Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado

Este método describe la obtención quirúrgica de tres colgajos porcinos vascularizados y su posterior descelularización por perfusión. Este método puede ayudar a los esfuerzos para regenerar colgajos porcinos utilizando un enfoque de descelularización y recelularización de tejidos. La principal ventaja de esta técnica es su versatilidad para lograr la descelularización por profusión a través de una variedad de colgajos porcinos vascularizados en una configuración de biorreactor simple de ensamblar.

La técnica descrita aquí se puede aplicar ampliamente a otros colgajos vascularizados como una posible solución de ingeniería de tejidos utilizando colgajos porcinos en cirugía reconstructiva. Para comenzar, haga un tubo de entrada y salida midiendo aproximadamente 50 centímetros de tubo de silicona recubierto de platino LS16. Conecte un extremo a un tubo amarillo de bomba de 3 paradas y el otro a una pipeta serológica estéril de 2 mililitros para transportar perfusato desde los depósitos de detergente a la cámara del biorreactor.

Autoclave la cámara y los tubos en envases estériles envueltos individualmente. Para la obtención de colgajo omental, coloque un cerdo Yorkshire anestesiado de 12 semanas de edad en posición supina y luego prepare el abdomen de la manera estéril habitual. Realizar una laparotomía xifo-umbilical para entrar en el abdomen y movilizar la cefalada estomacal, y colocar el epiplón en el campo operatorio.

Comenzando en el aspecto izquierdo de la curvatura mayor, donde la arteria gastroepiploica izquierda se une a la arteria esplénica, esqueletizar la arteria gastroepiploica izquierda y la vena utilizando tijeras rectas de tenotomía de Stevens. Luego liga y divide ambos por separado usando lazos quirúrgicos o clips. Proceder a lo largo de la curvatura mayor del estómago de izquierda a derecha para ligar y dividir las ramas vasculares cortas que surgen del epiplón, suministrando la curvatura mayor del estómago.

Continuar la movilización del epiplón mayor hasta que se encuentre la unión de los vasos gastroepiploicos derechos y la arteria gastroduodenal. Luego ligar y dividir la arteria gastroepiploica derecha y la vena para liberar el colgajo omental y permitir la canulación del colgajo más tarde. Para la obtención del colgajo tensor de la fascia lata, coloque el cerdo en la posición de decúbito lateral.

Marque el límite interior del colgajo desde la espina ilíaca superior anterior, o ASIS, hacia la rótula lateral, y un límite posterior de aproximadamente 8 a 10 centímetros caudalmente. Use un bisturí para hacer una incisión aguda en el margen distal en la rótula. Profundice la incisión a través de los tejidos subcutáneos para llegar a la fascia que recubre el recto femoral, y continúe las incisiones hacia el ASIS a lo largo de los límites marcados.

Para aislar solo el colgajo fascial, retire el componente de la piel suprayacente de la capa subyacente de la fascia. Luego ligar o cauterizar pequeños vasos perforadores a la piel. Regrese al borde distal del colgajo e incise la fascia profunda.

Movilizar la fascia del músculo vasto lateral subyacente hacia el ASIS. Después de trazar el pedículo hacia los vasos femorales profundos, esqueletizar la arteria femoral circunfleja lateral y la vena que suministra el colgajo fascial. Luego ligan y dividen los vasos colgajos proximalmente, donde se unen a los vasos femorales profundos y permiten una canulación posterior.

Para la adquisición del colgajo radial del antebrazo, marque un cuadrado de 3 por 3 centímetros en el aspecto radial de un antebrazo de cerdo extendido. Dibuje una línea entre el punto medio del margen del colgajo proximal y la fosa antecubital para denotar el curso aproximado del pedículo de la arteria radial. Confirmar el curso arterial con palpación.

A continuación, incide la piel con un bisturí en la cara distal con una profundidad hasta la fascia antebraquial. Disección contundente con tijeras de tenotomía hasta encontrar la arteria radial distal y su vena comitantes. Luego ligar y dividir la arteria y las venas con lazos quirúrgicos o clips.

Continúe las incisiones cutáneas en los márgenes radial y cubital del cuadrado marcado de la piel. Luego movilice el colgajo del hueso radial subyacente con una cuchilla quirúrgica o cauterización, procediendo de una dirección cubital a radial mientras eleva el colgajo de piel proximalmente hacia la fosa antecubital. Usando tijeras de tenotomía, esqueletizar la arteria radial y la vena comitantes proximalmente en la fosa antecubital, donde se unen la arteria braquial y las venas, respectivamente.

Diseccionar los vasos de los tejidos fibrograsos circundantes para aislar el pedículo vascular. Luego ligar y dividir la arteria y la vena por separado para liberar el colgajo radial del antebrazo. A continuación, cannule los vasos pediculares con un angiocatéter de calibre 20 a 24 asegurado con lazos de seda 3-0.

Enjuague la solución salina heparinizada en la cánula arterial del colgajo hasta que se observe una salida venosa clara. Mientras trabaja en un gabinete de bioseguridad de flujo laminar, coloque colgajos en la cámara de tejido del biorreactor. Tubo de entrada primario con solución salina heparinizada estéril para eliminar el aire residual y colocar colgajos para permitir la conexión entre la cánula arterial del colgajo y el conector luer macho.

Luego use hemostáticos estériles para atornillar la cánula arterial en el conector. Luego enjuague la solución salina heparinizada a través de la llave de paso para verificar que la conexión luer no tenga fugas y que los flops puedan perfundirse con evidencia de flujo venoso. Después de cerrar la tapa de la cámara de tejido, conecte el tubo de entrada con un tubo amarillo de bomba de 3 paradas a la llave de paso de entrada de la cámara de tejido.

Además, conecte un transductor de sensor de presión en línea a la llave de paso de 3 vías de entrada para el monitoreo de la presión de perfusión. A continuación, encienda la bomba peristáltica de entrada y, en la pantalla inicial, vaya a la tercera pestaña usando la flecha para ajustar el ID del tubo a 1,85 milímetros. A continuación, establezca la velocidad de perfusión desde la segunda pestaña.

La velocidad de entrada como modo de entrega se establece en 2 mililitros por minuto. Asegúrese de que la dirección del flujo sea correcta como se muestra en la pantalla. Cargue el tubo de la bomba de 3 pasos en la bomba peristáltica con un cassette compatible.

Ajuste la configuración de la bomba de salida a una velocidad de 4 mililitros por minuto. Conecte el tubo de salida con un tubo amarillo de bomba de 3 paradas a la llave de paso de salida de la cámara de tejido. Luego cargue el tubo de la bomba de 3 paradas en la bomba peristáltica y comience el flujo para ambas bombas presionando el botón de encendido en cada bomba.

Comience la descelularización de perfusión de colgajos con solución salina heparinizada en la cámara del tejido durante 15 minutos para eliminar cualquier coágulo de sangre retenido. Al finalizar, reemplace la solución salina residual con 500 mililitros de dodecil sulfato de sodio, o SDS, solución de descelularización para sumergir el colgajo. A continuación, transfiera el tubo de entrada a la solución SDS y profunde el tejido.

Después de la descelularización de SDS, aspire la SDS restante antes de perfundir el colgajo con PBS durante un día. Después de la descelularización por perfusión de SDS, perfundir secuencialmente los colgajos en solución de ADN durante dos horas, y luego en PBS durante un día, seguido de transferir el tubo de entrada a ácido peracético y etanol en agua destilada para esterilizar los colgajos perfundiendo durante tres horas. Una vez hecho esto, retire los colgajos asépticamente y sumérjalos en dos lavados de PBS que contienen antibióticos antimicóticos al 1% durante 15 minutos cada uno.

Guarde los colgajos a 4 grados centígrados hasta que estén listos para la recelularización. Utilice una herramienta de biopsia por punción de 3 a 10 milímetros para obtener muestras de tejido para la evaluación de colgajos descelularizados. Los colgajos descelularizados aislados enjuagados bajo control manual demostraron evidencia de salida de la cánula venosa de drenaje libre del epiplón, el tensor de la fascia lata y el colgajo radial del antebrazo.

La morfología macroscópica del epiplón nativo, el tensor de la fascia lata y las aletas radiales del antebrazo aparecieron de color rosado inmediatamente después de la adquisición. En comparación, los tejidos descelularizados eran característicamente blancos u opacos en apariencia. El examen histológico de los tejidos nativos con hematoxilina y eosina mostró la presencia de núcleos azules.

En colgajos descelularizados, la tinción histológica reveló pérdida de material celular sin tinción nuclear azul, lo que indica un andamio de tejido acelular. La cuantificación adicional del contenido de ADN mostró una disminución significativa en el ADN en los andamios acelulares en comparación con los tejidos nativos. La consideración más importante es una técnica quirúrgica utilizada durante la obtención, teniendo cuidado de evitar daños en el pedículo del colgajo para permitir la posterior descelularización de la perfusión.

Después de la descelularización por perfusión, los colgajos resultantes pueden ser recelularizados con poblaciones celulares específicas de tejido para regenerar los compartimentos de tejido nativo.