Una inyección de dos puntos establecida de manera estable de modelo de desmielinización focal inducida por lisofosfatidilcolina en ratones
11 de mayo de 2022
El presente protocolo describe una inyección de dos puntos de lisofosfatidilcolina a través de un marco estereotáxico para generar un modelo de desmielinización estable y reproducible en ratones.
Nuestro modelo es muy relevante para las enfermedades de desmielinización, especialmente la esclerosis múltiple. Y puede contribuir al avance relacionado de la investigación clínicamente relevante. Es un protocolo detallado que podría causar directamente una desmielinización severa de forma rápida y estable en ratones mediante un procedimiento quirúrgico.
Al probar esta técnica por primera vez, sea paciente y asegúrese de que las coordenadas sean precisas. Comience conectando una aguja de calibre 32 a una jeringa de 5 microlitros. Extraiga 5 microlitros de solución LPC para la preparación de la inyección.
A continuación, confirme la profundidad de la anestesia del ratón por la falta de reflejo de pellizco del dedo del pie mientras la respiración es suave. Coloque el ratón en el marco estereotáxico con el lado dorsal hacia arriba y asegure la cabeza con un cono nasal y una pinza dental. Fije el ratón al aparato estereotáxico con barras auriculares bilaterales.
Asegúrese de que las barras para los oídos estén niveladas y que la cabeza esté horizontal y estable. Desinfecte la piel de la cabeza limpiando con yodóforo. Luego use bisturí para cortar una pequeña incisión a aproximadamente 1,5 centímetros a lo largo de la línea media del cuero cabelludo para exponer el cráneo.
Limpie la habilidad con un hisopo de algodón humedecido en peróxido de hidrógeno al 1% hasta que el bregma, lambda y la fontanela posterior estén expuestos. Coloque la jeringa en el aparato estereotáxico. Asegurar la posición horizontal de la cabeza del animal, y localizar el cuerpo calloso.
Una vez que se determine el sitio de inyección, registre las coordenadas y haga una marca con un marcador en el cráneo. Perfore suavemente el sitio marcado con un taladro de cráneo. Tenga cuidado de evitar cualquier sangrado.
Mueva lentamente la aguja a las coordenadas dadas. Para inducir la desmielinización del cuerpo calloso, inyecte 2 microlitros de solución LPC en cada sitio de inyección a una velocidad de 0,4 microlitros por minuto. Después de la inyección, mantenga la aguja en cada sitio durante 10 minutos adicionales.
Finalmente, suture la piel con una sutura 4-0 y espere a que el animal se despierte en 10 minutos. La imagen representativa muestra la detección de las legiones de materia blanca a través de la tinción azul rápida de Luxol. A partir de los resultados, se puede observar una desmielinización estable del cuerpo calloso a los 10 y 28 días después de la inyección.
La cuantificación del área de desmielinización en diferentes puntos de tiempo se muestra aquí. A través de la tinción de inmunofluorescencia degradó la proteína básica de mielina, se observó un aumento notable de dMBP en el grupo inyectado LPC a los 10 días después de la inyección, lo que representa la pérdida de mielina en el cuerpo calloso. El análisis de Western blot de la expresión de la proteína básica de mielina, o MBP, mostró una pérdida significativa de MBP después de la inyección de LPC.
La beta-actina se utilizó como control de carga para medir la expresión basal. Las imágenes de microscopía electrónica confirman la ultraestructura mielinizada en el cuerpo calloso del grupo simulado y el grupo inyectado LPC. GST-pi es el marcador de la maduración de la diferenciación de la célula precursora de oligodendrocitos, u OPC.
Después de 10 días de inyección de LPC, el GST-pi disminuyó en comparación con el grupo simulado. Al mismo tiempo, la capacidad de proliferación de los oligodendrocitos puede reflejarse en la proporción de oligodendrocitos proliferan y las células de linaje de oligodendrocitos totales. La proporción más alta representa una mayor proliferación de oligodendrocitos después de 10 días después de la inyección.
Las imágenes representativas muestran la trayectoria de natación de los ratones en cada grupo, en presencia de la plataforma y después de retirar la plataforma. Los resultados sugieren que la memoria espacial de los ratones desmielinizados se ve significativamente afectada en el modelo de inyección LPC de dos puntos. Mientras intenta este procedimiento, asegúrese de que la velocidad de inyección sea precisa y mantenga la aguja en cada sitio durante 10 minutos adicionales.
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Descripción general
Este protocolo describe una inyección en dos puntos de lisofosfatidilcolina (LPC) mediante un marco estereotáxico para crear un modelo estable de desmielinización en ratones. Proporciona un método relevante para el estudio de enfermedades desmielinizantes, particularmente la esclerosis múltiple, permitiendo investigar los mecanismos y las implicaciones de la desmielinización.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Investigación sobre desmielinización
- Modelos murinos de enfermedad
Antecedentes
- Comprender la desmielinización es fundamental para desarrollar tratamientos para enfermedades como la esclerosis múltiple.
- El procedimiento descrito tiene como objetivo inducir una desmielinización rápida y reproducible en entornos de laboratorio.
- La técnica quirúrgica precisa es importante para el éxito del procedimiento.
- Los análisis histológicos, como la tinción con azul rápido de Luxol, se utilizan para evaluar el modelo.
Objetivo del estudio
- Establecer un modelo confiable para estudiar los mecanismos de desmielinización.
- Facilitar la investigación sobre posibles intervenciones terapéuticas para las afecciones relacionadas con la desmielinización.
- Proporcionar protocolos quirúrgicos detallados que produzcan resultados cuantificables.
Métodos Utilizados
- El modelo implica un abordaje quirúrgico estereotáxico para inyecciones de LPC.
- Los ratones son inyectados con solución de LPC en ubicaciones anatómicas precisas, dirigiendo específicamente al cuerpo calloso.
- Cada inyección implica 2 microlitros de LPC administrados a una velocidad controlada.
- Las evaluaciones postoperatorias a los 10 y 28 días proporcionan mediciones clave de los resultados.
- Se emplean técnicas histológicas como inmunofluorescencia y Western blot para analizar la pérdida de mielina.
Resultados Principales
- Se logró una desmielinización estable en el cuerpo calloso, observable mediante tinción histológica en múltiples puntos temporales.
- Se confirmó un aumento en los marcadores indicativos de pérdida de mielina mediante diversos análisis.
- Las evaluaciones conductuales indicaron deterioros significativos en la memoria espacial tras la desmielinización.
- Los resultados sugieren alteraciones en la proliferación y diferenciación de oligodendrocitos en respuesta al tratamiento con LPC.
Conclusiones
- Este estudio establece con éxito un modelo para explorar la dinámica de la desmielinización y posibles estrategias terapéuticas.
- Los hallazgos aportan información sobre los mecanismos neuronales subyacentes a la desmielinización y el papel de los oligodendrocitos.
- Este modelo podría avanzar en la comprensión de la esclerosis múltiple y enfermedades similares.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El modelo establecido de forma estable de inyección de LPC en dos puntos permite la inducción rápida y reproducible de desmielinización focal en ratones, apoyando directamente la investigación en fase de descubrimiento de enfermedades desmielinizantes como la esclerosis múltiple. Este modelo proporciona una plataforma robusta para la desactivación mecanicista, la validación de objetivos y la evaluación cuantitativa de la pérdida y reparación de mielina. Su reproducibilidad y sus resultados cuantitativos lo sitúan como una herramienta fundamental para la evaluación preclínica y la selección de carteras en las líneas de investigación de enfermedades neuroinflamatorias.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar los mecanismos de desmielinización y la participación de vías en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Apoya la validación funcional de objetivos mediante la cuantificación de la pérdida de mielina y las respuestas de los oligodendrocitos.
- Facilita la confianza predictiva en la prueba de hipótesis terapéuticas para condiciones neuroinflamatorias.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Proporciona un sistema in vivo validado para la selección de compuestos posteriores dirigidos a la remielinización o neuroprotección.
- Ofrece una desmielinización estandarizada y reproducible, adecuada para ensayos histológicos y conductuales cuantitativos.
- Permite la evaluación confiable de intervenciones candidatas con puntos finales medibles.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Se alinea con la patología relevante para la enfermedad observada en la esclerosis múltiple, lo que apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales.
- Asegura la continuidad desde el descubrimiento mecanicista hasta la validación preclínica de estrategias terapéuticas.
- Reduce el riesgo biológico mediante la modelización de la desmielinización aguda y el deterioro funcional in vivo.
Integración de la Canalización y Flujo de Trabajo
Este modelo se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la fase preclínica, conectando estudios mecanicistas iniciales con la investigación traslacional en enfermedades desmielinizantes.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante el análisis cuantificable de la desmielinización y de los oligodendrocitos.
- Selección: Proporciona resultados reproducibles y listos para ensayos para la evaluación de compuestos y estudios de respuesta a la dosis.
- Análisis: Permite la medición cuantitativa de la pérdida de mielina, la expresión de proteínas y los déficits conductuales para análisis comparativos.
- Investigación Traducional: Modela puntos finales relevantes para la enfermedad para la alineación de biomarcadores y la validación preclínica.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma estandarizada y reutilizable in vivo para múltiples programas de investigación en neuroinflamación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de la desmielinización.
- Valor operativo: Proporciona modelos estandarizados, reproducibles y escalables in vivo para uso transversal entre programas.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos preclínicos sólidos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos para enfermedades neuroinflamatorias.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cirugía estereotáxica y en la localización anatómica precisa en ratones.
- Exige acceso a infraestructura para análisis histológicos, de inmunofluorescencia y conductuales.
- Necesita la estandarización entre equipos de las coordenadas y la velocidad de inyección para garantizar la reproducibilidad.
- La adaptación a otras regiones del sistema nervioso central o a modelos de enfermedad puede requerir la optimización del protocolo.
- El modelo refleja principalmente la desmielinización aguda; los estudios sobre desmielinización crónica o remielinización pueden necesitar validación adicional.
