Name: Ensayo de gravitaxis a gran escala de larvas de Caenorhabditis dauer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Aprende un ensayo de gravitaxis a gran escala con larvas dauer de Caenorhabditis elegans para neurociencia y biología del comportamiento. Este método mejora la detección de respuestas gravitácticas con alta sensibilidad.

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Esta investigación fue apoyada por becas de investigación de los Institutos Nacionales de Salud a JHR (#R01 5R01HD081266 y #R01GM141493). Algunas cepas fueron proporcionadas por el CGC, que está financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Nos gustaría agradecer a Pradeep Joshi (UCSB) por su aporte editorial. Consulta estadística proporcionada por el DATALAB de UCSB.

Las cepas utilizadas en el presente estudio son C. elegans (N2) y C. briggsae (AF16) (ver Tabla de Materiales). Se utilizó una población mixta de dauers para cada ensayo.
1. Preparación de la cámara
<ol><li>Trabajar en una campana extractora. Configure el espacio de trabajo con un mechero Bunsen, 1-2 cuchillas de afeitar, alicates, pinzas y una superficie de corte de plástico (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Para cada cámara, reunir dos pipetas serológicas de 5 ml. Retire el tapón de algodón de una pipeta con pinzas. Sostenga una cuchilla de afeitar sobre el quemador Bunsen hasta que esté caliente con unos alicates. Utilice la cuchilla calentada para cortar el extremo cónico de la segunda pipeta de modo que toda la pipeta tenga un diámetro uniforme (figura 1A).</li>
	<li>Trabajando rápidamente, acerque los dos extremos de pipeta modificados a la llama, derritiéndolos ligeramente. Une estos extremos presionándolos firmemente entre sí, asegurándote de que las paredes de ambas pipetas sean continuas. Si hay huecos visibles después de unirse, sepárelos y repita este paso (Figura 1A, B).</li>
</ol>2. Llenado de las cámaras con agar
<ol><li>Preparar NGM con agar al 4% de acuerdo con los procedimientos estándar de lombriz21. Mientras el agar aún está fundido, llene cada cámara uniéndolo a una pipeta serológica y extrayendo lentamente la solución. Selle la punta con una película de parafina antes de retirar la cámara del pipetedor. Coloque la cámara plana (paralela a la mesa de trabajo) para que se enfríe. NOTA: Cubrir el matraz con envoltura adhesiva (ver Tabla de materiales) después del autoclave ayuda a evitar que se formen burbujas en la solución18.<ol><li>Para minimizar cualquier variación en la consistencia del agar debido a un enfriamiento desigual, sostenga la pipeta (consulte la Tabla de materiales) paralela a la mesa de trabajo mientras dibuja el agar. Coloque las cámaras planas en la mesa de trabajo y deje que el agar se endurezca antes de moverse. NOTA: El porcentaje de agar y el contenido multimedia se pueden adaptar al experimento. El agar al 4% es más rígido que la concentración de aproximadamente el 2% utilizada para verter la placa y evita que los gusanos excaven a través del medio en nuestras manos. Sin embargo, otros experimentadores han observado el comportamiento de madriguera de gusanos adultos en hasta un 9% de agar18,19.</li>
	</ol></li>
	<li>Una vez enfriado, caliente una llave hexagonal de 3 mm (u otra herramienta metálica del mismo tamaño, consulte la Tabla de materiales) sobre un mechero Bunsen. Presiónelo firmemente en la pared de cada cámara a unos 5 mm a un lado de la línea media, creando una pequeña abertura en el plástico (Figura 1C). Use una cuchilla calentada para quitar el algodón y los extremos cónicos de la cámara y selle estos extremos con una película de parafina. NOTA: Una vez preparada, cada cámara debe utilizarse en un plazo de 1 día o mantenerse a 4 °C durante varios días. Cubra cualquier abertura expuesta con una película de parafina para evitar que el agar se seque.</li>
</ol>3. Aislar larvas de dauer
<ol><li>10-15 días antes del experimento, troce cada cepa en 2-3 placas grandes de NGM con bacterias OP50 y envuélvalas con una película de parafina. Después de 10-15 días, cada plato debe estar completamente hambriento con miles de larvas de dauer presentes en el agar, las paredes y las tapas. NOTA: Haga platos con anticipación usando una receta OP50 gruesa para obtener el máximo hacinamiento (consulte la Tabla de materiales). La formación de Dauer también puede ser inducida a través de otros métodos, incluyendo la adición de feromonas o creciendo a temperaturas más altas22.</li>
	<li>Recoja los gusanos enjuagando las tapas y placas con tampón M9 y pipeteando la solución en tubos centrífugos de 15 ml. Girar a 1.600 x g durante 30-60 s a temperatura ambiente y aspirar la mayor parte del tampón M9 con una pipeta o aspirador de vacío.</li>
	<li>Aislar los dauers tratando con SDS al 1% seguido de un gradiente de flotación de sacarosa al 30% siguiendo el informe publicado anteriormente20.<ol><li>Agregue 7 ml de solución SDS al 1% a cada pellet de lombriz. Deje los gusanos en SDS durante 30 minutos; Gire los tubos continuamente durante este tiempo para permitir la aireación. Enjuague 3-5x con M9 para eliminar el detergente.</li>
		<li>A continuación, agregue 5 ml de M9 seguido de 5 ml de solución fría de sacarosa filtrada al 60%. Mezclar bien y luego centrifugar a 1.600 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente para crear un gradiente de separación.</li>
	</ol></li>
	<li>Llene los nuevos tubos de centrífuga de 15 ml con 2 ml de tampón M9. Aplastar los extremos de las pipetas de vidrio Pasteur para ensanchar el orificio y utilizar estas pipetas para transferir la capa superior de la solución (que contiene dauers aislados) del gradiente de sacarosa a los nuevos tubos. Enjuague los dauers 3-5x con M9. NOTA: Habrá miles de dauers aislados en solución en este punto. Pueden usarse inmediatamente o mantenerse aireados girando en 5-7 ml M9 durante la noche.</li>
</ol>4. Adición de dauers a la cámara
<ol><li>Centrífuga a 1.600 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar la mayor parte de la solución M9 con una pipeta o aspirador de vacío. Para estimar la densidad de gusanos, cuente manualmente el número de gusanos en tres gotas separadas de 1 μL bajo un microscopio de disección. Utilice el promedio de estos recuentos para aproximar el número de gusanos por μL. NOTA: Es posible que algunas pipetas de pequeño volumen no puedan alcanzar el fondo de un tubo de centrífuga de 15 ml; En este caso, una gota concentrada de gusanos se puede transferir primero a un trozo de película de parafina.</li>
	<li>Corte el extremo de una punta de pipeta de 10, 20 o 200 μL para ensanchar el orificio. Ajuste la micropipeta a un volumen ligeramente mayor que el volumen de aspiración previsto. Aspire aproximadamente 1-2 μL de la solución de gusano concentrada (idealmente entre 100-300 gusanos) y permita que una pequeña cantidad de aire entre en la punta. NOTA: Un gran número de gusanos (1,000+) en una cámara puede aumentar el rango de distancias recorridas debido al hacinamiento9.</li>
	<li>Empuje suavemente la punta de la pipeta en el agar mientras presiona la micropipeta. Esto creará un sitio de inyección en el agar sin obstruir la punta. Libera los gusanos en el agar. Use una película de parafina para sellar la abertura.</li>
</ol>5. Ejecución y puntuación del ensayo
NOTA: La gravitaxis puede ser probada bajo diversas condiciones que pueden afectar el comportamiento9.
<ol><li>Para eliminar tantas variables como sea posible, coloque las cámaras dentro de una jaula oscura de Faraday (consulte la Tabla de materiales) a temperatura ambiente.</li>
	<li>Etiquete cada cámara y cuélguela verticalmente dentro de la jaula de Faraday (realice esto usando cinta de etiquetado). Pruebe los controles horizontales simultáneamente colocando algunas cámaras planas dentro de las mismas condiciones ambientales. Pruebe las cepas experimentales contra gusanos N2 orientados verticalmente como control positivo. Utilice cámaras orientadas horizontalmente que contengan dauers N2 como control negativo adicional. NOTA: Los ensayos horizontales y verticales deben realizarse en el mismo entorno dentro del laboratorio para minimizar la variabilidad ambiental entre las dos condiciones. Se puede usar una incubadora grande para albergar ambas jaulas de Faraday.</li>
	<li>Los Dauers comienzan a dispersarse desde el sitio de inicio después de unas horas y tardan varias horas en llegar a cada extremo de la cámara. Deje las cámaras sin molestias durante este tiempo y marque dentro de las 12-24 h siguientes a la inyección. NOTA: No use un paralítico (como azida de sodio) para inmovilizar gusanos que han alcanzado los extremos de las cámaras. Debido a que se mide la distribución general de los gusanos en lugar de un índice de preferencia (como en un ensayo de dos opciones), la azida de sodio es innecesaria y puede alterar los resultados.</li>
	<li>Retire y marque las cámaras del eje gravitacional una a la vez. Busque dauers vivos bajo un microscopio de disección y marque sus ubicaciones con tinta (Figura 1C, D). No marque los gusanos dentro de los 2,5 cm a cada lado del sitio de inyección, ya que es probable que estos gusanos no demuestren una preferencia direccional.<ol><li>Además, evite marcar gusanos que parecen muertos o están atrapados en el líquido. Deseche cualquier cámara que contenga >50% de gusanos muertos o nadadores. NOTA: Una vez que la cámara se ha retirado del área de prueba, debe puntuarse rápidamente para mayor precisión. Los dauers solo deben ser visibles entre la superficie del agar y la pared de la pipeta. Si se observa un comportamiento de madriguera, considere aumentar la concentración de agar en futuros ensayos.</li>
	</ol></li>
	<li>Para cuantificar los resultados, utilice un marcador para dividir cada mitad de la cámara en siete secciones de 3,5 cm a partir de 2,5 cm de distancia del lugar de inyección (en algunas pipetas, 3,5 cm = 1 ml de volumen). Utilice un contador de conteo manual (consulte la Tabla de materiales) para calcular el número de gusanos observados en cada sección. NOTA: Debe haber siete secciones a cada lado del origen, que se pueden numerar de -7 (abajo) a +7 (arriba). Estos números deben corresponder a las mismas ubicaciones relativas basadas en cómo se construyeron las cámaras; El agar se extrae desde el extremo -7 hasta el extremo +7 en el paso 2.</li>
</ol>

<ol><li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+integration+for+human+balance+control%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li>
<li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584(2014).</li>
<li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li>
<li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gravitational+Physiology%22%5BJournal%5D)">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li>
<li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391(2014).</li>
<li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%2C+is+regulated+by+IL2+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li>
<li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li>
<li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%A4der%2C+D-P+%22Euglena%3A+Biochemistry%2C+Cell+and+Molecular+Biology%22">Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology</a>. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston%27s+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li>
<li>Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186(2021).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+chemotaxis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069(2013).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493(2015).</li>
<li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li>
<li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li>
<li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293(2011).</li>
<li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li>
<li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn%27s+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Stata+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li>
<li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li>
<li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress%2C+temperature%2C+and+other+physical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li>
<li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans%3A+a+sensible+model+for+sensory+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li>
<li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li>
<li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li>
<li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049(2018).</li>
<li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).</li>
<li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li>
<li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469(2013).</li>
<li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li>
<li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disorders+of+the+vestibular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Otolaryngology+%26+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li>
<li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+vestibular+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li>
<li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207(2021).</li>
<li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+hearing+and+balance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567(2019).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Comparación con métodos anteriores A diferencia de la quimiotaxis, el eje gravitacional en Caenorhabditis no se puede observar de manera confiable utilizando un diseño experimental tradicional de placa de agar. Una placa de Petri estándar tiene 150 mm de diámetro, lo que resulta en solo 75 mm disponibles en cualquier dirección para que los dauers demuestren la preferencia del eje gravitatorio. Aunque la preferencia orientativa de C. elegans se puede ensayar en la solución<sup class="...

Detectar la atracción gravitacional de la Tierra es crucial para la orientación, el movimiento, la coordinación y el equilibrio de muchos organismos. Sin embargo, los mecanismos moleculares y los neurocircuitos de la sensación de gravedad son poco conocidos en comparación con otros sentidos. En los animales, la sensación de gravedad interactúa y puede ser superada por otros estímulos para influir en el comportamiento. Las señales visuales, la retroalimentación propioceptiva y la información vestibular pueden integrarse para generar un sentido de conciencia corporal en relación con el entorno de un animal 1,2. Por el contrario, la preferencia gravíctica puede ser alterada en presencia de otros estímulos 3,4,5. Por lo tanto, el comportamiento gravitáctico es ideal para estudiar la sensación de gravedad y comprender la compleja integración sensorial del sistema nervioso y la toma de decisiones.
C. elegans es un organismo modelo especialmente útil para estudiar el eje gravitacional debido a su ciclo de vida polifénico. Cuando se exponen a factores estresantes durante el desarrollo, incluyendo calor, hacinamiento o falta de alimentos, las larvas de C. elegans se convierten en dauers, que son altamente resistentes al estrés6. Como dauers, los gusanos realizan comportamientos característicos, como la nictación, en la que los gusanos "se paran" sobre sus colas y agitan sus cabezas, lo que puede facilitar la dispersión a mejores hábitats7. Los ensayos de gravitaxis de C. elegans y C. japonica sugieren que las larvas de dauer gravitan negativamente, y que este comportamiento se observa más fácilmente en dauers que en adultos 8,9. Las pruebas del eje gravitacional en otras cepas de Caenorhabditis pueden revelar una variación natural en el comportamiento gravitáctico.
Los mecanismos para la sensación de gravedad se han caracterizado en Euglena, Drosophila, Ciona y varias otras especies utilizando ensayos de eje gravitacional 3,10,11. Mientras tanto, los estudios del eje gravitacional en Caenorhabditis inicialmente proporcionaron resultados mixtos. Un estudio de la preferencia orientacional de C. elegans encontró que los gusanos se orientan con la cabeza hacia abajo en solución, sugiriendo una preferencia gravitáctica positiva12. Mientras tanto, aunque los dauers de C. japonica fueron identificados desde el principio como gravitácticos negativos8, este comportamiento solo recientemente se ha descrito en C. elegans9. Varios desafíos surgen en el desarrollo de un ensayo de gravitaxis representativo en gusanos. Las cepas de Caenorhabditis se mantienen en placas de agar; Por esta razón, los ensayos de comportamiento suelen utilizar placas de agar como parte de su diseño experimental13,14,15. El primer ensayo de eje gravitacional reportado en Caenorhabditis se realizó colocando una placa de lado en un ángulo de 90 ° con respecto a la placa de control horizontal8. Sin embargo, el comportamiento del eje gravitacional no siempre es robusto en estas condiciones. Mientras que los gusanos adultos pueden ser ensayados para la preferencia orientativa en la solución12, esta preferencia direccional también puede depender del contexto, lo que lleva a diferentes comportamientos si los gusanos se arrastran en lugar de nadar. Además, C. elegans es sensible a otros estímulos, incluyendo la luz y los campos electromagnéticos16,17, que interfieren con sus respuestas a la gravedad9. Por lo tanto, un ensayo de eje gravitacional actualizado que protege contra otras variables ambientales es importante para diseccionar los mecanismos de este proceso sensorial.
En el presente protocolo, se describe un ensayo para observar el eje gravitacional de Caenorhabditis. La configuración para este estudio se basa en parte en un método desarrollado para estudiar la integridad neuromuscular18,19. Las larvas de Dauer se cultivan y aíslan utilizando procedimientos estándar20. Luego se inyectan en cámaras hechas de dos pipetas serológicas de 5 ml llenas de agar. Estas cámaras pueden orientarse vertical u horizontalmente y colocarse dentro de una jaula de Faraday oscura durante 12-24 h para protegerse contra la luz y los campos electromagnéticos. La ubicación de cada gusano en las cámaras se registra y se compara con los taxis verticales de una cepa de referencia como C. elegans N2.

<table><tbody><tr>Solución <td></td><td></td> de <td>dodecil sulfato de sodio al 1%</td><td>De stock 10% (p/v) SDS en agua desionizada</td></tr><tr><td>15 mL Tubos de centrífuga</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Llave</td><td></td><td></td> hexagonal de 3 mm Se <td>pueden utilizar otras herramientas metálicas de tamaño similar</td></tr><tr><td>Agar al 4% en medio de crecimiento normal (NGM) - 1 L</td><td></td><td></td><td>Antes de esterilizar en autoclave: 3 g de NaCl, 40 g de agar, 2,5 g de peptona, 2 g de dextrosa, 10 mL de uracilo (2 mg/mL), 500 &mu; L de colesterol (10 mg/mL), 1 mL de CaCl2, 962 mL de agua desionizada; Después de la esterilización en autoclave: 24,5 mL de tampón de fosfato, 1 mL 1 MgSO4 (1 m), 1 mL de estreptomicina (200 mg/mL)</td></tr><tr><td>5 mL Pipetas serológicas</td><td>Fisherbrand</td><td>S68228C</td><td>Poliestireno, no vidrio de borosilicato</td></tr><tr><td>60% Solución</td><td></td><td></td> de sacarosa fría <td>60% de sacarosa (p/v) en agua desionizada; esterilizar por filtración (0,45 &mu; Filtro M). Mantener a 4 &deg; C</td></tr><tr><td>AF16 C. briggsae u otra cepa</td><td></td><td></td> experimental <td>Disponible en el CGC (Centro de Genética de Caenorhabditis)</td></tr><tr><td>Quemador</td><td></td><td></td><td></td>Bunsen</tr><tr><td>Envoltura adhesiva</td><td>Fisherbrand</td><td>22-305654</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td></td><td></td><td></td>clínica</tr><tr><td>Hojas de afeitar desechables</td><td>Fisherbrand</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr>Jaula <td></td><td></td><td>de Faraday</td><td>Se puede construir con cartón y papel de aluminio; 30" de largo x 6" de ancho x 26" de alto o más grande</td></tr><tr><td>Rotuladores de</td><td></td><td></td> tinta <td>Sharpie u otra marca para marcar en plástico</td></tr><tr><td>Cinta de etiquetado</td> Carolina <td>215620</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M9 tampón</td><td></td><td></td><td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td></tr><tr><td>N2 C. elegans cepa</td><td></td><td></td><td>Disponible en el CGC (Centro de Genética de Caenorhabditis)</td></tr> <tr><td>placas NGM con agar OP50</td><td></td><td></td><td>al 1,7% (p/v) en NGM (ver descripción: agar al 4% en NGM). Semilla con OP50</td></tr><tr><td>Película de parafina</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr>Tabla <td></td><td></td><td></td>de<td>cortar de plástico</td></tr><tr><td>Alicates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezclador vertical giratorio</td><td>BTLab SYSTEMS</td><td>BT913</td><td>Con barra de tubo de 22 x 15 mL</td></tr><tr><td>Pipeta serológica</td><td>Corning</td><td>357469</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Laxco S2103LS100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador</td><td>ULINE</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Medios de placa gruesa de NGM/agar - 1 L</td><td></td><td></td><td>Ver Agar 4% en la receta de NGM; reemplace 40 g de Agar con pinzas</td></tr><tr><td>de</td><td></td><td></td><td></td></tr> Agar de 20 g</tbody></table>

ensayo de gravitaxis a gran escala de larvas de caenorhabditis dauer

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

La sensación de gravedad es un proceso importante y relativamente poco estudiado. La detección de la gravedad permite a los animales navegar por su entorno y facilita el movimiento. Además, la sensación de gravedad, que ocurre en el oído interno de los mamíferos, está estrechamente relacionada con la audición, por lo tanto, comprender este proceso tiene implicaciones para la investigación auditiva y vestibular. Existen ensayos de gravitaxis para algunos organismos modelo, incluyendo Drosophila. Los gusanos individuales han sido previamente ensayados para determinar su preferencia de orientación a medida que se asientan en solución. Sin embargo, no se ha descrito un ensayo fiable y robusto para el eje gravititario de Caenorhabditis . El presente protocolo describe un procedimiento para realizar ensayos de eje gravitacional que se puede utilizar para probar cientos de dauers de Caenorhabditis a la vez. Este ensayo a gran escala y a larga distancia permite la recopilación detallada de datos, revelando fenotipos que pueden pasarse por alto en un ensayo estándar basado en placas. El movimiento de Dauer a lo largo del eje vertical se compara con los controles horizontales para garantizar que el sesgo direccional se deba a la gravedad. La preferencia gravitáctica se puede comparar entre cepas o condiciones experimentales. Este método puede determinar los requisitos moleculares, celulares y ambientales para el eje gravitacional en gusanos.

Comparando el graviteje entre especies Siguiendo el procedimiento descrito anteriormente, el eje gravitacional de C. briggsae dauer se puede comparar con el eje gravitacional y los controles horizontales de C. elegans. La distribución vertical (granate) de C. briggsae dauers está sesgada hacia la parte superior de las cámaras, con un gran porcentaje de gusanos que alcanzan +7 (Figura 2A). En contraste con los controles horizontales (aqua), en lo...

El presente protocolo describe métodos para realizar un ensayo gravitacional a gran escala con larvas de Caenorhabditis dauer. Este protocolo permite una mejor detección del comportamiento del eje gravitacional en comparación con un ensayo basado en placas.

Ensayo de gravitaxis a gran escala de larvas de Caenorhabditis dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Este ensayo de alto rendimiento se puede utilizar para observar un comportamiento gravitáctico robusto en larvas de caenorhabditis dauer. El comportamiento del gusano se observa a grandes distancias en comparación con los ensayos realizados en una placa de Petri. Esto mejora la sensibilidad del ensayo y permite un análisis detallado de los datos.El estudio del comportamiento del eje gravitacional puede proporcionar información sobre cómo se produce la sensación de gravedad en la caenorhabditis, que tiene relevancia para comprender el sistema vestibular de los mamíferos. Crear las cámaras de ensayo del eje gravitativo, aislar a los dauers e inyectar los gusanos en las cámaras requiere práctica. Puede ahorrar tiempo aislando los dauers y creando las cámaras con un día de anticipación.Comience instalando un mechero Bunsen, una o dos cuchillas de afeitar, alicates, pinzas y una superficie de corte de plástico, y una campana extractora. Para hacer una cámara, reúna dos pipetas serológicas de 5 mililitros y, con pinzas, retire el tapón de algodón de una pipeta. Sostenga una hoja de afeitar con unos alicates sobre el mechero Bunsen hasta que esté caliente.Utilice la cuchilla calentada par

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