTA: Para obtener detalles sobre este paso, consulte el informe publicado anteriormente14.
<ol><li>Disolver el colorante rojo neutro (ver Tabla de Materiales) en una solución al 1% en solución salina tamponada con fosfato (PBS).</li>
	<li>horas antes de sacrificar a los ratones (para más detalles, ver referencia previa10), inyectar 500 μL de colorante rojo neutro al 1% en PBS mediante inyección intraperitoneal para cada ratón.</li>
	<li>Realizar perfusión cardíaca12 con 30 mL de PBS al 0,1% preenfriado a 4 °C.</li>
	<li>Cortar el cerebro en 1 mm con un molde cerebral (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Visualice la lesión teñida de rojo neutro bajo el microscopio y disocie la lesión. NOTA: Retire la mayor cantidad posible de tejido normal circundante para mejorar la precisión del análisis posterior. El tejido de la lesión se puede examinar con RT-PCR, microscopía electrónica y análisis de western blot.</li>
</ol>5. Tinción histológica e inmunofluorescencia
<ol><li>Para la tinción histológica y la inmunofluorescencia12, después de la perfusión cardíaca (paso 4.3.), retire el cerebro10, fije en PFA al 4% durante la noche (a 4 ° C) y deshidrate completamente en sacarosa al 30%.</li>
	<li>Cortar en secciones cerebrales coronales de 20 mm con una cortadora congelada10 a temperatura constante (-20 °C).</li>
	<li>Use las rodajas para la tinción Luxol fast blue (LFB), la inmunofluorescencia y la mancha occidental10.</li>
</ol>

<ol><li>Gaire, B. P., Choi, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+roles+of+lysophospholipid+receptors+in+activation+of+neuroglia+and+their+neuroinflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).</li>
<li>Compston, A., Coles, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis.</a> Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).</li>
<li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
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<li>Villoslada, P., Steinman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+targets+and+therapeutics+for+neuroprotection%2C+remyelination+and+repair+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Investigational+Drugs%22%5BJournal%5D)">New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis.</a> Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).</li>
<li>Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis pathology.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936(2018).</li>
<li>Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remyelination+in+the+CNS%3A+From+biology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Remyelination in the CNS: From biology to therapy.</a> Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).</li>
<li>Gentile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+exercise+in+experimental+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2197(2019).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+microglial+Hv1+channel+is+associated+with+activation+of+autophagic+pathway+and+ROS+production+in+LPC-induced+demyelination+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333(2020).</li>
<li>Luo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+easily+reproducible+model+of+focal+white+matter+demyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination.</a> Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).</li>
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<li>Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+relaxation+characteristics+during+preacute+stage+of+lysophosphatidyl+choline-induced+demyelinating+lesion+in+rat+brain%3A+An+animal+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis.</a> Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).</li>
<li>Baydyuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+evolution+of+CNS+remyelinating+lesion+in+mice+with+neutral+red+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).</li>
<li>Plemel, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination%3A+A+primary+lipid+disrupting+myelinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy.</a> Glia. 66 (2), 327-347 (2018).</li>
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<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
<li>Kassis, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+expression+in+white+matter+oligodendrocytes+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke.</a> Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).</li>
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<li>Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+focal+EAE+model+of+cortical+demyelination%3A+multiple+sclerosis-like+lesions+with+rapid+resolution+of+inflammation+and+extensive+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination.</a> Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+macrophages+in+progressive+multiple+sclerosis%3A+Relationship+to+neurodegeneration+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).</li>
<li>Kutzelnigg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+demyelination+and+diffuse+white+matter+injury+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis.</a> Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).</li>
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<li>Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+encephalomyelitis+accelerates+remyelination+after+lysophosphatidylcholine-induced+demyelination+in+the+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum.</a> Journal of Neuroimmunology. 334, 576995(2019).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La EM, una enfermedad desmielinizante crónica del SNC, es una de las causas más comunes de disfunción neurológica en adultos jóvenes20. Clínicamente, aproximadamente el 60%-80% de los pacientes con EM experimentan el ciclo de recaídas y remisiones antes de desarrollar una EM secundaria-progresiva21,22, y eventualmente conduce a deficiencias acumulativas del movimiento y déficits cognitivos a lo largo del tiempo23. A...

La señalización de lisofosfolípidos mediada por receptores implica diversos procesos fisiológicos de casi todos los sistemas de órganos1. En el sistema nervioso central (SNC), esta señalización juega un papel crítico en las patogenicidades de enfermedades neurológicas autoinmunes como la esclerosis múltiple (EM). La esclerosis múltiple es un trastorno crónico inmunomediado caracterizado por desmielinización patológica y respuesta inflamatoria, causando disfunción neurológica y deterioro cognitivo 2,3. Después de continuas recaídas y remisiones durante la enfermedad temprana, la mayoría de los pacientes eventualmente progresan a la etapa secundaria-progresiva, lo que podría causar daños irreversibles en el cerebro y la discapacidad resultante4. Se cree que el sello patológico del curso secundario-progresivo son las placas desmielinizantes causadas por lesiones inflamatorias5. Los tratamientos existentes para la EM pueden reducir significativamente el riesgo de recaída. Sin embargo, todavía no existe una terapia efectiva para el daño desmielinizante a largo plazo causado por la EMprogresiva 6. Por lo tanto, se requiere un modelo estable y fácilmente reproducible para estudiar terapias preclínicas que se centren en la degeneración de la materia blanca.
La desmielinización y la remielinización son dos procesos patológicos principales en el desarrollo de la esclerosis múltiple. La desmielinización es la pérdida de vaina de mielina alrededor de los axones inducida por la microglía con fenotipos proinflamatorios7, y conduce a una conducción lenta de los impulsos nerviosos y resulta en la pérdida de neuronas y trastornos neurológicos. La remielinización es una respuesta de reparación endógena mediada por oligodendrocitos, donde los trastornos podrían conducir a la neurodegeneración y al deterioro cognitivo8. La respuesta inflamatoria es crucial para todo el proceso, afectando tanto el grado de daño como la reparación de la mielina.
Por lo tanto, un modelo animal estable de desmielinización inflamatoria persistente es significativo para una mayor exploración de estrategias terapéuticas para la EM. Debido a la complejidad de la EM, se han establecido varios tipos de modelos animales para imitar lesiones desmielinizantes in vivo, incluida la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), modelos tóxico-desmielinizantes, cuprizona (CPZ) y lisofosfatidilcolina (LPC)9 . LPC es un lisofosfolípido endógeno asociado con la inflamación, y podría inducir un daño rápido con toxicidad a los lípidos de mielina, lo que lleva a la desmielinización focal. Sobre la base de informes previos einvestigaciones 10,11, se proporciona un protocolo detallado de inyección de dos puntos con algunas modificaciones. Generalmente, el modelo clásico de inyección de LPC de un punto solo produce desmielinización local en el sitio de inyección y a menudo se acompaña de remielinización espontánea12,13. Sin embargo, el modelo LPC de inyección de dos puntos puede demostrar que el LPC puede inducir directamente la desmielinización en el cuerpo calloso del ratón y causar una desmielinización más duradera con poca regeneración de mielina.

<table><tbody><tr><td>L-&alpha;-Lisofosfatidilcolina de yema de huevo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4129-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de calibre 32</td><td>HAMILTON</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l jeringa</td><td>HAMILTON</td><td>80014</td><td></td></tr><tr><td>taladro de cráneo de alta velocidad</td><td>fuerte, corea</td><td>fuerte204</td><td></td></tr><tr><td>taladro</td><td>Hager & Meisinger, Alemania &nbsp;</td><td>REF 500 104 001 001 005</td><td></td></tr><tr><td>Matrx Ventilador de Aneatesia Animal</td><td>MIDMARK</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Instrumento Estereotáxico Portátil para Ratón</td><td>Reward</td><td>68507</td><td></td></tr><tr><td>Micro jeringa</td><td></td><td>Reward KDS LEGATO 130</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>VETEASY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de fosfato</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>LuxoL fast bLue</td><td>Sutura Servicebio</td><td>G1030-100ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>FUSUNPHARMA</td><td>20152021225</td><td></td></tr><tr><td>Molde cerebral</td><td>Reward</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Fijador</td> <td>de microscopio electrónicoServicebio</td><td>G1102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Rojo neutro (C.I. 50040), para microscopía Certistain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.01376</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de proteína básica antimielina&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#AB5864</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GST-P pAb</td><td>MBL</td><td>#311</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Anticuerpo monoclonal (SolA15)</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific</td><td>14-5698-95</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal beta actina</td><td>Proteintech</td><td>66009-1-Ig&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Proteína básica de mielina Anticuerpo policlonal</td><td>Proteintech</td><td>10458-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>OLIG2 Anticuerpo policlonal</td><td>Proteintech</td><td>13999-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp; AffiniPure&nbsp; Burro anti-Conejo&nbsp; IgG (H+L)</td><td>YEASEN</td><td>34206ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34412ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594&nbsp; AffiniPure Burro Anti-Conejo IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34212ES60</td><td></td></tr><tr><td>HRP Cabra Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>abclonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>HRP Cabra Anti-Ratón IgG (H+L)&nbsp;</td><td>abclonal</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>Adulto C57BL/6 ratones machos y hembras</td><td>Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

una inyección de dos puntos establecida de manera estable de modelo de desmielinización focal inducida por lisofosfatidilcolina en ratones

A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

La señalización de lisofosfolípidos mediada por receptores contribuye a la fisiopatología de diversas enfermedades neurológicas, especialmente la esclerosis múltiple (EM). La lisofosfatidilcolina (LPC) es un lisofosfolípido endógeno asociado con la inflamación, y podría inducir un daño rápido con toxicidad a los lípidos de mielina, lo que lleva a la desmielinización focal. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la inyección estereotáctica de LPC de dos puntos que podría causar directamente una desmielinización severa y replicar la lesión experimental de desmielinización de forma rápida y estable en ratones mediante procedimiento quirúrgico. Por lo tanto, este modelo es altamente relevante para las enfermedades de desmielinización, especialmente la EM, y puede contribuir al avance relacionado de la investigación clínicamente relevante. Además, se utilizaron métodos de inmunofluorescencia y tinción azul rápida Luxol para representar el curso temporal de la desmielinización en el cuerpo calloso de ratones inyectados con LPC. Además, se utilizó el método conductual para evaluar la función cognitiva de los ratones después del modelado. En general, la inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico es un método estable y reproducible para generar un modelo de desmielinización en ratones para su posterior estudio.

La inyección de dos puntos del LPC resultó en una desmielinización más duradera LpC conduce principalmente a un daño rápido con toxicidad a la mielina y escisión de la integridad del axón15. El día de la inyección se consideró como el día 0. Los ratones se mantuvieron durante un período de 10-28 días (10 dpi y 28 dpi). La tinción Luxol fast blue (LFB)10 se utilizó para evaluar el área de desmielinización en ratones en estos puntos temporales. En el model...

El presente protocolo describe una inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico para generar un modelo de desmielinización estable y reproducible en ratones.

Una inyección de dos puntos establecida de manera estable de modelo de desmielinización focal inducida por lisofosfatidilcolina en ratones

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). ...

Nuestro modelo es muy relevante para las enfermedades de desmielinización, especialmente la esclerosis múltiple. Y puede contribuir al avance relacionado de la investigación clínicamente relevante. Es un protocolo detallado que podría causar directamente una desmielinización severa de forma rápida y estable en ratones mediante un procedimiento quirúrgico.Al probar esta técnica por primera vez, sea paciente y asegúrese de que las coordenadas sean precisas. Comience conectando una aguja de calibre 32 a una jeringa de 5 microlitros. Extraiga 5 microlitros de solución LPC para la preparación de la inyección.A continuación, confirme la profundidad de la anestesia del ratón por la falta de reflejo de pellizco del dedo del pie mientras la respiración es suave. Coloque el ratón en el marco estereotáxico con el lado dorsal hacia arriba y asegure la cabeza con un cono nasal y una pinza dental. Fije el ratón al aparato estereotáxico con barras auriculares bilaterales.Asegúrese de que las barras para los oídos estén niveladas y que la cabeza esté horizontal y estable. Desinfecte la piel de la cabeza limpiando con yodóforo. Luego use bisturí para cortar una pequeña incisión a aproximadamente 1,5 centímetros a lo largo de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo.Limpie la habilidad con un hisopo de algodón humedecido en peróxido de hidrógeno al 1% hasta que el bregma, lambda y la fontanela posterior estén expuestos. Coloque la jeringa en el aparato estereotáxico. Asegurar la posición horizontal de la cabeza del animal, y localizar el cuerpo calloso.Una vez que se determine el sitio de inyección, registre las coordenadas y haga una marca con un marcador en el cráneo. Perfore suavemente el sitio marcado con un taladro de cráneo. Tenga cuidado de evitar cualquier sangrado.Mueva lentamente la aguja a las coordenadas dadas. Para inducir la desmielinización del cuerpo calloso, inyecte 2 microlitros de solución LPC en cada sitio de inyección a una velocidad de 0,4 microlitros por minuto. Después de la inyección, mantenga la aguja en cada sitio durante 10 minutos adicionales.Finalmente, suture la piel con una sutura 4-0 y espere a que el animal se despierte en 10 minutos. La imagen representativa muestra la detección de las legiones de materia blanca a través de la tinción azul rápida de Luxol. A partir de los resultados, se puede observar una desmielinización estable del cuerpo calloso a los 10 y 28 días después de la inyección.La cuantificación del área de desmielinización en diferentes puntos de tiempo se muestra aquí. A través de la tinción de inmunofluorescencia degradó la proteína básica de mielina, se observó un aumento notable de dMBP en el grupo inyectado LPC a los 10 días después de la inyección, lo que representa la pérdida de mielina en el cuerpo calloso. El análisis de Western blot de la expresión de la proteína básica de mielina, o MBP, mostró una pérdida significativa de MBP después de la inyección de LPC.La beta-actina se utilizó como control de carga para medir la expresión basal. Las imágenes de microscopía electrónica confirman la ultraestructura mielinizada en el cuerpo calloso del grupo simulado y el grupo inyectado LPC. GST-pi es el marcador de la maduración de la diferenciación de la célula precursora de oligodendrocitos, u OPC.Después de 10 días de inyección de LPC, el GST-pi disminuyó en comparación con el grupo simulado. Al mismo tiempo, la capacidad de proliferación de los oligodendrocitos puede reflejarse en la proporción de oligodendrocitos proliferan y las células de linaje de oligodendrocitos totales. La proporción más alta representa una mayor proliferación de oligodendrocitos después de 10 días después de la inyección.Las imágenes representativas muestran la trayectoria de natación de los ratones en cada grupo, en presencia de la plataforma y después de retirar la plataforma. Los resultados sugieren que la memoria espacial de los ratones desmielinizados se ve significativamente afectada en el modelo de inyección LPC de dos puntos. Mientras intenta este procedimiento, asegúrese de que la velocidad de inyección sea precisa y mantenga la aguja en cada sitio durante 10 minutos adicionales.

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Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

El video demuestra la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón mediante la inyección de una combinación de glicoproteínas de oligodendrocitos de mielina y Mycobacterium tuberculosis inactivada. El modelo permite a los investigadores estudiar los mecanismos de la enfermedad y probar intervenciones terapéuticas.

Inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón

Este video muestra el procedimiento de acceder quirúrgicamente al nervio óptico en un animal anestesiado y administrar con precisión lisolecitina para inducir la desmielinización focal, creando condiciones neuropatológicas para estudios posteriores.

Inducción de desmielinización local en el nervio óptico mediante lisolecitina

En este video, se establece un modelo de ratón de esclerosis múltiple utilizando encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Al ratón se le inyecta una emulsión que contiene un péptido neuronal y un adyuvante, lo que desencadena una respuesta inmunitaria que activa las células T autorreactivas. A esto le sigue una inyección de toxina pertussis (PTX) para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica, lo que permite que las células T autorreactivas se infiltren en el cerebro. Esta...

Este vídeo muestra la generación de un modelo de ratón de desmielinización focal utilizando una inyección de lisofosfatidilcolina (LPC) de dos puntos. El cráneo de un ratón anestesiado queda expuesto. Se determinan las coordenadas de inyección y se perfora un orificio para permitir las inyecciones de LPC en los sitios específicos. El LPC induce la desmielinización focal de las neuronas a través de la inflamación, mientras que una inyección de dos puntos garantiza su sostenibilidad.

Establecimiento de un modelo de ratón de desmielinización focal mediante una inyección de lisofosfatidilcolina en dos puntos

Este video muestra el método para inducir la desmielinización en neuronas de la médula espinal de ratón utilizando inyecciones de lisolecitina, seguidas de remielinización a través de la migración y diferenciación de células precursoras de oligodendrocitos. El proceso perjudica y luego restaura gradualmente la transmisión de señales neuronales.

Desmielinización y remielinización de las neuronas de la médula espinal de ratón

Fuente: Wang, X. et. al., Administración de fármacos basada en bombas osmóticas para la investigación de la remielinización in vivo en el sistema nervioso central. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra el método para administrar medicamentos neuroterapéuticos utilizando una bomba osmótica en un modelo de ratón desmielinizado. La liberación controlada del fármaco promueve la remielinización mediante la activación de las células productoras de mielina en el cuerpo calloso.

 Administración de fármacos neuroterapéuticos basados en bomba osmótica en un modelo de ratón desmielinizado

Una nueva preparación ex vivo para obtener imágenes de la médula espinal de ratón. Este protocolo permite la formación de imágenes de dos fotones de las interacciones celulares en vivo a lo largo de la médula espinal.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Las enfermedades desmielinizantes se pueden modelar en animales mediante la aplicación focal de lisolecitina en el SNC. Una sola inyección de lisolecitina en la médula espinal del ratón produce una lesión que se repara espontáneamente con el tiempo. El objetivo es estudiar los factores implicados en la desmielinización y la remielinización, y probar agentes para mejorar la reparación.

Experimental La desmielinización y remielinización de la Médula Espinal murino por inyección Focal de lisolecitina

El protocolo presentado aquí permite la reproducción de una desmielinización generalizada de la materia gris de ambos hemisferios corticales en ratas agouti oscuras macho adultas. El método consiste en la implantación intracerebral de un catéter, la inmunización subclínica contra la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina y la inyección intracerebral de una mezcla de citoquinas proinflamatorias a través del catéter implantado.

Modelo de rata de desmielinización cortical cerebral generalizada inducida por una inyección intracerebral de citoquinas proinflamatorias

La desmielinización tiene lugar en múltiples enfermedades del sistema nervioso central. Es necesaria una técnica confiable de administración de medicamentos in vivo para remielinizar las pruebas de drogas. Este protocolo describe un método basado en bomba osmótica que permite la administración de fármacos a largo plazo directamente en el parénquima cerebral y mejora la biodisponibilidad del fármaco, con una amplia aplicación en la investigación de la remielinización.

Administración de fármacos basada en bomba osmótica para la investigación de la remielinización in vivo en el sistema nervioso central

El presente protocolo describe la inducción de encefalomielitis autoinmune experimental en un modelo de ratón utilizando glicoproteína oligodendrocitos de mielina y monitoreando el proceso de la enfermedad utilizando un sistema de puntuación clínica. Los síntomas experimentales relacionados con la encefalomielitis autoinmune se analizan mediante análisis de tomografía microcomputarizada de fémur de ratón y prueba de campo abierto para evaluar el proceso de la enfermedad de manera integral.

Inducción y diversos indicadores de evaluación de la encefalomielitis autoinmune experimental

Aprende a establecer un modelo de desmielinización focal en ratones mediante inyección de lisofosfatidilcolina usando marco estereotáxico. Este protocolo permite estudiar mecanismos de enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple.

Una inyección de dos puntos establecida de manera estable de modelo de desmielinización focal inducida por lisofosfatidilcolina en ratones (Video) | JoVE Journal

Una inyección de dos puntos establecida de manera estable de modelo de desmielinización focal inducida por lisofosfatidilcolina en ratones

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