Name: Uso de la bisección para reducir el ADN mitocondrial en el ovocito bovino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprende a reducir el ADN mitocondrial en ovocitos bovinos mediante centrifugación y bisección. Este protocolo logra una disminución superior al 90%, mejorando la viabilidad de embriones clonados.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores desean agradecer a sus colegas de la Universidad Estatal de Utah, a los investigadores de Ciencias Reproductivas del Zoológico de San Diego y a la Dra. Rebecca Krisher de Genus PLC.

El siguiente protocolo sigue las pautas de cuidado y ética animal proporcionadas por la Universidad Estatal de Utah.
1. Preparación de los medios
<ol><li>Antes de la manipulación de ovocitos, prepare las siguientes soluciones, como se describe en la Tabla 1: 400 μL de solución de hialuronidasa, 500 μL de medios T2, 1.020 μL de medios T20 y 800 μL de medios T10.</li>
	<li>Divida el medio T10 en dos pocillos de una placa de cuatro pocillos, 400 μL por pozo. Etiquete uno bien con "M" y el segundo pozo con "MR". Coloque en una incubadora de CO2 al 5% hasta después de la bisección.</li>
	<li>Preparar 500 μL de citocalasina B (CB)/líquido oviductal sintético con HEPES (HSOF). Alícuota 50 μL de solución cb/HSOF en un tubo de centrífuga separado de 1,5 ml.</li>
	<li>Preparar 40 μL de solución de pronasa. Centrífuga durante al menos 30 s a 2.680 x g. Mezclar 20 μL del sobrenadante con 20 μL de T2 en un nuevo tubo de centrífuga; esto forma una solución diluida de 5 mg/ml de pronasa.</li>
	<li>Preparar 3 ml de HSOF. En una placa de búsqueda, deposite por separado cuatro gotas de 400 μL; coloque esta placa debajo de un estereomicroscopio.</li>
	<li>Preparar 500 μL de solución CB/T20.</li>
</ol>2. Maduración in vitro (IVM) de ovocitos bovinos
<ol><li>IVM: Cultivo de complejos cúmulos-ovocitos (AOC) aspirados a 38,5 °C en una incubadora de CO2 al 5% durante 21 h en un plato de cuatro pocillos de medios de maduración que contiene 10% de FBS, 0,26 UI/ml de FSH y 100 U/ml de penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Realice los siguientes pasos para desnudar los ovocitos.<ol>
<li>Recoja el número deseado de AOC utilizando una pipeta de 200 μL y deposite en la parte inferior de un tubo de centrífuga de 1,5 μL.</li>
		<li>Añadir el mismo volumen de 0,6 mg/ml de hialuronidasa al tubo centrífugo con los ovocitos (es decir, si el volumen de ovocitos y medios de IVM es de 100 μL, añadir 100 μL de hialuronidasa).</li>
		<li>Pipetear la solución hacia arriba y hacia abajo sin crear burbujas, hasta que se hayan eliminado todas las células del cúmulo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Comprobar la maduración de los ovocitos.<ol>
<li>Use la pipeta para agregar 200 μL de HSOF de una de las cuatro gotas de HSOF en la placa de búsqueda a la solución de ovocitos/hialuronidasa.</li>
		<li>Transfiera los ovocitos de la gota de hialuronidasa/HSOF y colóquelos en 400 μL de gota de HSOF no utilizada. Lávelos con dos gotas adicionales de HSOF para ayudar a eliminar la hialuronidasa y los restos de células cúmulos.</li>
		<li>Usando una pipeta bucal (o una pipeta y punta de 10 μL) y un alto aumento microscópico, enrolle y seleccione los ovocitos en función de la presencia del cuerpo polar.</li>
		<li>Después de clasificar los ovocitos, recoja el número deseado de ovocitos MII a dividir y colóquelos en 400 μL de gota HSOF. NOTA: Si los ovocitos han estado fuera de la incubadora durante más de 30 minutos, los ovocitos pueden colocarse de nuevo en un pozo de medios de maduración y colocarse en una incubadora controlada con CO2 para descansar durante al menos 30 minutos. Limite el número de ovocitos a dividir a una cantidad que sea factible terminar de dividir en aproximadamente 30 minutos para minimizar el tiempo fuera de la incubación. Si los ooplastos se van a fusionar con una célula somática, activarse y cultivarse como embriones, los ovocitos deben enuclearse en este momento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Centrifugación de los ovocitos
NOTA: Si los ovocitos se colocaron en la incubadora en medios de maduración, muévalos a la gota HSOF de la que se recolectaron más recientemente.
<ol><li>Usando una pipeta bucal, recoja los ovocitos maduros seleccionados de la gota HSOF y colóquelos en el tubo de 1,5 ml que contiene 50 μL de la solución HSOF/CB. Centrifugar los ovocitos a 15.000 x g durante 12 min. NOTA: No es perjudicial que las burbujas estén presentes en el tubo de la centrífuga.</li>
	<li>Mientras se centrifugan los ovocitos, prepara la placa de bisección.<ol>
<li>Haga el patrón como se muestra en la Figura 1 en la tapa de una placa de Petri de 60 mm (20 μL por gota) y cubra completamente las gotas con aceite mineral.</li>
		<li>Usando un marcador de punta delgada, marque las líneas debajo del plato, como se muestra en la Figura 2.<ol>
<li>Dibuja una caja alrededor de la gota de pronasa y una línea entre las gotas CB/T20 y la fila inferior de gotas T20.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cubra el plato con una tapa opaca hasta que se complete la centrifugación para evitar cambios de osmolaridad de las microgotas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tan pronto como se complete la centrifugación, use una pipeta de 200 μL para recolectar los ovocitos dentro de la solución y muévalos a una porción vacía de una nueva placa de búsqueda con cuatro gotas de HSOF de 400 μL.</li>
	<li>Recoger y lavar los ovocitos a través de las cuatro gotas de HSOF.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64060/64060fig01.jpg"> Figura 1: Placa de bisección. Todas las gotas mostradas tienen un volumen de 20 μL. La placa tiene un diámetro de 60 mm. Las gotas han sido completamente cubiertas con aceite mineral. Los ovocitos se colocarán primero en la gota T2 superior e izquierda (indicada aquí con una estrella). PRO/T2: 10 μL de pronasa y 10 μL de T2, combinados antes de crear microgotas. CB/T20: 1 μL de citocalasina B por 1 mL de T20, combinado antes de crear microgotas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64060/64060fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64060/64060fig02.jpg"> Figura 2: Placa de bisección marcada. Las líneas se dibujan con un marcador de punta delgada en la parte inferior de la placa, para proporcionar referencias de ubicación para observaciones y transferencias de ovocitos y ooplastos realizadas debajo del microscopio. Los ovocitos se colocarán primero en la gota T2 superior e izquierda (indicada aquí con una estrella). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64060/64060fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
4. Preparación del ovocito para la bisección
NOTA: El siguiente proceso implica la preparación de los ovocitos para la bisección.
<ol><li>Encienda la etapa de calentamiento a 37 °C.</li>
	<li>Use una pipeta bucal para mover los ovocitos centrifugados de la gota HSOF a la gota T2 superior izquierda de la placa de bisección, luego lave los ovocitos a través de las siguientes tres gotas en la fila superior (T2, T20, T20).</li>
	<li>Deposite los ovocitos en una de las gotas de pronasa, asegurando que haya poco o ningún contacto entre ellos. NOTA: La eliminación de la zona pelúcida puede tomar cantidades variables de tiempo, pero generalmente ocurre entre 30-120 s con el uso de una etapa de calentamiento. La ausencia de una etapa de calentamiento se extenderá este tiempo.</li>
	<li>Observar los ovocitos hasta que haya una deformación clara de la zonae pellucidae (ver Figura 3).</li>
	<li>Una vez que una sola zona pelúcida de ovocitos se ha deformado, mueva ese ovocito a la vecina gota T2. Repita a medida que los ovocitos adicionales se deformen, hasta que todos los ovocitos se hayan eliminado de la pronasa y se hayan colocado en la gota T2.</li>
	<li>Observe los ovocitos hasta que solo quede una capa delgada de la zona pelúcida.</li>
	<li>Lave los ovocitos a través de las siguientes tres gotas dentro de la fila (T2, T20, T20), luego deposite en líneas verticales dentro de las gotas CB / T20 (ver Figura 4).<ol>
<li>Comience con menos ovocitos en las líneas verticales y aumente el número de ovocitos por gota a medida que progresan las habilidades de bisección.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64060/64060fig03.jpg"> Figura 3: Eliminación de la zona pelúcida usando pronasa. (80x) Una zona pelúcida de ovocitos comenzará a aparecer deformada cuando la pronasa haya afectado a la zona pelúcida lo suficiente como para que el ovocito se mueva a la gota T2 adyacente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64060/64060fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64060/64060fig04.jpg"> Figura 4: Orientación de los ovocitos en gotas de bisección. (80x) Los ovocitos libres de zona se depositan en una orientación casi vertical dentro de cada gota CB/T20 antes de la bisección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64060/64060fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
5. Bisección de los ovocitos
<ol><li>Concéntrese en la primera gota DE CB/T20 (bisección) más a la izquierda que contiene ovocitos, y use una pipeta bucal para rotar los ovocitos, de modo que la porción densa en mitocondrias de cada ovocito esté orientada hacia o lejos del brazo del microscopio. NOTA: La porción densa en mitocondrias no contendrá lípidos, que aparecen como la porción más oscura del ovocito después de la centrifugación.</li>
	<li>Coloque la punta de la microcuchilla a la izquierda del ovocito superior, en línea con el espacio directamente sobre la porción densa en mitocondrias. Manteniendo la punta de la cuchilla en el mismo lugar, baje cuidadosamente la cuchilla para cortar todo el camino a través del ovocito.<ol>
<li>Asegúrese de que el ooplasto denso en mitocondrias y el ooplasto reducido en mitocondrias sean similares en tamaño; la bisección debe cortar cada ovocito por la mitad para producir dos ooplastos. NOTA: Los tamaños comparativos de los ooplastos producidos a partir de un solo ovocito pueden variar según los objetivos de la investigación; si los ooplastos reducidos en mitocondrias se van a fusionar con una célula somática, su volumen debe ser mayor que el de los ooplastos densos en mitocondrias».</li>
		<li>Asegúrese de que la cuchilla esté dividiendo el ovocito por encima de la porción densa en mitocondrias y por debajo de la porción densa en lípidos, en el segmento más claro del ovocito centrifugado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Al levantar la cuchilla, asegúrese de que se mantenga la misma línea y que la punta de la cuchilla permanezca en el mismo lugar, luego levante suavemente la punta de la placa.</li>
	<li>Repita los pasos de bisección para todos los ovocitos dentro de la primera gota de bisección. Si los ovocitos están presentes en gotas adicionales, oriente y bisecle los ovocitos restantes.</li>
	<li>Usando una pipeta bucal, recolecte ooplastos reducidos en mitocondrias de la primera gota de bisección. Colóquelos en la gota T20 de la mano izquierda ubicada en la fila inferior de la placa. Repita para todas las gotas de bisección restantes. NOTA: Los ooplastos reducidos en mitocondrias contendrán lípidos, que son de color más oscuro que el resto del ovocito.</li>
	<li>Usando una pipeta bucal, recolecte ooplastos densos en mitocondrias de la primera gota de bisección. Colóquelos en la gota T20 derecha ubicada en la fila inferior de la placa. Repita para todas las gotas de bisección restantes. NOTA: Las regiones densas en mitocondrias tendrán un conglomerado visible de orgánulos que será de color gris claro en apariencia.</li>
	<li>Recupere el plato de cuatro pocillos T10 de la incubadora. Usando una pipeta bucal, mueva todos los ooplastos reducidos en mitocondrias a la "RM" bien etiquetada y mueva los ooplastos densos en mitocondrias a la bien etiquetada "M".</li>
	<li>Vuelva a colocar la placa de cuatro pocillos en la incubadora controlada por CO2. Permita que los ooplastos descansen durante al menos 30 minutos antes de la cuantificación del ADNmt.</li>
</ol>6. Cuantificación del ADNmt
<ol><li>Utilice un kit de extracción de ADN diseñado para extraer material de una pequeña muestra para extraer ADN de muestras individuales (ovocitos individuales, ooplastos densos en mitocondrias individuales, ooplastos agotados de mitocondrias individuales).</li>
	<li>Utilice un método de cuantificación de ADN de la elección para asegurarse de que el ADN se extrajo con éxito de cada muestra. Si la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) no se completa en ese momento, congele el ADN extraído en un tubo marcado en un congelador de -80 °C.</li>
	<li>Realizar qPCR<ol>
<li>Consulte la Tabla 2 para determinar el volumen de cada reactivo que se agregará a cada tubo de qPCR, junto con las secuencias de imprimación. Estos cebadores están diseñados para amplificar la región 12S del ADNmt bovino.</li>
		<li>Establezca el tiempo de desnaturalización inicial durante 10 min, seguido de 35 ciclos de: 30 s de desnaturalización a 94 °C, 15 s de recocido a 60 °C y 15 s de extensión a 72 °C. Cuando se complete la reacción, registre los valores del umbral de ciclo (Ct). NOTA: Para obtener valores relativos de número de copia de ADNmt, se debe producir una curva estándar utilizando muestras con cantidades conocidas de números de copia de ADNmt, que aumentan exponencialmente. Los valores umbral del ciclo deben manipularse utilizando las siguientes fórmulas para determinar los números de copia relativos del ADNmt.</li>
		<li>Obtenga la concentración del ADN utilizando la siguiente ecuación: Concentración de ADN = (10(Ct-intercept/slope)) x volumen probado</li>
		<li>Obtenga el número de copia utilizando la siguiente ecuación: Número de copia = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/64060/64060eq01.jpg" style="margin: auto;">
</li>
		<li>Obtenga el número de copia utilizando la siguiente ecuación: Número de copia por celda = 2 x <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/64060/64060eq02.jpg" style="margin: auto;">
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64060/64060fig05.jpg"> Figura 5: Curva estándar de ADNmt de células somáticas. Esta curva estándar se creó a través de la cuantificación del ADNmt de las concentraciones logarítmicas de células somáticas bovinas utilizando los reactivos y el programa qPCR como se describe en el paso 6.3 del protocolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64060/64060fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<ol><li>Loi, P., Modlinski, J. A., Ptak, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer%3A+A+salvage+tool+seeking+first+aid%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Interspecies somatic cell nuclear transfer: A salvage tool seeking first aid.</a> Theriogenology. 76 (2), 217-228 (2011).</li>
<li>Wani, N. A., Vettical, B. S., Hong, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+cloned+Bactrian+camel+%28camelus+bactrianus%29+calf+produced+by+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer%3A+A+step+towards+preserving+the+critically+endangered+wild+Bactrian+camels%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">First cloned Bactrian camel (camelus bactrianus) calf produced by interspecies somatic cell nuclear transfer: A step towards preserving the critically endangered wild Bactrian camels.</a> PLOS ONE. 12 (5), 0177800(2017).</li>
<li>Oh, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+endangered+gray+wolves+%28canis+lupus%29+from+somatic+cells+collected+postmortem%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cloning endangered gray wolves (canis lupus) from somatic cells collected postmortem.</a> Theriogenology. 70 (4), 638-647 (2008).</li>
<li>Srirattana, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+gaur-bovine+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer+embryos%3A+Effect+of+trichostatin+a+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Full-term development of gaur-bovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos: Effect of trichostatin a treatment.</a> Cellular Reprogramming. 14 (3), 248-257 (2012).</li>
<li>Kwon, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blastocysts+derived+from+adult+fibroblasts+of+a+rhesus+monkey+%28macaca+mulatta%29+using+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">Blastocysts derived from adult fibroblasts of a rhesus monkey (macaca mulatta) using interspecies somatic cell nuclear transfer.</a> Zygote. 19 (3), 199-204 (2011).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+cloned+sei+whale+%28Balaenoptera+borealis%29+embryos+by+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer+using+enucleated+pig+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Production of cloned sei whale (Balaenoptera borealis) embryos by interspecies somatic cell nuclear transfer using enucleated pig oocytes.</a> Journal of Veterinary Science. 10 (4), 285(2009).</li>
<li>Lorthongpanich, C., Laowtammathron, C., Chan, A. W., Kedutat-Cairns, M., Parnpai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+interspecies+cloned+monkey+embryos+reconstructed+with+bovine+enucleated+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Development of interspecies cloned monkey embryos reconstructed with bovine enucleated oocytes.</a> Journal of Reproduction and Development. 54 (5), 306-313 (2008).</li>
<li>Hong, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+transgenic+canine+embryos+using+interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">Production of transgenic canine embryos using interspecies somatic cell nuclear transfer.</a> Zygote. 20 (1), 67-72 (2011).</li>
<li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy%3A+Implications+for+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: Implications for human health and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li>
<li>Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+transmission+and+confounding+mitochondrial+influences+in+cloned+cattle+and+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA transmission and confounding mitochondrial influences in cloned cattle and pigs.</a> Reproductive Medicine and Biology. 12 (2), 47-55 (2013).</li>
<li>Lanza, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+an+endangered+species+%28Bos+Gaurus%29+using+interspecies+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning%22%5BJournal%5D)">Cloning of an endangered species (Bos Gaurus) using interspecies nuclear transfer.</a> Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).</li>
<li>Evans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+genotypes+in+nuclear+transfer-derived+cloned+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep.</a> Nature Genetics. 23 (1), 90-93 (1999).</li>
<li>Meirelles, F. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+replacement+of+the+mitochondrial+genotype+in+a+Bos+indicus+calf+reconstructed+by+nuclear+transfer+to+a+Bos+taurus+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicus calf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte.</a> Genetics. 158 (1), 351-356 (2001).</li>
<li>Beyhan, Z., Iager, A. E., Cibelli, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+nuclear+transfer%3A+Implications+for+embryonic+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Interspecies nuclear transfer: Implications for embryonic stem cell biology.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 502-512 (2007).</li>
<li>Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer%3A+advancements+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Interspecies somatic cell nuclear transfer: advancements and problems.</a> Cellular Reprogramming. 15 (5), 374-384 (2013).</li>
<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+somatic+cell+nuclear+transfer+is+dependent+on+compatible+mitochondrial+DNA+and+reprogramming+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Interspecies somatic cell nuclear transfer is dependent on compatible mitochondrial DNA and reprogramming factors.</a> PLoS ONE. 6 (4), 14805(2011).</li>
<li>Chiaratti, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+mitochondrial+DNA+depletion+is+reversed+during+early+embryogenesis+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).</li>
<li>Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+mitochondrial+DNA+replication+during+oocyte+maturation+is+essential+for+successful+porcine+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development.</a> Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).</li>
<li>Cagnone, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+normal+embryogenesis+by+mitochondrial+supplementation+in+pig+oocytes+exhibiting+mitochondrial+DNA+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Restoration of normal embryogenesis by mitochondrial supplementation in pig oocytes exhibiting mitochondrial DNA deficiency.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Spikings, E. C., Alderson, J., John, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+mitochondrial+DNA+replication+during+oocyte+maturation+is+essential+for+successful+porcine+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Regulated mitochondrial DNA replication during oocyte maturation is essential for successful porcine embryonic development.</a> Biology of Reproduction. 76 (2), 327-335 (2007).</li>
<li>Ferreira, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+supplementation+with+mitochondria+improve+oocyte+competence%3F+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Does supplementation with mitochondria improve oocyte competence? A systematic review.</a> Reproduction. 161 (3), 269-287 (2021).</li>
<li>Bhat, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+birth+of+a+pashmina+goat+kid+after+transfer+of+handmade+cloned+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Live birth of a pashmina goat kid after transfer of handmade cloned embryos.</a> Journal of Reproduction and Development. , (2019).</li>
<li>Tecirlioglu, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+a+cloned+calf+derived+from+a+vitrified+hand-made+cloned+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%2C+Fertility+and+Development%22%5BJournal%5D)">Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo.</a> Reproduction, Fertility and Development. 15 (7), 361(2003).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handmade+cloned+transgenic+piglets+expressing+the+nematode+fat-1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Handmade cloned transgenic piglets expressing the nematode fat-1 gene.</a> Cellular Reprogramming. 14 (3), 258-266 (2012).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handmade+cloned+transgenic+sheep+rich+in+omega-3+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Handmade cloned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids.</a> PLOS ONE. 8 (2), 55941(2013).</li>
<li>Lagutina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+cell+nuclear+transfer+in+horses%3A+Effect+of+oocyte+morphology%2C+embryo+reconstruction+method+and+donor+cell+type%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Somatic cell nuclear transfer in horses: Effect of oocyte morphology, embryo reconstruction method and donor cell type.</a> Reproduction. 130 (4), 559-567 (2005).</li>
<li>Chiaratti, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+mitochondrial+DNA+depletion+is+reversed+during+early+embryogenesis+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Embryo mitochondrial DNA depletion is reversed during early embryogenesis in cattle.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 76-85 (2010).</li>
<li>Hosseini, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((and+efficient+method+of+manual+oocyte+enucleation+using+a+pulled+pasteur+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology+-+Animal%22%5BJournal%5D)">and efficient method of manual oocyte enucleation using a pulled pasteur pipette.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 49 (8), 569-575 (2013).</li>
<li>Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+proteins+F-actin+and+tubulin+distribution+and+interaction+with+mitochondria+in+the+granulosa+cells+surrounding+stage+III+zebrafish+%28danio+rerio%29+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (danio rerio) oocytes.</a> Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).</li>
<li>International Union for Conservation of Nature. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IUCN+Red+List+of+Threatened+Species%5BTitle%5D)+AND+%22International+Union+for+Conservation+of+Nature%22%5BJournal%5D)">The IUCN Red List of Threatened Species.</a> International Union for Conservation of Nature. , (2021).</li>
<li>Berg, D. K., Li, C., Asher, G., Wells, D. N., Oback, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+deer+cloned+from+antler+stem+cells+and+their+differentiated+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Red deer cloned from antler stem cells and their differentiated progeny.</a> Biology of Reproduction. 77 (3), 384-394 (2007).</li>
<li>Gómez, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+of+African+wildcat+cloned+kittens+born+from+domestic+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+and+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Birth of African wildcat cloned kittens born from domestic cats.</a> Cloning and Stem Cells. 6 (3), 247-258 (2004).</li>
<li>Lanza, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+an+endangered+species+%28Bos+gaurus%29+using+interspecies+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning%22%5BJournal%5D)">Cloning of an endangered species (Bos gaurus) using interspecies nuclear transfer.</a> Cloning. 2 (2), 79-90 (2000).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los métodos utilizados anteriormente para disminuir el número de copias de ADNmt en ovocitos tienen sus respectivas desventajas. La eliminación basada en la micromanipulación de las mitocondrias de los ovocitos disminuye el número de copias de ADNmt en un promedio del 64%27. Un método único, utilizado anteriormente para la enucleación, implica el uso de pipetas Pasteur de pequeño diámetro y la división de un ovocito libre de pellúcidas en el borde entre una microgota de medio y el aceite mineral c...

La transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) incluye la fusión de un ovocito enucleado de un animal y una célula somática de un animal de la misma especie. En la mayoría de los casos, el ovocito y la célula somática se originan en la misma especie, y las tasas de nacidos vivos están por debajo del 6%1. Algunas investigaciones involucran el uso de SCNT entre especies (iSCNT), que incluye la fusión de una célula somática y un ovocito que se originan a partir de dos especies diferentes. En estos estudios, las tasas de nacidos vivos son incluso más bajas que en SCNT, típicamente menos del 1%1. Sin embargo, iSCNT tiene la capacidad de ser utilizado como un método de rescate de especies en peligro de extinción, ya que las células somáticas de estos animales son más accesibles que sus células germinales1. Los ovocitos receptores utilizados en iSCNT son a menudo especies domésticas o comunes de laboratorio, como vacas, cerdos y ratones. Algunos intentos realizados hasta ahora han producido con éxito crías vivas, aunque las crías producidas han sido animales intragenéricos (las especies de ovocitos receptores y las especies de células donantes eran miembros del mismo género)2,3,4. Los modelos intergenéricos (que utilizan un ovocito y una célula somática de animales de diferentes géneros) aún no han producido animales vivos, y la mayoría de los embriones reconstruidos se detienen en la etapa de 8-16 células del desarrollo in vitro 5,6,7,8. Una posible explicación de este paro embrionario del desarrollo es la aparición de heteroplasmia mitocondrial en los embriones, la presencia de más de un tipo de ADN mitocondrial (ADNmt) en una sola célula. La heteroplasmia puede conducir a problemas como la ineficiencia del desarrollo o la falla en el embrión o en el animal vivo1. La patogénesis también puede ocurrir más adelante en la vida del animal9. Aunque este problema también está presente en la descendencia de SCNT, el componente interespecífico dentro de los embriones de iSCNT exacerba el problema.
Cuando el ADNmt embrionario proviene de dos especies diferentes, las mitocondrias de los ovocitos receptores, que representan la mayoría, no funcionan de manera eficiente o efectiva con el núcleo1,10 de la célula donante. Las brechas taxonómicas más grandes entre las dos especies utilizadas en iSCNT probablemente intensifican este problema; Se demostró que la descendencia viva intragenérica producida (descendencia de Bos gaurus y Bos indicus utilizando ovocitos de Bos taurus), así como la descendencia producida a través de SCNT tradicional (por ejemplo, descendencia de Ovis aries que usa ovocitos de Ovis aries) eran quimeras (el ADNmt de dos individuos estaba presente en estos animales 11,12,13). Sin embargo, se desarrollaron mucho más allá de los embriones intergenéricos scnt14,15. El intercambio de información entre las mitocondrias del ovocito y el núcleo de la célula donante podría tener más éxito en el embrión intragenérico que en el embrión intergenérico16.
La cantidad de ADNmt en un ovocito bovino maduro es aproximadamente 100 veces mayor que la cantidad encontrada en una célula somática12. La reducción de esta proporción podría alentar a las mitocondrias de las células somáticas a proliferar dentro del embrión reconstruido, permitiendo que una mayor población de mitocondrias productivas esté presente16. Esto a su vez podría proporcionar más energía para satisfacer los requisitos del embrión en desarrollo15. Los intentos anteriores realizados para reducir el número de copias de ADNmt del ovocito o embrión incluyen la aplicación química, la micromanipulación y la suplementación del ovocito o embrión con mitocondrias adicionales de la especie de célula donante 16,17,18,19,20. Sin embargo, la aplicación química (como la 2',3'-didesoxicitidina) no es ideal para el desarrollo embrionario, y ha reducido el número de copias de ADNmt de ovocitos en aproximadamente la mitad18. La reducción previa del ADNmt de ovocitos por micromanipulación solo ha eliminado un promedio del 64% del ADNmt del ovocito17. Aunque la suplementación de mitocondrias de células donantes podría ser una opción viable, su uso aún no ha producido un animal intergenérico vivo dentro de los estudios iSCNT21.
El uso de la bisección para reducir el número de copias de ADNmt de ovocitos aún no se ha utilizado en los estudios publicados. La bisección de ovocitos con la intención de fusionar los ooplastos con una célula somática es la premisa de la clonación hecha a mano (HMC), que generalmente utiliza la bisección como método para eliminar el cuerpo polar y la placa metafásica del ovocito metafase II (MII). HMC ha producido con éxito descendencia en varias especies, incluyendo cabras, vacas, cerdos, ovejas y caballos 22,23,24,25,26, pero no suele incluir un paso de centrifugación antes de la bisección. La integración de la centrifugación de alta velocidad del ovocito permite el aislamiento de las mitocondrias (y por lo tanto del ADNmt) en un polo del ovocito, que luego se puede dividir en dos utilizando una microcuchilla para eliminar esas fracciones densas en mitocondrias. Dos ooplastos agotados por las mitocondrias se pueden fusionar con una célula somática, como es el caso en HMC, para formar un embrión reconstruido que contiene considerablemente menos ADNmt de la especie de ovocitos.
La pregunta que intentamos responder con este protocolo es cómo reducir el ADNmt en el ovocito bovino para producir un embrión reconstruido viable que contenga menos ADNmt heteroplásmico. En este protocolo, los ovocitos fueron centrifugados y bisectados. Se calcularon los números de copias de ADNmt de ooplastos y ovocitos intactos para determinar la efectividad de esta técnica en la reducción del número de copias de ADNmt del ovocito bovino.

<table><tbody><tr><td>Tubos de centrífuga de 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>5408129</td><td></td></tr><tr><td>plato de 60 mm</td><td>Centrífuga Sigma-Aldrich</td><td>D8054</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>M199 Media</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td>SCILOGEX</td><td>D1008</td><td></td></tr><tr><td>mtDNA Primer: Adelante (12S)</td><td></td><td></td><td>GGGCTACATTCTCTACACCAAG</td></tr><tr><td>mtDNA Primer: Reverso (12S)</td><td></td><td></td><td>GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND2000</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí oftálmico con mango de aluminio</td><td>PFM Medical</td><td>207300633</td><td>Microblade para bisección</td></tr><tr><td>Proteasa/pronasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DNA Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio&trade; 3 - 96 pocillos de 0,2 ml</td><td>ThermoFisher</td><td>A28567</td><td></td></tr><tr><td>Placa de búsqueda</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711A</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green qPCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>K0221</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>master mix Fluido oviductal sintético con HEPES (HSOF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoPlate</td><td>Tokai Hit</td><td>TPi-SMZSSX</td><td>Etapa de calentamiento</td></tr></tbody></table>

uso de la bisección para reducir el adn mitocondrial en el ovocito bovino

Use of Bisection to Reduce Mitochondrial DNA in the Bovine Oocyte

La transferencia nuclear de células somáticas entre especies (iSCNT) se puede utilizar para rescatar especies en peligro de extinción, pero existen dos poblaciones distintas de ADN mitocondrial (ADNmt) dentro del embrión reconstruido: una dentro del ooplasma receptor y otra dentro de la célula somática donante. Esta heteroplasmia mitocondrial puede conducir a problemas de desarrollo en el embrión y el feto. Los protocolos de clonación hechos a mano incluyen la bisección de ovocitos, que se puede utilizar para disminuir el número de copias de ADNmt, reduciendo el grado de heteroplasmia mitocondrial en un embrión reconstruido. La centrifugación de ovocitos bovinos maduros y desnudos produjo una fracción visible densa en mitocondrias en un polo del ovocito. Los ovocitos zonae pellucidae se eliminaron por exposición a una solución de pronasa. La bisección se realizó utilizando una microcuchilla para eliminar la fracción visible de mitocondrias. La qPCR se utilizó para cuantificar el ADNmt presente en muestras de ADN extraídas de ovocitos enteros y ooplastos bisectados, proporcionando una comparación de los números de copias de ADNmt antes y después de la bisección. Los números de copia se calcularon utilizando valores umbral de ciclo, la fórmula de línea de regresión de una curva estándar y una relación que incluía los tamaños respectivos de los productos de PCR de ADNmt y los productos de PCR genómica. Un ovocito bovino tenía un número promedio de copias de ADNmt (desviación estándar ±) de 137.904 ± 94.768 (n = 38). Un ooplasto agotado de mitocondrias tenía un número promedio de copias de ADNmt de 8.442 ± 13.806 (n = 33). Las copias promedio de ADNmt presentes en un ooplasto rico en mitocondrias fueron de 79.390 ± 58.526 copias de ADNmt (n = 28). Las diferencias entre estos promedios calculados indican que la centrifugación y la posterior bisección pueden disminuir significativamente el número de copias de ADNmt presentes en el ooplasto agotado de las mitocondrias en comparación con el ovocito original (P < 0,0001, determinado por ANOVA unidireccional). La reducción del ADNmt debería disminuir el grado de heteroplasmia mitocondrial en un embrión reconstruido, posiblemente fomentando el desarrollo embrionario y fetal estándar. La suplementación con extracto mitocondrial de la célula donante somática también puede ser esencial para lograr un desarrollo embrionario exitoso.

Los resultados cuantitativos de la PCR (qPCR) se utilizan para determinar las cantidades relativas de ADNmt presentes en cada ooplasto. La reacción descrita está diseñada para amplificar la región 12S del ADNmt bovino.
Si la bisección fue exitosa, las muestras de ovocitos enteros y ooplastos densos en mitocondrias tendrán valores similares de Ct . Las muestras de ooplastos reducidos en mitocondrias tendrán valores más altos de Ct en comparación con las muestras de los otr...

Aquí, presentamos un protocolo para reducir significativamente el número de copias de ADN mitocondrial en un ovocito bovino (P < 0,0001). Este método utiliza la centrifugación y la bisección para reducir sustancialmente las mitocondrias de los ovocitos y puede permitir una mayor probabilidad de desarrollo en los embriones de transferencia nuclear de células somáticas entre especies reconstruidos.

Uso de la bisección para reducir el ADN mitocondrial en el ovocito bovino

Interspecies somatic cell nuclear transfer (iSCNT) may be used to rescue endangered species, but two distinct populations of mitochondrial DNA (mtDNA) ...

El protocolo reduce significativamente el número de copias de ADN mitocondrial en el ovocito. Eso podría ser beneficioso para la clonación intraespecie. Este método reduce el número de copias de ADN mitocondrial en ovocitos bovinos en más del 90%, lo que podría reducir la incidencia de heteroplasmia mitocondrial en embriones clonados.Laura Adams, una estudiante de doctorado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Para comenzar, usando una pipeta, recoja los ovocitos maduros seleccionados de la gota HSOF y colóquelos en el tubo de 1.5 mililitros que contiene 50 microlitros de la solución HSOF CB. Centrifugar los ovocitos a 15.000 veces G durante 12 minutos.Mientras se centrifugan los ovocitos, prepara la placa de bisección. Para esto, comience haciendo un patrón en la tapa de una placa de Petri de 60 milímetros utilizando 20 microlitros por gota, y cubra completamente las gotas con aceite mineral. Usando un marcador de punta delgada, marque las líneas debajo del plato.Cubra el plato con una tapa opaca hasta que se complete la centrifugación para evitar cambios de osmolaridad de las microgotas. Tan pronto como se complete la centrifugación, use una pipeta de 200 microlitros p

use-of-bisection-to-reduce-mitochondrial-dna-in-the-bovine-oocyte

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Bisulfito de mutagénesis es el estándar de oro para el análisis de la metilación del ADN. Nuestro protocolo modificado permite el análisis de metilación del ADN en el ámbito de una sola célula y fue diseñado específicamente para los ovocitos individuales. También se puede utilizar para los embriones etapa de escisión.

Único ovocito Mutagénesis bisulfito

Este video describe el procedimiento para aislar mitocondrias de tejidos de cáncer de ovario humano utilizando centrifugación de velocidad diferencial en combinación con centrifugación en gradiente de densidad. Las mitocondrias aisladas se pueden utilizar para el análisis proteómico del proteoma mitocondrial del cáncer de ovario humano.

Aislamiento mitocondrial: una técnica para aislar mitocondrias de una muestra de tejido de cáncer de ovario humano

A continuación, presentamos un protocolo para el agotamiento de ARNm siRNA mediada específico seguido por análisis de inmunofluorescencia para evaluar ensamblaje del huso meiótico y la organización de los ovocitos de ratón. Este protocolo es adecuado para el agotamiento de las transcripciones in vitro y la evaluación funcional de los diferentes husillo y / o factores MTOC asociada en ovocitos.

Evaluación del huso meiótico en ovocitos de ratón por silenciamiento siRNA mediada

Este manuscrito describe un enfoque experimental para caracterizar morfológicamente y bioquímicamente ovocitos de caballo. Específicamente, el presente trabajo ilustra cómo recolectar ovocitos de caballo inmaduros y maduros mediante recogida de óvulos guiada por ultrasonido (OPU) y cómo investigar la segregación de cromosomas, morfología de huso, acetilación de histonas globales y expresión de mRNA.

Análisis de la segregación cromosómica, acetilación de histonas y morfología de huso en ovocitos de caballo

Se presenta un método para la microdisección del oviducto de ratón que permite la recolección de los segmentos individuales mientras se mantiene la integridad del ARN. Además, se describe el procedimiento de disociación de células oviductales no enzimáticas. Los métodos son apropiados para el posterior análisis de genes y proteínas de los segmentos oviductales funcionalmente diferentes y las células oviductales disociadas.

Microdisección y disociación del oviducto murino: identificación de segmentos individuales y aislamiento unicelular

Avanzar en el estudio de la foliculogénesis preantral requiere métodos eficientes de aislamiento de folículos de ovarios individuales. Aquí se presenta un protocolo mecánico simplificado para el aislamiento de folículos de ovarios bovinos utilizando un cortador de tejido y homogeneizador. Este método permite la recolección de un gran número de folículos preantrales viables de un solo ovario.

Aislamiento de pequeños folículos preantrales del ovario bovino mediante una combinación de fragmentación, homogeneización y filtración en serie

Se presenta un protocolo optimizado que permite el agotamiento de los centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón durante la metafase I utilizando un láser de femtosegundo de infrarrojo cercano.

Ablación con láser multifotón de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón

Los sitios de contacto mitocondrial son complejos proteicos que interactúan con las proteínas de la membrana interna y externa mitocondrial. Estos sitios son esenciales para la comunicación entre las membranas mitocondriales y, por lo tanto, entre el citosol y la matriz mitocondrial. Aquí, describimos un método para identificar candidatos que califican para esta clase específica de proteínas.

Un método mejorado para aislar los sitios de contacto mitocondrial

Aquí presentamos protocolos que ofrecen una base flexible y estratégica para manipular viralmente células precursoras de oligodendrocitos para sobreexpresar proteínas de interés con el fin de interrogar específicamente su papel en oligodendrocitos a través del modelo in vitro de mielinización del sistema nervioso central.

Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para In Vitro Ensayos de mielinización

Aquí describimos el flujo de trabajo para usar el sistema TetON para lograr la expresión génica específica del tejido en la aleta de la cola del pez cebra adulto en regeneración.

El uso del Sistema de Teton para estudiar los mecanismos moleculares de la regeneración de pez cebra

Aprende a reducir el ADN mitocondrial en ovocitos bovinos mediante centrifugación y bisección. Este protocolo logra una disminución superior al 90%, mejorando la viabilidad de embriones clonados.

Uso de la bisección para reducir el ADN mitocondrial en el ovocito bovino

Explorar más videos