Modelo experimental de inmunoterapia de melanoma utilizando vacunación tumoral con una citocina hematopoyética

Este protocolo proporciona un modelo clínico de inmunoterapia de tumores sólidos y una plataforma de investigación para estudiar la relación entre las células tumorales y las células inmunes infiltrantes. Esta vacuna contra tumores basada en células es conveniente, fácil de usar y se puede combinar con otras modalidades terapéuticas, como el bloqueo del punto de control, para lograr un efecto aditivo o sinérgico que puede resultar en una inmunidad tumoral más potente y alta. Ayudando a demostrar el procedimiento estará Ann Balancio, una técnica de investigación de mi laboratorio.

Para comenzar, cultive células de melanoma B16-F10 en IMDM, que contengan 10% de FBS inactivo al calor, 2 milimolares de glutamina, 1 milimolar de piruvato de sodio, 1 milimolar de aminoácidos no esenciales MEM y 100 unidades por mililitro de penicilina y estreptomicina. Mantener la línea celular a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Siembra y cosecha las células B16-F10 como se describe en el texto manuscrito.

Retire el medio de cultivo y lave los matraces una vez con PBS. Aspirar PBS y añadir 5 mililitros de 0,25% de tripsina-EDTA, seguido de golpes fuertes en el borde del matraz de cultivo. Añadir 15 mililitros de medio de cultivo para neutralizar la tripsina-EDTA y verter el contenido del matraz en un tubo de centrífuga de 50 mililitros.

Lave la superficie del plato con 10 mililitros de PBS y vierta en el mismo tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar las células durante 5 minutos a 200 RCF. Deseche el sobrenadante y rompa la bolita celular golpeando con el dedo la parte inferior del tubo.

Agregue 10 mililitros fríos de PBS y pipetear suavemente la suspensión celular. Luego, cuente manualmente las células con un hemocitómetro. Mantenga las células en hielo antes de la inyección.

Implantar intradérmicamente 500, 000 células tumorales B16-F10 en 50 microlitros de PBS frío en el flanco izquierdo, utilizando una aguja de calibre 30. La dosis de células tumorales B16-F10 implantadas puede necesitar ser ajustada en un rango de 50, 000 a 500, 000 células para el desarrollo exitoso del tumor. Después de la implementación, mida la longitud y anchura del tumor tres veces por semana usando un calibrador digital electrónico.

Calcule el volumen del tumor y trate a los ratones con la vacuna tumoral cuando los tumores hayan alcanzado un tamaño de dos milímetros como se describe en el texto manuscrito. Usando un irradiador de rayos X configurado a 160 kilovoltios y 25 miliamperios, irradie las células a 150 dosis grises de rayos gamma. Contar y comprobar la viabilidad celular mediante tinción de azul de tripano antes de la inyección.

Inyectar por vía intradérmica a los ratones con 1 millón de células B16-Flt3L irradiadas en 50 microlitros de PBS frío en el mismo flanco que la implantación original del tumor. Aproximadamente a un centímetro del sitio del tumor primario en los días 3, 6 y 9 después de la implantación celular inicial. Marque los sitios de inyección de la vacuna con una pluma de color para distinguirlos del tumor primario.

Si inicialmente se implantaron 50, 000 células B16-F10, se recomienda realizar el tratamiento de la vacuna en los días 8, 11 y 14. Se extirpó quirúrgicamente el tumor con la piel de cada ratón sacrificado y se colocó en una placa de 24 pocillos con 1 mililitro de 10% FBS RPMI 1640 medio. Cortar los tumores en trozos pequeños en dos mililitros de tampón de digestión e incubar durante 25 minutos a 37 grados centígrados.

Agregue 10 mililitros de 10% FBS RPMI 1640 medio para detener la digestión. Transfiera las células a un filtro celular de 40 micrómetros utilizando una pipeta serológica de 25 mililitros. Luego use el émbolo de una jeringa de un mililitro para moler los tejidos.

Centrifugar las celdas a 500 RCF durante 5 minutos a 4 grados centígrados. Resuspender el pellet en 5 mililitros de medio específico de gradiente de densidad del 40% en PBS diluido a concentración 1x. Agregue la suspensión celular lentamente sobre 5 mililitros de medio específico de gradiente de densidad del 80% que contenga PBS.

Centrifugar a las celdas a 325 RCF con un ajuste de freno bajo durante 23 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, recoja cuidadosamente la capa de leucocitos en la interfaz entre el medio específico de gradiente de densidad del 40% y el 80%, y pásela a través de un filtro celular de 40 micrómetros. Centrifugar las celdas a 500 RCF durante 5 minutos a 4 grados centígrados.

Incubar el pellet en dos mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, agregue 10 mililitros de 10% FBS RPMI 1640 medio para apagar el tampón de lisis RBC. Centrifugar las células a 400 RCF durante 5 minutos a 4 grados centígrados.

Resuspender las células en 0,5 mililitros de medio RPMI 1640 al 10%FBS, y contar el número total de células antes de usarlas para su posterior análisis. Recolectar el bazo o los ganglios linfáticos de drenaje como controles para la estrategia de activación de subconjuntos de células inmunes mediante análisis de citometría de flujo. Siga el método de aislamiento celular descrito en el texto manuscrito.

Un punto negro visible de las células B16-F10 implantadas generalmente se observó en la superficie de la piel aproximadamente tres días después de la implantación del tumor. Los ratones fueron tratados con una vacuna tumoral tres, seis y nueve días después de que el nódulo tumoral había alcanzado o excedido el tamaño de dos milímetros. Se observó una reducción significativa del crecimiento tumoral en el grupo de ratones vacunados aproximadamente dos semanas después de la implantación del tumor.

Las células recolectadas de la capa de leucocitos contenían muchas células tumorales, lo que dificulta la definición fácil de la población de linfocitos. Por lo tanto, los esplenocitos se utilizaron en paralelo, para la activación adecuada de los subconjuntos de células inmunes intratumorales en el análisis de citometría de flujo. Las estrategias de compuerta de CD103 positivo, CD11C positivo DC, CD8 positivo, CD4 positivo y Treg se trazaron junto con la matriz de compensación.

También se proporcionaron datos representativos de las cuentas adquiridas y la frecuencia de cada población. CD intratumoral CD103 positivo, CD11C positivo de ratones vacunados, mostró una expresión significativamente elevada del ligando coestimulador CD86. Los ratones vacunados también mostraron un aumento en el tumor infiltrante CD8 positivo y CD4 positivo, células Foxp3 negativas, así como en CD8 positivo granzima B y interferón gamma positivo CTL.

Mantenga una distancia suficiente entre el tumor primario y la vacuna contra el tumor. Esta separación física es fundamental para evitar la posible fusión entre los dos implantes tumorales.