Obtención y descelularización de extremidades posteriores de ratas utilizando un biorreactor basado en perfusión ex vivo para alotrasplante compuesto vascularizado

Hemos establecido un modelo animal pequeño para la descelularización de una extremidad. Esto es útil para facilitar la investigación de prueba de concepto sobre la decelularización de tejidos compuestos vascularizados. Los regímenes de inmunosupresión son una de las principales limitaciones en el alotrasplante compuesto vascularizado.

La inmunogenicidad tisular puede reducirse mediante la descelularización. Para comenzar, haga una incisión en la piel con una cuchilla quirúrgica número 10 a lo largo del ligamento inguinal, moviéndose de una dirección lateral a medial, mientras sostiene la piel circundante con pinzas Adson. Cuando la grasa subyacente está expuesta, use una disección roma para diseccionar cuidadosamente a través de la grasa y localizar los vasos epigástricos superiores.

Usando microtijeras, diseccionar proximalmente y exponer el nervio femoral, la arteria y la vena subyacentes a nivel del ligamento inguinal. Bajo un microscopio de disección, identifique los vasos femorales y diseccione la arteria y la vena proximalmente usando fórceps finos para obtener suficiente longitud de los puntos de bifurcación de la red arterial. Luego, liga la vena femoral y la arteria por separado usando suturas 6-0.

A continuación, realice una disección circunferencial alrededor del resto de la extremidad posterior sin interrumpir los vasos femorales ligados, y transecte el hueso femoral a la mitad de la longitud con un cortador de hueso. Para aislar completamente la extremidad posterior, transecto los vasos femorales ligados distales a las ligaduras usando microtijeras y canulación la arteria femoral usando un angiocatéter de calibre 24 bajo el microscopio de disección. Luego, enjuague con solución salina heparinizada hasta que se observe una salida clara de la vena femoral.

Asegure la cánula atando una sutura alrededor del vaso canulado en otra sutura distalmente alrededor de la cánula misma, asegurando que la cánula se coloque proximalmente para evitar el bloqueo de los puntos de bifurcación. Después, sumerja las extremidades posteriores y PBS adquiridas hasta la descelularización. Para construir el biorreactor, coloque la cámara esterilizada y atornille tres llaves de paso de tres vías de un solo uso en las líneas de entrada, salida y reposición, asegurándose de que la llave de paso para el puerto de reposición esté tapada en sus dos puertos restantes para evitar fugas.

Fije los tubos de silicona fabricados previamente a las llaves de paso en las líneas de entrada y salida. Luego, conecte el tubo peristáltico a los tubos de silicona. Después de asegurar el cassette en el tubo peristáltico, colóquelo en la bomba peristáltica.

A continuación, conecte uno de los tubos de silicona al extremo del tubo peristáltico de la línea de salida desde el paso anterior. En el otro extremo, conectar una pipeta serológica de un mililitro y volver a suspender el extremo unido con una pipeta serológica en el matraz del depósito de residuos. A continuación, suspender el extremo del tubo conectado a la pipeta serológica en el depósito de detergente e inmediatamente sellar la abertura del matraz del depósito de detergente con parafilm.

Agregue 0.25% SDS del frasco de vidrio de un litro en la cámara del biorreactor a nivel medio. Luego, tome la extremidad posterior adquirida con pinzas Adson y suspendala en la cámara del biorreactor con cuidado. Usando dos pares de pinzas Adson, guíe la porción canulada de la extremidad posterior hacia la línea de entrada mientras sostiene la cánula con un par de fórceps.

Use el otro par de pinzas para torcer y asegurar la línea de entrada a la cánula. Una vez asegurado, agregue más 0.25% SDS del frasco de vidrio de un litro para sumergir completamente la extremidad según sea necesario, asegurando que el puerto de salida también esté sumergido en el depósito del biorreactor y se mantenga un flujo de salida constante. Luego, conecte un filtro de jeringa de un solo uso al puerto de ventilación en la tapa de la cámara del biorreactor y asegure la tapa del biorreactor, asegurándose de que la cámara esté sellada desde todos los lados.

Para eliminar el aire del tubo y cebar el circuito de perfusión, use una nueva jeringa de 10 mililitros de un solo uso para extraer detergente del depósito de detergente utilizando una llave de paso de tres vías en la línea de entrada. Una vez extraído, use el mismo líquido para insertarlo en la llave de paso de tres vías en la línea de salida. A continuación, presione y asegure los casetes con el tubo en la bomba peristáltica.

Luego, encienda la bomba peristáltica con el botón de encendido. En la pantalla de la bomba peristáltica, continúe con la segunda pestaña usando la tecla de flecha para establecer la velocidad de perfusión para el primer canal con el caudal de entrada como modo de entrega, y ajuste la velocidad de perfusión en un mililitro por minuto, asegurando que la dirección del flujo sea correcta de acuerdo con la configuración del aparato. Calibre la bomba peristáltica para garantizar que la cantidad de fluido suministrado a través de la línea de entrada y/o tomado de la línea de salida fluya constantemente entre las dos, asegurando que la identificación de la tubería esté ajustada a 1,85 milímetros.

Comience la descelularización a través de la perfusión de la máquina a un mililitro por minuto para las líneas de entrada y salida presionando el botón de encendido en el teclado. Controle y asegúrese de que el flujo sea continuo tanto en las líneas de entrada como en las de salida. Usando 1 litro de 0.25% STS, reponga el depósito del biorreactor a través del puerto de reposición según sea necesario.

Luego, busque una apariencia translúcida blanca del tejido, que aparecerá para el día cinco, lo que indica la descelularización de las extremidades posteriores de la rata. Tras la confirmación de la descelularización, sustituir el depósito de detergente por el PBS y el depósito antibiótico-antimicótico al 1%, y sellar la abertura del matraz con parafilm. Comience PBS y perfusión antibiótico-antimicótico al 1% a un mililitro por minuto, y continúe durante dos días.

Reemplace el PBS y el depósito de antibióticos-antimicóticos al 1% con 200 mililitros de ácido parásito al 0,1%, depósito de etanol al 4% y comience la perfusión a un mililitro por minuto durante dos horas. Debajo de un gabinete de bioseguridad, desconecte la extremidad posterior de la línea de entrada usando dos pares de pinzas Adson estériles con un par de pinzas para torcer la línea de entrada y el otro sosteniendo la cánula, asegurándose de que la cánula no se tire para evitar la decanulación. Guarde la extremidad en un frasco de vidrio de 500 mililitros que contenga PBS y 1% de antibiótico-antimicótico a 4 grados centígrados hasta que se vuelva a usar.

Tanto la arteria femoral descelularizada como la vena mostraron pérdida de contenido nuclear en todas las capas y tejido conectivo circundante, dada la falta de núcleos teñidos de azul presentes en los vasos nativos. La túnica íntima media y la adventicia tanto de la vena femoral como de las arterias se mantuvieron en los vasos descelularizados. El nervio femoral mostró preservación de la estructura del tejido, incluyendo el endoneuro.

El hueso mostró retención estructural general con pérdida de núcleos teñidos de osteocitos, y de las capas circundantes de endosteum y periostio después de la descelularización. La piel mostró una pérdida de células de la epidermis y la dermis. La dermis mostró fibras de colágeno retenidas similares al tejido nativo de la piel.

Por último, la vista transversal del músculo esquelético mostró pérdida de núcleos ubicados en las periferias del endomisio. El contenido de miofibrillas permaneció retenido dentro de los respectivos fascículos después de la descelularización. También se realizó la cuantificación de ADN con PicoGreen, donde el contenido de ADN se redujo significativamente en los vasos femorales, el nervio, la piel, los músculos y los huesos.

Siguiendo este protocolo, la extremidad descelularizada puede caracterizarse aún más. Esto implica examinar la matriz extracelular utilizando métodos histológicos y bioquímicos, y mediante la evaluación vascular en el uso de imágenes. El tallo descelularizado también se puede recelularizar utilizando células específicas de tejido.