Name: Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Aprende la descelularización por perfusión de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor personalizado. Esta técnica versátil facilita la ingeniería de tejidos para aplicaciones en cirugía reconstructiva.

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El protocolo propuesto utiliza la perfusión de SDS de baja concentración para descelularizar una gama de colgajos derivados de porcinos. Con este procedimiento, el epiplón acelular, el tensor de la fascia lata y los colgajos radiales del antebrazo se pueden descelularizar con éxito utilizando un protocolo que favorece la baja concentración de SDS. Los experimentos preliminares de optimización han determinado que la SDS a una concentración baja (0,05%) entre 2 días y 5 días es capaz de eliminar material celular para el ep...

La lesión traumática y la extirpación del tumor pueden conducir a defectos grandes y complejos de tejidos blandos. Estos defectos pueden afectar la calidad de vida del paciente, causar pérdida de la función y provocar una discapacidad permanente. Si bien técnicas como la transferencia de colgajo de tejido autólogo se han practicado comúnmente, los problemas con la disponibilidad de colgajo y la morbilidad del sitio donante son limitaciones importantes 1,2,3. El alotrasplante compuesto vascularizado (ACV) es una alternativa prometedora que transfiere tejidos compuestos, por ejemplo, músculo, piel, vasculatura, como una sola unidad a los receptores. Sin embargo, VCA requiere inmunosupresión a largo plazo, lo que conduce a toxicidad farmacológica, infecciones oportunistas y neoplasias malignas 4,5,6.
Los andamios acelulares de ingeniería tisular son una solución potencial a estas limitaciones7. Los andamios de tejido acelular se pueden obtener utilizando métodos de descelularización, que eliminan el material celular de los tejidos nativos al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). En contraste con el uso de materiales sintéticos en la ingeniería de tejidos, el uso de andamios derivados biológicamente ofrece un sustrato de ECM biomimético que permite la biocompatibilidad y el potencial para la traducción clínica8. Después de la descelularización, la posterior recelularización de andamios con células específicas del receptor puede generar tejidos funcionales, vascularizados y con poca o ninguna inmunogenicidad 9,10,11. Mediante el desarrollo de un protocolo eficaz para obtener tejidos acelulares utilizando técnicas de descelularización de perfusión, se puede diseñar una amplia gama de tipos de tejidos. A su vez, la construcción de esta técnica permite la aplicación a tejidos más complejos. Hasta la fecha, la descelularización por perfusión de tejidos blandos vascularizados se ha investigado utilizando tejidos vascularizados simples, como un colgajo fasciocutáneo de espesor total en roedores 12, porcinos13 y modelos humanos 14, así como músculo esquelético recto abdominal porcino15. Además, los tejidos vascularizados complejos también han sido descelularizados por perfusión, como se demostró en los modelos de oído porcino y humano 16,17 y en los modelos de injerto de cara completa humana18.
Aquí, el protocolo describe la descelularización de colgajos libres vascularizados utilizando andamios de ECM derivados biológicamente. Presentamos la descelularización de tres colgajos clínicamente relevantes: 1) el epiplón, 2) el tensor de la fascia lata, y 3) el antebrazo radial, todos los cuales son representativos de los colgajos de caballo de batalla utilizados rutinariamente en cirugía reconstructiva y no han sido examinados previamente en estudios con animales en el contexto de la descelularización tisular. Estos colgajos de bioingeniería ofrecen una plataforma versátil y fácilmente disponible que tiene el potencial de aplicaciones clínicas para su uso en el campo de la reparación y reconstrucción de grandes defectos de tejidos blandos.

<table><tbody><tr><td>0,2 y micro; m pore Acrodisk Filter</td><td>VWR</td><td>CA28143-310</td><td></td></tr><tr><td>0.9 % Solución de cloruro de sodio (solución salina normal)</td><td>Baxter</td><td>JF7123</td><td></td></tr><tr><td>20 L Polipropileno Garra</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-62507-20</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Sofsilk Corbata quirúrgica no absorbible</td><td>Covidien</td><td>&nbsp; LS639</td><td></td></tr><tr><td>Llave de paso de 3 vías</td><td>Cole-Parmer</td><td>UZ-30600-04</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Adson Fine</td><td>Science Tools</td><td>11027-12</td><td></td></tr><tr><td>Solución antibiótica-antimicótica, 100X</td><td>Wisent</td><td>450-115-EL</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de atropina 15 mg/30ml</td><td>Viga 8 Productos</td><td>238481</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath calibre 20</td><td>VWR</td><td>BD381134</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath de 22</td> calibre <td>VWR</td><td>BD381123</td><td></td></tr><tr><td>BD Angiocath de 24</td><td>calibre VWR</td><td>BD381112 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td>ADNasa Cofactor ADNasa</td></tr><tr><td>I del páncreas bovino Ensayo de</td> ADN <td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>(kit de ensayo Quant-iT PicoGreen dsDN)</td><td>Invitrogen</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, 10X</td><td>Wisent</td><td>311-415-CL</td><td>&nbsp; sin Ca++/Mg++</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td></td></tr><tr><td>Heparina, 1000 U.I./mL</td><td>Leo Pharma A/S</td><td>453811</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de Ketamina&nbsp; 5000 mg/50 ml</td><td>Bimeda-MTC Animal Health Inc.</td><td></td><td></td>612316</tr><tr><td>Bomba Ismatec Tygon Tubo de 3 paradas</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96450-40</td><td>Diámetro interno:&nbsp; 1.85 mm</td></tr><tr><td>Ismatec REGLO Bomba de 4 canales</td><td>Cole-Parmer</td><td>78001-78</td><td></td></tr><tr><td>Ismatec Tubing Cassettes</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-78016-98</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano 99.9%, 250 ml</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>2231929</tr><tr><td>LB Agar Lennox Bioshop</td><td>Canada</td><td>LBL406.500</td><td>Placas de agar para pruebas de esterilidad</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td>Cofactor de ADNasa</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 16 Tubo</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-96410-16</td><td></td></tr><tr><td>Midazolam 50 mg/10 ml</td><td>Pharmaceutical Partners of Canada Inc.</td><td></td><td></td>2242905</tr><tr><td>Lápiz de cauterio monopolar</td><td>Valleylab</td><td>E2100</td><td></td></tr><tr><td>Formol tamponado normal, 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>n&deg; 11 hojas de bisturí</td><td>Swann Morton</td><td>303</td><td></td></tr><tr><td>Papaína de látex de papaya</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>Ácido peracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>269336</td><td></td></tr><tr><td>Conector de púas de plástico para tubo de 1/4" a 1/8" ID</td><td>McMaster-Carr</td><td>5117K61</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de púas de plástico 90&deg; Conectores de codo</td><td>McMaster-Carr</td><td>5117K76</td><td></td></tr><tr><td>Tapones de tubo de plástico de giro rápido</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K143</td><td>Macho Luer</td></tr><tr><td>Vasos de tubo de plástico de giro rápido</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K293</td><td>Punzón Luer</td></tr><tr><td>Hembra Herramienta de biopsia</td><td>Integra Miltex</td><td>3332</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio 40 mEq/20 ml</td><td>Hospira Healthcare Corporation</td><td>37869</td><td></td></tr><tr><td>Povidona Yodada, 10%</td><td>Rougier</td><td>833133</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, 2mL</td><td>Fisher Science</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>Tapa a presión Recipientes herméticos</td><td>SnapLock</td><td>142-3941-4</td><td></td></tr><tr><td>Polvo de dodecilo sulfato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de ligadura de metal quirúrgico, pequeñas</td><td>Teleflex</td><td>001200</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de tenotomía Stevens, 115 mm, rectas</td><td>B. Braun</td><td>BC004R</td><td></td></tr><tr><td>Juego de control de presión TruWave</td><td>Edwards Lifesciences</td><td>PX260</td><td></td></tr></tbody></table>

obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado

Procurement and Perfusion-Decellularization of Porcine Vascularized Flaps in a Customized Perfusion Bioreactor

Los defectos de tejido blando de gran volumen conducen a déficits funcionales y pueden afectar en gran medida la calidad de vida del paciente. Aunque la reconstrucción quirúrgica se puede realizar mediante transferencia autóloga de colgajo libre o alotrasplante compuesto vascularizado (VCA), tales métodos también tienen desventajas. Problemas como la morbilidad del sitio donante y la disponibilidad de tejido limitan la transferencia autóloga de colgajo libre, mientras que la inmunosupresión es una limitación significativa de VCA. Los tejidos diseñados en cirugía reconstructiva utilizando métodos de descelularización/recelularización representan una posible solución. Los tejidos descelularizados se generan utilizando métodos que eliminan el material celular nativo al tiempo que preservan la microarquitectura de la matriz extracelular subyacente (ECM). Estos andamios acelulares pueden ser posteriormente recelularizados con células específicas del receptor.
Este protocolo detalla los métodos de adquisición y descelularización utilizados para lograr andamios acelulares en un modelo de cerdo. Además, también proporciona una descripción del diseño y la configuración del biorreactor de perfusión. Los colgajos incluyen el epiplón porcino, la fascia lata tensora y el antebrazo radial. La descelularización se realiza mediante perfusión ex vivo de detergente de dodecil sulfato de sodio (SDS) de baja concentración, seguido de un tratamiento con enzimas DNasa y esterilización con ácido peracético en un biorreactor de perfusión personalizado.
La descelularización tisular exitosa se caracteriza por una apariencia blanco-opaca de colgajos macroscópicamente. Los colgajos acelulares muestran la ausencia de núcleos en la tinción histológica y una reducción significativa en el contenido de ADN. Este protocolo se puede utilizar de manera eficiente para generar andamios de tejidos blandos descelularizados con ECM preservada y microarquitectura vascular. Tales andamios se pueden utilizar en estudios posteriores de recelularización y tienen el potencial de traducción clínica en cirugía reconstructiva.

Este protocolo para descelularizar colgajos porcinos vascularizados se basa en la perfusión de un detergente de base iónica, SDS, a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado. Antes de la descelularización, se adquirieron tres colgajos vascularizados en un modelo porcino y se canularon de acuerdo con sus principales vasos suministradores. Las aletas se enjuagaron inmediatamente después de la adquisición para mantener una vasculatura patentada y perfusible para permitir una descelula...

El protocolo describe la obtención quirúrgica y la posterior descelularización de colgajos porcinos vascularizados mediante la perfusión de detergente dodecil sulfato de sodio a través de la vasculatura del colgajo en un biorreactor de perfusión personalizado.

Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado

Large volume soft tissue defects lead to functional deficits and can greatly impact the patient&#39;s quality of life. Although surgical reconstruction ...

Este método describe la obtención quirúrgica de tres colgajos porcinos vascularizados y su posterior descelularización por perfusión. Este método puede ayudar a los esfuerzos para regenerar colgajos porcinos utilizando un enfoque de descelularización y recelularización de tejidos. La principal ventaja de esta técnica es su versatilidad para lograr la descelularización por profusión a través de una variedad de colgajos porcinos vascularizados en una configuración de biorreactor simple de ensamblar.La técnica descrita aquí se puede aplicar ampliamente a otros colgajos vascularizados como una posible solución de ingeniería de tejidos utilizando colgajos porcinos en cirugía reconstructiva. Para comenzar, haga un tubo de entrada y salida midiendo aproximadamente 50 centímetros de tubo de silicona recubierto de platino LS16. Conecte un extremo a un tubo amarillo de bomba de 3 paradas y el otro a una pipeta serológica estéril de 2 mililitros para transportar perfusato desde los depósitos de detergente a la cámara del biorreactor.Autoclave la cámara y los tubos en envases estériles envueltos individualmente. Para la obtención de colgajo omental, coloque un cerdo Yorkshire anestesiado de 12

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Descelularización perfusión es una técnica novedosa para producir andamios todo hepática que conserva la composición del órgano de la matriz extracelular y la microarquitectura. Aquí, el método de preparación de andamios todo órgano con descelularización perfusión y posterior repoblación con hepatocitos se describe. Los injertos de hígado funcionales y trasplantables se pueden generar con esta técnica.

Descelularización y recelularización de hígados enteros

Un método para eliminar rápida y completamente los componentes celulares de un corazón porcino intacta a través de perfusión retrógrada se describe. Este método rinde un sitio específico cardíaco extracelular andamio matriz que tiene el potencial para su uso en diversas aplicaciones clínicas.

Procedimiento para descelularización de corazón porcino por perfusión coronaria retrógrada

La descelularización de todo el órgano produce andamios biológicos naturales que pueden ser utilizados para la medicina regenerativa. Se presenta la descripción de un modelo de regeneración pulmonar en primates no humanos en el que se descelularizan pulmones completos y luego se siembran con células madre adultas y células endoteliales en un biorreactor que facilita la circulación vascular y la ventilación de medios líquidos.

Descelularización y recelularización pulmonar de primates no humanos mediante un biorreactor especializado de órganos grandes

A continuación, presentamos un protocolo para generar ingeniería tisular injertos de vasos que son funcionales para el injerto en ratones por doble siembra de células madre pluripotentes inducidas parcialmente (PIPSC) - deriva células musculares lisas y PIPSC - células endoteliales derivadas de un biorreactor andamio buque descelularizado.

Generación y Acrecentamiento de buques de ingeniería de tejidos en un modelo de ratón

Hasta la fecha, los defectos de tejido grueso se reconstruyen típicamente mediante la aplicación de colgajos de tejido autólogo o tejidos de ingeniería. En este protocolo, presentamos un nuevo método para diseñar un colgajo de tejido vascularizado con un pedículo autólogo, para que sirva como sustituto de los colgajos autólogos.

Diseñado vascularizado colgajo de músculo

Las técnicas presentadas para la recolección de hígado, la canulación y la perfusión utilizando nuestro dispositivo patentado permiten sofisticadas configuraciones de perfusión para mejorar los experimentos de descelularización y recelularización en hígados de rata.

Procedimiento para Descelularización de rata hígados en un dispositivo de perfusión oscilante presión

El presente protocolo describe el modelo de colgajo fascio-cutáneo porcino y su uso potencial en la investigación de tejidos compuestos vascularizados.

Un modelo confiable de colgajo fascio-cutáneo porcino para estudios de bioingeniería de aloinjertos compuestos vascularizados

Describimos la técnica quirúrgica y el proceso de descelularización para extremidades posteriores de ratas compuestas. La descelularización se lleva a cabo utilizando dodecil sulfato de sodio de baja concentración a través de un sistema de perfusión de máquina ex vivo .

Obtención y descelularización de extremidades posteriores de ratas utilizando un biorreactor basado en perfusión ex vivo para alotrasplante compuesto vascularizado

Este protocolo presenta la configuración y el funcionamiento de un biorreactor impreso en 3D recientemente desarrollado para el cultivo ex vivo de vasos sanguíneos en perfusión. El sistema está diseñado para ser fácilmente adoptado por otros usuarios, práctico, asequible y adaptable a diferentes aplicaciones experimentales, como biología básica y estudios farmacológicos.

Ex Vivo Cultivo de perfusión de grandes vasos sanguíneos en un biorreactor impreso en 3D

El protocolo describe un modelo porcino de alta fidelidad de trasplante cardíaco después de la donación después de la muerte circulatoria utilizando la perfusión ex vivo del aloinjerto.

Un modelo porcino de alta fidelidad de trasplante ortotópico de corazón después de la donación después de la muerte circulatoria

Este protocolo describe la técnica quirúrgica para la extracción de un modelo de colgajo perforante humano basado en el pedículo profundo de la arteria epigástrica inferior, destinado a la investigación experimental.

Un modelo experimental de colgajo DIEP humano para investigar estrategias de preservación de aloinjertos compuestos vascularizados y colgajos libres

Aprende la descelularización por perfusión de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor personalizado. Esta técnica versátil facilita la ingeniería de tejidos para aplicaciones en cirugía reconstructiva.

Obtención y perfusión-descelularización de colgajos vascularizados porcinos en un biorreactor de perfusión personalizado

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