Name: Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a editar células madre hematopoyéticas con CRISPR/Cas9 preservando su capacidad de engraftamiento in vivo. Este protocolo optimizado mejora la eficacia de la terapia génica para enfermedades monogénicas e infecciosas como el VIH.

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Los autores quieren reconocer al personal de la instalación de citometría de flujo y la instalación de animales de CSCR. A. C. está financiado por una beca ICMR-SRF, K. V. K. está financiado por una beca DST-INSPIRE y P. B. está financiado por una beca CSIR-JRF. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Biotecnología del Gobierno de la India (subvención no. BT / PR26901 / MED / 31/377 / 2017 y BT / PR31616 / MED / 31/408 / 2019)

<ol><li>Staal, F. J. T., Aiuti, A., Cavazzana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+stem-cell-based+gene+therapy+for+inherited+disorders%3A+State+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Autologous stem-cell-based gene therapy for inherited disorders: State of the art and perspectives.</a> Frontiers in Pediatrics. 7, 443(2019).</li>
<li>Naldini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+hematopoiesis%3A+Current+stage+of+clinical+translation+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of hematopoiesis: Current stage of clinical translation and future perspectives.</a> EMBO Molecular Medicine. 11 (3), 9958(2019).</li>
<li>Srivastava, A., Shaji, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cure+for+thalassemia+major+-+From+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation+to+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Cure for thalassemia major - From allogeneic hematopoietic stem cell transplantation to gene therapy.</a> Haematologica. 102 (2), 214-223 (2017).</li>
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<li>Ravi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+HPFH-like+mutations+by+CRISPR+base+editing+that+elevates+the+expression+of+fetal+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin.</a> eLife. 11, 65421(2020).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+busulfan+reduces+human+CD34%2B+cell+doses+required+for+engraftment+in+c-kit+mutant+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).</li>
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<li>Audigé, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+leukocyte+reconstitution+in+NSG+mice+transplanted+with+human+cord+blood+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells.</a> BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).</li>
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<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Ngom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UM171+enhances+lentiviral+gene+transfer+and+recovery+of+primitive+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).</li>
<li>Park, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+proliferation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+by+a+combination+of+hyper-interleukin-6+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+therapy+of+hematopoietic+stem+cells+in+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Rai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+culture+conditions+promote+ex-vivo+manipulation+and+expansion+of+primitive+hematopoietic+stem+cells+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).</li>
</ol>

Los autores declaran que no existen intereses financieros contrapuestos.

El resultado exitoso de la terapia génica HSPC depende predominantemente de la calidad y cantidad de HSC injertables en el injerto. Sin embargo, las propiedades funcionales de las HSC se ven muy afectadas durante la fase preparatoria de los productos de terapia génica, incluso por el cultivo in vitro y la toxicidad asociada con el procedimiento de manipulación génica. Para superar estas limitaciones, hemos identificado condiciones ideales de cultivo de HSPC que conservan el tallo de las HSC CD34 + CD133 + CD90<s...

La inaccesibilidad a donantes compatibles con antígenos leucocitarios humanos (HLA) en entornos de trasplante alogénico y el rápido desarrollo de herramientas de ingeniería genética altamente versátiles y seguras hacen del trasplante autólogo de células madre hematopoyéticas (TCMH) una estrategia de tratamiento curativo para los trastornos sanguíneos hereditarios 1,2. La terapia génica autóloga con células madre hematopoyéticas y progenitoras (HSPC) implica la recolección de HSPC de los pacientes, la manipulación genética, la corrección de mutaciones causantes de enfermedades y el trasplante de HSPC corregidas genéticamente en el paciente 3,4. Sin embargo, el resultado exitoso de la terapia génica depende de la calidad del injerto trasplantable modificado genéticamente. Los pasos de manipulación génica y el cultivo ex vivo de HSPC afectan la calidad del injerto al disminuir la frecuencia de células madre hematopoyéticas a largo plazo (LT-HSCs), lo que requiere la infusión de grandes dosis de HSPC manipuladas genéticamente 2,5,6.
Varias moléculas pequeñas, incluyendo SR1 y UM171, se están empleando actualmente para expandir robustamente las HSPC de la sangre del cordón umbilical 7,8. Para las HSPC adultas, debido al mayor rendimiento celular obtenido en la movilización, no se requiere una expansión robusta. Sin embargo, la retención del tallo de las HSPC aisladas en cultivo ex vivo es crucial para sus aplicaciones de terapia génica. Por lo tanto, se desarrolla un enfoque centrado en el enriquecimiento en cultivo de células madre hematopoyéticas (HSC) utilizando una combinación de moléculas pequeñas: resveratrol, UM729 y SR1 (RUS)7. Las condiciones optimizadas de cultivo de HSPC promueven el enriquecimiento de HSCs, resultando en una mayor frecuencia de HSCs modificadas genéticamente in vivo, y reducen la necesidad de manipular genes grandes dosis de HSPCs, facilitando enfoques de terapia génica rentables8.
Aquí, se describe un protocolo integral para el cultivo de HSPCs, junto con la infusión y el análisis de células editadas genéticamente in vivo.

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&reg; X Unidad</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&trade; X Kit ( Nucleocuvette&trade de 16 pocillos; Tiras)</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD45 APC</td><td>BD BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD13 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 555394 <tr><td>Anti-humano CD19 PerCP</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 340421 <tr><td>Anti-humano CD3 PE-Cy7</td><td>BD BIOSCIENCE 557749</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD90 APC</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 561971 <tr><td>Anti-humano CD133/1&nbsp;</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-113-673</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humano CD34 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>Anti-ratón CD45.1 PerCP-Cy5</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>560580</td><td></td></tr><tr><td>Blood Irradator-2000</td><td>&nbsp; BRIT (Departamento de Biotecnología, India)</td><td>BI 2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular (placas de 6 pocillos con tratamiento superficial delta)</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>140675 <tr><td>CrysoStor CS10</td><td>BioLife solutions</td><td>#07952</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>CELON LABS (60 mg/10 ml)</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guide-it Recombinante Cas9</td><td>TAKARA BIO</td><td>632640</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-eGFP</td><td>SIGMA</td><td>C120040&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tubo de centrífuga-15ml</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tubo de centrífuga-50ml</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>339652 <tr><td>DMSO</td><td>MPBIO</td><td>219605590</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>6469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Solución salina tamponada con fosfato- 1X</td><td>HYCLONE</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Kit de selección positiva CD34 humano II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>17856</td><td></td></tr><tr><td>Imán EasySep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de electroforesis</td><td>ORANGE INDIA</td><td>HDS0036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr> 10270106 <tr><td>Citómetro de flujo &ndash; ARIA III</td><td>BD BIOCIENCIA-</td><td>&NBSP;</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo&nbsp;</td><td>BD</td> <td>BIOSCIENCE&nbsp;-</td><td></td></tr><tr><td>Flt3-L</td><td>PEPROTECH</td><td>300-19-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagen en gel</td><td>CELL BIOSCIENCES</td><td>11630453</td><td></td></tr><tr><td>HighPrep Reactivo DTR</td><td>MAGBIOGENOMICS</td><td>DT-70005</td><td></td></tr><tr><td>Humano BD Fc Bloque</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PEPROTECH</td><td>200-06-50</td><td></td></tr><tr><td>IMDM medios</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara infrarroja</td><td>MURPHY-Jeringa</td> <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>insulina 6mm 31G</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 324903 <tr><td>Ketamina</td><td>KETMIN 50-Colorante</td> <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>carga 6X</td><td>TAKARA BIO</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Restrainer</td><td>AVANTOR</td><td>TV-150</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de nanogotas</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento de células Neubauer</td><td>ROHEM INSTRUMENTS</td><td>CC-3073</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>El Laboratorio Jackson</td><td>RRID:IMSR_JAX:005557</td><td></td></tr><tr><td>NOD,B6. SCID Il2r&gamma; &minus;/&minus; KitW41/W41 (NBSGW)</td><td>El laboratorio Jackson</td><td>RRID:IMSR_JAX:026622</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 pocillos Nunc delta</td><td>THERMO SCIENTIFIC 140675</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de poliestireno de fondo redondo</td><td>Célula primaria BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>P3 Solución de nucleofección</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>PBP3-02250</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de limpieza PCR</td><td>TAKARA BIO</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Jaula para tartas</td><td>de ratón FISCHER SCIENTIFIC</td><td>50-195-5140</td><td></td></tr><tr><td>tubo de poliestireno de fondo redondo (12 x 75 mm)</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>Primer3</td><td>Whitehead Institute for Biomedical Research</td><td><a href="https://primer3.ut.ee/">https://primer3.ut.ee/</a></td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract&trade; Solución de extracción de ADN</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Reserveratrol</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72862</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>300-07-1000</td><td></td></tr><tr><td>SFEM-II STEMCELL</td><td>TECHNOLOGIES</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>SYNTHEGO-</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN</td><td>TARSON</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StemReginin 1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72342</td><td></td></tr><tr><td>Herramienta de análisis ICE</td><td>SYNTHEGO</td><<td>a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA solución tampón (TE) 1X</td><td>SYNTHEGO</td><td>Suministrado con gRNA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>4375305</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>300-18-1000</td><td></td></tr><tr><td>Azul tripán</td><td>HIMEDIA LABS</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>TECNOLOGÍAS DE CÉLULAS</td><td>MADRE 72914</td><td></td></tr><tr><td>UM729</td><td>TECNOLOGÍAS DE CÉLULAS MADRE</td><td>72332</td><td></td></tr><tr><td>Xilacina</td><td>XILAXINA - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

edición génica crispr/cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición de genes altamente versátil y eficiente adoptada ampliamente para corregir diversas mutaciones genéticas. La viabilidad de la manipulación génica de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) in vitro hace que las HSPC sean una célula diana ideal para la terapia génica. Sin embargo, las HSPC pierden moderadamente su potencial de injerto y repoblación multilinaje en el cultivo ex vivo . En el presente estudio, se describen las condiciones ideales de cultivo que mejoran el injerto de HSPC y generan un mayor número de células modificadas genéticamente in vivo. El informe actual muestra condiciones de cultivo in vitro optimizadas, incluido el tipo de medio de cultivo, la suplementación única de cóctel de moléculas pequeñas, la concentración de citoquinas, las placas de cultivo celular y la densidad de cultivo. Además de eso, se proporciona un procedimiento optimizado de edición de genes HSPC, junto con la validación de los eventos de edición de genes. Para la validación in vivo , se muestran los análisis de infusión y post-injerto de HSPC editados genéticamente en receptores de ratón. Los resultados demostraron que el sistema de cultivo aumentó la frecuencia de HSC funcionales in vitro, lo que resultó en un injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

El presente estudio identifica las condiciones ideales de cultivo de HSPC que facilitan la retención de CD34 + CD133 + CD90 + HSC en cultivo ex vivo. Para demostrar el enriquecimiento del cultivo de HSC junto con la generación mejorada de HSC modificadas genéticamente, se proporcionan los procedimientos optimizados para el aislamiento de PBMNC, purificación de células CD34 +, cultivo, edición de genes, trasplante, caracterización de injertos y células modificadas g...

El presente protocolo describe un procedimiento optimizado de cultivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para el injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

El cultivo ex vivo puede obstaculizar el potencial de repoblación de las células madre y progenitoras hematopoyéticas. Nuestro protocolo preserva el tallo durante el cultivo y, por lo tanto, mejora la frecuencia de las células modificadas genéticamente in vivo. La terapia génica con células madre hematopoyéticas se está empleando actualmente para enfermedades monogénicas y enfermedades infecciosas como el VIH.El protocolo de terapia génica HSPC se basa en gran medida en el cultivo ex vivo. Nuestro protocolo debe ser compatible con cualquier procedimiento que emplee cultivo ex vivo. Demostrando este protocolo estará Vigneshwaran Venkatesan, estudiante de doctorado de mi laboratorio.Después de aislar las HSPC, cultivarlas en medios de cultivo de células madre que contengan citoquinas y moléculas pequeñas Resveratrol, UM729 y StemRegenin1. Antes de la edición de genes, ajuste el ThermoMixer a 37 grados centígrados para reconstituir el ARN guía, luego precaliente el tampón TE a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Centrifugar el vial de sgRNA sintético modificado químicamente a 11, 000 veces g durante 1 minuto a 4 grados Celsius y agregar 15 microlitros de tampón TE al vial que contiene 1.5 nanomolar de sgRNA liofilizado y mezclar mediante un suave remolino para obtener una concentración final de 100 picomolares por microlitro.Incubar el vial en el ThermoMixer con una agitación mínima a 37 grados centígrados durante 30 a 40 segundos. Golpee suavemente el vial en los lados y gire el vial para recoger 15 microlitros de sgRNA. Haga alícuotas de 1 microlitro y guárdelas a menos 80 grados centígrados durante un máximo de 1 año.Para la nucleofección, pellet 2 veces 10 a las 5ª células centrifugando a 200 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Una vez desechado el sobrenadante, resuspender el pellet en 20 microlitros del tampón. Mezclar suavemente la suspensión celular con el complejo RNP preparado evitando burbujas de aire.Ahora, transfiera la suspensión a la tira de nucleofección comercial y electropolara las células utilizando el 4D-Nucleofector seleccionando el código de pulso DZ-100. A las células electroporadas en la tira de nucleofección, agregue 100 microlitros de medios de cultivo preincubados y deje las células intactas durante 10 minutos a temperatura ambiente. Al final de la incubación, transfiera el contenido a la placa de cultivo según los requisitos experimentales.Coloque los ratones NSG en las jaulas de pastel de 6 a 8 horas antes del trasplante de HSPC. Irradiar los ratones a 3,5 gray utilizando un irradiador disponible comercialmente. Para NBSGW, preacondicionar ratones machos y hembras de 6 a 8 semanas de edad inyectando busulfano por vía intraperitoneal a una dosis de 12,5 miligramos por kilogramo de peso corporal 48 horas antes del trasplante de HSPC.Para infundir 1 ratón, pellet 6 veces 10 a las 5ª células en un tubo de 1,5 mililitros centrifugando a 200 veces g durante 5 minutos. a temperatura ambiente. Pipetear suavemente el sobrenadante sin alterar el pellet y resuspender el pellet celular en 100 microlitros de PBS.Coloque los ratones NSG o NBSGW preacondicionados en el retenedor de ratón e infunda las HSPC mediante inyección en la vena de la cola. Sostenga la cola del mouse y empuje suavemente el tapón para sujetar el mouse. Limpie suavemente la cola del ratón con etanol al 70%.Usando una jeringa de insulina calibre 31, aspire 100 microlitros de la suspensión celular. Ahora, dirija la luz de la lámpara infrarroja a la cola durante 30 a 40 segundos, cubriendo el área del cuerpo del ratón con pliegues de papel de seda. Para mantener la cola en el eje de la cepilladora con la jeringa, levántela con el dedo índice izquierdo.Inserte suavemente la parte biselada de la aguja en la vena caudal izquierda o derecha de la cola en un ángulo de 20 grados. Empuje el émbolo para infundir la suspensión celular en la vena y aplique una presión suave cerca de la región perforada con papel de seda y saque la aguja. Después de anestesiar, coloque al animal en decúbito ventral y frote suavemente a los ratones para abrir el ojo, permitiendo que el globo del ojo sobresalga ligeramente.Inserte suavemente la pipeta de pasto en un ángulo de 30 a 45 grados en el canto medial del ojo debajo de la membrana nictitante. Después de colocar la pipeta Pasteur en la posición correcta, aplique una ligera presión en el tubo y comience a girar suavemente el tubo. Después de recolectar de 50 a 80 microlitros de sangre periférica, retire suavemente la pipeta del canto medial del ojo.Después de la eutanasia, haga una incisión vertical 1 centímetro por encima de la uretra y extienda hasta 1 centímetro por debajo del diafragma. Corte horizontalmente en las esquinas del área incisa para abrir la región abdominal. Después de diseccionar el fémur y la tibia, use tijeras para eliminar los tejidos blandos adheridos al fémur y la tibia y frote suavemente los huesos con un papel de seda.Use un bisturí para hacer un pequeño agujero con un diámetro de no más de 0,2 centímetros en el fondo de un tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros. Retire los extremos proximales de los huesos con un bisturí y coloque los huesos con el lado cortado mirando hacia el orificio del tubo de microcentrifugación de 0,5 mililitros. Ahora, coloque el tubo de 0.5 mililitros con los huesos en el tubo de 1.5 mililitros que contiene 100 microlitros de PBS estéril.Cierre la tapa, gire los tubos a 200 veces g durante 3 minutos en condiciones estériles a temperatura ambiente y deseche los tubos de 0,5 mililitros que contienen huesos con una cavidad de médula vacía. Al tubo de reacción de 1.5 mililitros que contiene médula ósea, agregue 1 mililitro de PBS, luego usando una pipeta de 1 mililitro, resuspenda suavemente las células 10 veces. Transfiera 1 mililitro de la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros que contenga 9 mililitros de tampón de lisis RBC.Incubar las células en hielo durante 7 minutos invirtiendo suavemente el tubo cada dos minutos. Después de la incubación, centrifugar el tubo a 200 veces g durante 5 minutos a temperatura ambiente y repetir el lavado hasta que se observe una bolita blanca clara y pálida. La frecuencia de células vivas y CD34 positivas, CD90 positivas ha aumentado en el grupo RUS después de 48 horas de nucleofección.Después de 72 horas, el porcentaje y la frecuencia de indel aumentaron en el grupo tratado con RUS en comparación con el grupo tratado con DMSO, lo que sugiere un aumento en la edición de genes. El número absoluto de células CD34 positivas, CD90 positivas y células nucleadas totales es significativamente mayor 48 horas después de la edición. El análisis de citometría de flujo de células CD45 positivas humanas en ratones NSG mostró un aumento del injerto en las condiciones de cultivo.El análisis de la frecuencia de edición de genes en las células BM de ratón mostró un aumento del injerto de HSPC editadas genéticamente en condiciones de cultivo suplementadas con RUS. Cultivar las HSPC en una confluencia de 200, 000 células por ml es crucial para mejorar las células madre funcionales. La amplificación de las células madre de la sangre del cordón umbilical y las células madre derivadas de iSPC son las nuevas áreas en las que se está probando este protocolo.

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Investigación

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Biología

Este video muestra un ensayo para realizar la edición de genes en células T humanas utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Una mezcla de linfocitos T primarios CD4+ y CD8+ se combina con un complejo de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9, dirigiéndose a genes específicos para su eliminación. Tras la electroporación, el sgRNA guía a Cas9 a la secuencia de ADN objetivo, creando cortes precisos. Estos cortes son reparados por el mecanismo de unión de extremos no homólogos de la célula, lo que lleva a...

Una técnica CRISPR-Cas9 para la edición de genes en células T

Genes específicos de edición usando CRISPR/Cas9 ha facilitado enormemente la comprensión de las funciones biológicas de los genes. Aquí, utilizamos la metodología CRISPR/Cas9 para mutaciones de calreticulina modelo en dependiente de citoquinas hematopoyéticas células para estudiar su actividad oncogénica.

Utilizando CRISPR/Cas9 Gene edición para investigar la actividad oncogénica del mutante calreticulina en dependiente de citoquinas de células hematopoyéticas

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Aquí se presenta un protocolo para la edición eficiente de genes mediados por ribonucleoproteína CRISPR/Cas9 en células de mamíferos mediante electroporación de tubos.

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Aquí, presentamos un protocolo para editar genéticamente las células CAR-T a través de un sistema CRISPR/Cas9.

Uso de CRISPR/Cas9 para noquear GM-CSF en células CAR-T

Se describen protocolos para la edición del genoma altamente eficiente de células madre hematopoyéticas murinas (HSPC) por el sistema CRISPR/Cas9 para desarrollar rápidamente sistemas de modelos de ratón con modificaciones genéticas específicas del sistema hematopoyético.

Edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 para el estudio de células hematopoyéticas en modelos de enfermedades

Aquí, describimos un método detallado para la edición de genes sin fisuras en células madre pluripotentes humanas utilizando un plásmido donante basado en piggyBac y el mutante de nickasa Cas9. Se introdujeron dos mutaciones puntuales en el exón 8 del locus alfa del factor nuclear 4 de hepatocitos (HNF4α) en células madre embrionarias humanas (hESCs).

Introducción de mutaciones puntuales en células madre pluripotentes humanas mediante la edición perfecta del genoma

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Producción de células CAR-T humanas diseñadas por CRISPR

Se necesitan nuevas estrategias para modelar fielmente las mutaciones somáticas en células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para estudiar mejor la biología de las células madre hematopoyéticas y las neoplasias hematológicas. Aquí, se describe un protocolo para modelar mutaciones heterocigotas de ganancia de función en HSPC combinando el uso de CRISPR / Cas9 y la transducción dual de donantes rAAV.

Ingeniería de mutaciones de ganancia de función heterocigotas oncogénicas en células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas

La línea celular THP-1 se utiliza ampliamente como modelo para investigar las funciones de los monocitos/macrófagos humanos en diversas áreas de investigación relacionadas con la biología. Este artículo describe un protocolo para la ingeniería eficiente basada en CRISPR-Cas9 y el aislamiento de clones de una sola célula, lo que permite la producción de datos fenotípicos robustos y reproducibles.

Knockout génico mediado por CRISPR-Cas9 basado en electroporación en células THP-1 y aislamiento de clones de una sola célula

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Evaluación de genes anormales relacionados con el crecimiento de células madre y progenitoras hematopoyéticas mediante la combinación de la tecnología CRISPR/Cas9 con el recuento de células

Aprende a editar células madre hematopoyéticas con CRISPR/Cas9 preservando su capacidad de engraftamiento in vivo. Este protocolo optimizado mejora la eficacia de la terapia génica para enfermedades monogénicas e infecciosas como el VIH.

Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

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