Visualización de la dinámica de acoplamiento de actina y microtúbulos in vitro mediante microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF)

A pesar de muchos ejemplos de coordinación, la mayoría de los estudios examinan las proteínas de actina o microtúbulos individualmente. Este método permite la visualización de ambos polímeros dinámicos en una sola reacción. Esta técnica permite al usuario evaluar diversas proteínas reguladoras para propiedades emergentes que solo podrían verse con versiones dinámicas de actina y microtúbulos.

Esta técnica se puede ampliar para incluir lípidos o extractos para acercarse a la construcción de una célula sintética. Comience por descongelar las alícuotas de polvos de PEG-Silano y Biotina-PEG-Silano, y disolver los polvos de PEG en etanol al 80% para generar las soluciones de almacenamiento de recubrimiento de 10 miligramos por mililitro mPEG-Silano y de dos a cuatro miligramos por mililitro de Biotina-PEG-Silano. Retire el resbalón de la cubierta limpia del almacenamiento de etanol con fórceps.

Secar con gas nitrógeno y almacenar en una placa de Petri limpia. Cubra los recubiertos de la cubierta con 100 microlitros de solución de recubrimiento e incube a 70 grados centígrados durante al menos 18 horas o hasta su uso. Corte 12 tiras de cinta de doble cara con doble respaldo a una longitud de 24 milímetros.

Retire un lado del soporte de la cinta y fije trozos de cinta adyacentes a las seis ranuras presentes en una cámara de imágenes limpia. Retire la segunda pieza de soporte de cinta para exponer el lado pegajoso de la cinta a lo largo de cada ranura de la cámara y coloque la cinta adhesiva de la cámara hacia arriba sobre una superficie limpia. Mezcle las soluciones de resina epoxi y endurecedor una a una en un bote de pesaje pequeño, y use una punta P1000 para colocar una gota de epoxi mixto entre las tiras de cinta al final de cada ranura de la cámara de imágenes.

Luego, coloque la cámara, la cinta o el lado epoxi hacia arriba, sobre una superficie limpia. Retire un recubierto de la cubierta recubierta de la incubadora de 70 grados Celsius y enjuague las superficies recubiertas y no recubiertas de los resbalones de la cubierta con agua destilada doble seis veces. Seque con gas nitrógeno filtrado y luego fije a la cámara de imágenes con el recubrimiento deslizante de la cubierta hacia el lado hacia la cinta.

Utilice una punta de pipeta P200 o P1000 para aplicar presión sobre la interfaz de vidrio con cinta adhesiva para garantizar un buen sellado entre la cinta y el deslizamiento de la cubierta. Incube las cámaras ensambladas a temperatura ambiente durante al menos cinco a 10 minutos para permitir que el epoxi selle completamente los pocillos de la cámara antes de su uso. Las cámaras de perfusión caducan dentro de las 12 a 18 horas posteriores al montaje.

Utilice una bomba de perfusión e intercambie secuencialmente soluciones de acondicionamiento en la cámara de perfusión haciendo fluir 50 microlitros de 1% BSA para cebar la cámara de imágenes. Retire el exceso de amortiguación del depósito de ajuste de bloqueo de señuelo. Luego, fluya 50 microlitros de 0.005 miligramos por mililitro de estreptavidina e incube durante uno o dos minutos a temperatura ambiente.

Retire el exceso de amortiguación del depósito. Flujo de 50 microlitros de 1%BSA para bloquear la unión inespecífica e incubar durante 10 a 30 segundos. Retire el exceso de amortiguación del depósito.

A continuación, fluya 50 microlitros de tampón TIRF cálido 1x y luego 50 microlitros de semillas de microtúbulos estabilizados y 50% biotinilados diluidos en 1x tampón TIRF. Configure el escenario o el dispositivo de calentamiento objetivo para mantener una temperatura de 35 a 37 grados Celsius durante 30 minutos antes de obtener imágenes de la primera reacción bioquímica. Luego, establezca el intervalo de adquisición en cada cinco segundos durante 15 a 20 minutos.

A continuación, establezca las exposiciones láser 488 y 647 a 50 a 100 milisegundos al 5% al 10% de potencia ajustando primero la reacción de polimerización para iniciar el ensamblaje del filamento de actina. Adquiera las imágenes a 647 nanómetros y realice los ajustes apropiados. Luego, ajuste la reacción de polimerización en un segundo pozo de perfusión acondicionado para iniciar el ensamblaje de microtúbulos.

Visualice a 488 nanómetros y realice los ajustes adecuados. Combine tres microlitros de 10 micromolares 488 tubulina con la alícuota de 7,2 microlitros de 100 micromolares de tubulina sin etiquetar fluorescentemente no más de 15 minutos antes de su uso. Luego, combine tres microlitros de actina diluida relacionada con la biotina en volúmenes apropiados de actina fluorescentemente sin etiquetar y etiquetada, de modo que la mezcla final sea de 12.5 actina total micromolar con una etiqueta fluorescente del 10% al 30%.

Prepare la mezcla de citoesqueleto combinando dos microlitros de la mezcla de actina micromolar 12.5 con la mezcla de stock de tubulina no más de 15 minutos antes de la toma de imágenes. Conservar en hielo hasta su uso. Prepare la mezcla de reacción de proteínas combinando todos los demás componentes y proteínas experimentales, incluidos 2x tampón TIRF, anti blanqueador, nucleótidos, tampones y proteínas accesorias.

Incubar la mezcla de citoesqueletos y la mezcla de reacción de proteínas por separado a 37 grados Celsius durante 30 a 60 segundos. Para iniciar la reacción, agregue el contenido de la mezcla de reacción de proteínas a la mezcla de citoesqueletos y mézclela. Flujo de 50 microlitros de la mezcla de reacción que contiene 1x tampón TIRF complementado con 15 tubulina libre de micromolares, un GTP milimolar, monómeros de actina micromolares de 0,5 y volúmenes apropiados de controles tampón a la cámara de perfusión.

Grabe una película de lapso de tiempo utilizando un software de microscopio para adquirir cada cinco segundos durante 15 a 20 minutos. Acondicionar un nuevo pozo de perfusión y sustituir el volumen tampón por la proteína reguladora de interés y los controles tampón. Adquirir para evaluar las proteínas reguladoras para las funciones emergentes de los microtúbulos de actina.

En estas imágenes se muestran mediciones de ejemplo de microtúbulos y dinámica de filamentos de actina. La proyección de tiempo promedio del canal de tubulina visualiza eficientemente las longitudes totales de microtúbulos para los escaneos de línea utilizados para generar las gráficas de Kymograph. Las líneas punteadas negras corresponden a los dos Kymographs de ejemplo de los microtúbulos dinámicos.

Las fases de crecimiento y desmontaje de los microtúbulos se muestran en cada Kymograph. Aquí se muestran dos montajes de imágenes de lapso de tiempo de ejemplo que representan filamentos de actina individuales polimerizando activamente. Las tasas de elongación se calculan como la pendiente de las gráficas de la longitud de los filamentos de actina a lo largo del tiempo por actina micromolar.

Por lo tanto, se debe aplicar un factor de corrección de dos a las reacciones de actina micromolar de 0,5 para comparar las tasas típicamente determinadas a la concentración de actina micromolar. Ejemplos de cinco filamentos se muestran aquí. Aquí se muestra la fluorescencia de reflexión interna total, o imágenes TIRF de los microtúbulos dinámicos en filamentos de actina polimerizando en ausencia o presencia de 250 nanomolares Tau.

Las líneas punteadas azules y las flechas marcan una línea que se dibujó para las gráficas de escaneo de línea correspondientes a cada condición. La superposición entre los microtúbulos en las regiones de actina se puede puntuar en un punto de tiempo establecido por área. Las proteínas citoesqueléticas, específicamente la actina, los microtúbulos y sus reguladores son muy sensibles a los ciclos de congelación / descongelación.

Para mayor consistencia y éxito, use proteínas altamente puras y almacenadas adecuadamente.