Name: Visualización de la localización subcelular de una proteína en el corazón utilizando inmunoetiquetado mediado por puntos cuánticos seguido de microscopía electrónica de transmisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a visualizar la localización subcelular de proteínas en tejido cardíaco de ratón mediante inmunoetiquetado con puntos cuánticos y microscopía electrónica de transmisión. Este protocolo permite obtener imágenes de alta resolución para estudiar funciones proteicas.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud: R01HL145753, R01HL145753-01S1, R01HL145753-03S1 y R01HL152723; Premio LSUHSC-S CCDS Finish Line, Premio de Investigación COVID-19 y Premio de Investigación LARC a MSB; LSUHSC-S Malcolm Feist Cardiovascular and AHA Postdoctoral Fellowship to CSA (20POST35210789); y LSUHSC-S Malcolm Feist Pre-doctoral Fellowship to RA.

Los procedimientos de manejo de animales en este protocolo cumplieron con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Octava Edición, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Estatal de Louisiana-Shreveport. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos de seis meses de edad con antecedentes de FVB / N. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales). Los ratones utilizados fueron alojados en un ambiente bien regulado en jaulas que permiten un ciclo de luz-oscuridad de 12 h, provistos de agua y una dieta regular de comida ad libitum, y fueron atendidos de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio. El proceso general se ilustra en la Figura 1.
1. Preparación de animales
<ol><li>Anestesiar a los ratones usando isoflurano al 3%. Abra el pecho haciendo una incisión horizontal en la región por encima del abdomen medio y tirando de la piel. Con cuidado, haga otra incisión para abrir la cavidad torácica sin perforar ningún otro órgano21,22,23.<ol><li>Perfundir24 el corazón a través del ápice primero, y luego el ventrículo derecho usando glutaraldehído frío al 3% en solución cardiopléjica (50 mM KCl, dextrosa al 5% en PBS, ver Archivo Suplementario 1) durante 2 min para asegurar una relajación miocárdica completa.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfundir el corazón usando glutaraldehído al 3% helado en 0.1 M de tampón de cacodilato de sodio (pH 7.4, paso 2.1.1) durante otros 2 minutos. Usando la presión de gravedad, use una aguja de 25 G 5/8" para introducir los fijadores en el corazón. Inmediatamente después de que el corazón comience a llenarse con el fijador, levante el ápice del corazón y corte los vasos debajo a 1-2 mm del corazón para aliviar la presión y permitir que los líquidos drenen.</li>
	<li>Diseccionar el corazón, eliminar las aurículas24 y dejar caer los ventrículos en glutaraldehído helado al 3% / cacodilato de sodio 0.1 M en una placa de Petri. Haga un corte de mariposa después de 30-60 minutos de fijación y colóquelo en una placa de Petri que contenga 3% de glutaraldehído/cacodilato (ver Tabla de materiales). Picar el corazón con una cuchilla quirúrgica en cubos pequeños de 1 mm3 mientras está en solución de glutaraldehído/cacodilato.</li>
	<li>Fijar/sumergir el tejido cardíaco disecado en solución de glutaraldehído/cacodilato durante 24 h a 4 °C.</li>
</ol>2. Procesamiento del tejido cardíaco
<ol><li>Después de 24 h de fijación, lavar los tejidos en 0,1 M de tampón de cacodilato de sodio durante 20 min.<ol><li>Prepare el tampón de cacodilato 0,1 M siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Para preparar tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, prepare un stock de tampón de cacodilato de sodio 1 M disolviendo cacodilato de sodio (21,4 g) y de solución de cloruro de calcio al 1% (3 ml) en 90 ml de agua destilada. Suba el volumen de la solución a 100 ml agregando el agua destilada. Revuelva bien la solución y déjela toda la noche para disolver el soluto.</li>
			<li>A continuación, tome 10 ml de solución madre de cacodilato de sodio 1 M y agréguela a 80 ml de agua destilada. Ajuste el pH a 7.4 usando HCl y aumente el volumen hasta 100 ml agregando agua destilada.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Repita el lavado en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M durante otros 20 minutos. Retire los tejidos del tampón de cacodilato de sodio y sumérjalos en una solución de tetróxido de osmio al 2% durante 4 h a temperatura ambiente. Este proceso se llama osmicación.<ol><li>Prepare una solución de tetróxido de osmio al 2% siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Para preparar una solución de tetróxido de osmio al 2%, tome una solución de tetróxido de osmio al 4%, 4 ml (consulte la tabla de materiales), una solución madre de cacodilato sódico al 1 m (0,8 ml) y agua destilada (3,2 ml) para hacer un total de 8 ml de solución. NOTA: Todo este proceso y los pasos a partir de aquí deben llevarse a cabo en la campana extractora.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Después de la osmicación, sumerja los tejidos en una solución de acetato de sodio al 2% durante 10 minutos a temperatura ambiente.<ol><li>Prepare una solución de acetato de sodio al 2% disolviendo 4 g de acetato de sodio en 20 ml de agua destilada.</li>
	</ol></li>
	<li>A continuación, sumerja los tejidos en una solución de acetato de uranilo al 2% durante 1 h a temperatura ambiente.<ol><li>Prepare una solución de acetato de uranilo al 2% disolviendo 4 g de acetato de uranilo en 20 ml de agua destilada.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de la tinción de acetato de uranilo, deshidratar los tejidos secuencialmente a través de los alcoholes clasificados y la acetona en el orden mencionado en el Archivo Suplementario 1.</li>
</ol>3. Incrustación del tejido cardíaco
<ol><li>Incruste los tejidos deshidratados en resina epoxi de baja viscosidad siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Para hacer resina epoxi de baja viscosidad, mezcle 10.24 ml de monómero epoxi de dióxido de ciclohexeno de vinilo (ERL 4221), 6.74 ml de éter diglicílico de polipropilenglicol (DER 732) y 30.05 ml de anhídrido succínico de nonenil (NSA) (consulte la Tabla de materiales) en un tubo de 50 ml. Revuelva bien la suspensión a mano durante 2 min.</li>
		<li>Agregue 18 gotas de acelerador epoxi de 2-dimetilaminoetanol (DMAE, consulte la Tabla de materiales) y revuelva la suspensión para mezclar bien los componentes.</li>
		<li>Impregnar los tejidos en resina epoxi en la siguiente secuencia de mezcla.<ol><li>Sustituir la acetona 100% por resina 1:1: suspensión de acetona y sumergir los tejidos en ella durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
			<li>Reemplace la resina 1:1: suspensión de acetona por resina 6:1: suspensión de acetona y sumerja los tejidos en ella durante 3 h.</li>
			<li>Finalmente, reemplaza la resina 6:1: suspensión de acetona por suspensión 100% resina y deja los tejidos sumergidos en ella durante toda la noche a temperatura ambiente.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Poner los tejidos en resina fresca en micromoldes de 8 mm (ver Tabla de materiales) y curar los tejidos incrustados a 70 °C durante la noche. NOTA: Asegúrese de que la resina sea dura pero no quebradiza después del curado.</li>
</ol>4. Sección de tejido con un ultramicrotomo
<ol><li>Recorte los bloques de resina con el tejido a no más de 1 mm antes de montarlos en el ultramicrótomo (consulte la Tabla de materiales). Coloque el molde con la mayor precisión posible en el brazo segmentado del ultramicrotomo y avance manualmente el molde de muestra hacia el cuchillo de diamante.</li>
	<li>Corte las secciones a un grosor de 500 nm (media micra) con un cuchillo Histo (consulte la Tabla de materiales) y, utilizando la herramienta de bucle EM, recójalas y colóquelas en un portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos de vidrio en una placa caliente para la tinción azul de toluidina25 para encontrar el área de interés.</li>
	<li>Después de encontrar el área de interés, use un cuchillo Ultra 45 ° (consulte la Tabla de materiales) para producir secciones ultrafinas de oro pálido (100 nm). Coloque estas secciones ultrafinas en el lado opaco de una rejilla de cobre de malla 200.</li>
</ol>5. Tinción de la sección ultrafina del corazón
<ol><li>Comience la tinción desenmascarando el antígeno con una solución de grabado, es decir, una solución de metaperiodato de sodio al 5%.<ol><li>Prepare 500 μL de solución de metaperiodato de sodio al 5% (consulte la Tabla de materiales) en agua destilada. NOTA: Prepare la solución fresca antes de usar.</li>
		<li>Poner 20 μL de solución de metaperiodato de sodio en una película de parafina limpia. Coloque las rejillas completamente secas con secciones de tejido en la gota de la solución de grabado. NOTA: El lado opaco de la rejilla con la sección de tejido debe mirar hacia la solución de grabado.</li>
		<li>Deje la rejilla de sección en la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave la sección de tejido grabado colocándola en una gota de agua destilada durante 60 s.</li>
	<li>Bloquear los aldehídos residuales colocando las rejillas de sección en una gota de solución de glicina 0,05 M durante 10 min a temperatura ambiente. Seque los bordes de la rejilla en papel de filtro para eliminar la solución de glicina residual.<ol><li>Preparar solución de glicina 0,05 M (ver Tabla de materiales) disolviendo 3,75 mg de glicina en 1 ml de 1x PBS (pH 7,4).</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque las rejillas de sección en 10-20 μL de solución de bloqueo durante 25 min a temperatura ambiente. NOTA: Composición de la solución de bloqueo: 2 μL de suero normal de cabra al 1% (NGS) + 20 μL de BSA al 1% (concentración final: 10%) + 178 μL de 1x PBS (pH 7.4) para hacer un volumen final de 200 μL.</li>
	<li>Seque los bordes de la rejilla en papel de filtro y coloque la sección de la rejilla en el diluyente de anticuerpos para su acondicionamiento a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Incubar las secciones de rejilla con anticuerpo primario (Sigmar1 en este caso, ver Tabla de materiales; diluido 1:10 en diluyente de anticuerpos) durante 1 h 30 min en una cámara humidificada.</li>
	<li>Seque la rejilla y lave las secciones de la rejilla con diluyente de anticuerpos dos veces durante 5 minutos cada una.</li>
	<li>Incubar las secciones de la rejilla con anticuerpo secundario biotinilado (en este caso, anticuerpo secundario policlonal anti-conejo de cabra biotinilada, ver Tabla de materiales; diluido 1:10 en diluyente de anticuerpos) durante 1 h en una cámara humidificada.</li>
	<li>Seque la rejilla y lave las secciones de la rejilla con diluyente de anticuerpos dos veces durante 5 minutos cada una.</li>
	<li>Incubar las secciones de rejilla en QD conjugado con estreptavidina disponible comercialmente (QD655nm, ver Tabla de materiales; diluido 1:10 en diluyente de anticuerpos) durante 1 h en una cámara humidificada a temperatura ambiente. Evite la exposición a la luz cubriendo la cámara con papel de aluminio.</li>
	<li>Seque los bordes de la rejilla con papel de filtro y lave las secciones de la rejilla colocándolas en gotas de agua durante 2 minutos.</li>
	<li>Seque los bordes de la rejilla para que se sequen.</li>
</ol>6. Imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM)
<ol><li>Coloque las secciones ultrafinas en rejillas de cobre en un soporte de cuarteto de muestras y sujetarlas en una posición que permita la selección de rejillas en el haz de electrones.</li>
	<li>Inserte el portamuestras en la columna del microscopio y active el interruptor de la bomba para evacuar el goniómetro, seguido de la inserción completa del portamuestras en la columna del microscopio (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Ajuste el voltaje a 80 kV antes de generar el haz para la observación de imágenes.</li>
	<li>Enfoque bien en el área deseada, capture la imagen con una cámara digital de alta velocidad y guarde el archivo en .tif formato. NOTA: El ajuste del microscopio para capturar la imagen en este estudio fue voltaje de aceleración o voltaje de alta tensión de 80 kV y un aumento de 20,000x.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En el presente estudio, se utilizó inmunomarcaje mediado por QD para mostrar claramente la localización subcelular de Sigmar1. Usando QD, la localización de Sigmar1 en la membrana mitocondrial, especialmente la membrana mitocondrial interna, se representó en el tejido cardíaco. Además, también se encontró que Sigmar1 estaba localizado en retículo sarcoplásmico/endoplásmico (S/ER) y lisosomas a nivel ultraestructural, como se muestra en la Figura 2A-D.
Un paso crítico en este protocolo es el paso de grabado o desenmascaramiento de antígenos utilizando una solución de metaperiodato de sodio altamente concentrada para desenmascarar el antígeno después de la fijación y osmicación de glutaraldehído. Este protocolo utilizó un tratamiento único con una alta concentración (5%) de metaperiodato de sodio durante 30 min a temperatura ambiente. Se necesita un cuidado adicional en este paso, ya que una mayor duración o mayor concentración para la incubación de metaperiodato de sodio dará como resultado la agregación de estructuras, la pérdida de la definición de membrana para los orgánulos y causará perforaciones en la sección, lo que dificultará la visualización de la proteína o la estructura. Alternativamente, también se puede usar una concentración más baja de solución de metaperiodato (3%) en dos pasos durante 30 minutos en lugar de metaperiodato al 5%. Los estudios han demostrado que esta opción exhibe resultados similares a los de la solución de metaperiodato al 5% para la incubación de un paso y 30 minutos. Sin embargo, una solución de metaperiodato al 3% durante 30 min de incubación durante dos veces proporciona un mejor control sobre el proceso26,27,28. Inicialmente, este protocolo utilizó la incubación de las secciones con solución de metaperiodato al 10% durante 30 min. Sin embargo, debido a demasiadas perforaciones creadas en la sección de tejido por esta concentración, la concentración final y la duración de la incubación de la solución de metaperiodato se disminuyeron y se optimizaron al 5% durante 30 min.
Otro paso requirió la optimización del tiempo de fijación con glutaraldehído. La fijación subóptima de los tejidos da como resultado un etiquetado QD inadecuado, mientras que la fijación excesiva de los tejidos da como resultado un etiquetado no específico más alto. Por lo tanto, se debe considerar cuidadosamente la determinación y titulación de un nivel óptimo de fijación tisular para el etiquetado adecuado y específico de las proteínas. En este método utilizando tejidos cardíacos, el tiempo de fijación con glutaraldehído se tituló utilizando 24 h y 48 h como puntos de tiempo. A partir de las imágenes de tinción de las secciones fijadas para ambos puntos temporales, se encontró que las secciones fijadas durante 24 h mostraron mejores resultados. Hasta la fecha, los nanocristales QD están disponibles en múltiples tamaños, incluidos 525, 565, 585, 605, 655 y 705 nm11,29. Cada uno de estos QD tiene sus propios espectros de emisión y emite fluorescencia a diferentes longitudes de onda. Además, estos QD disponibles comercialmente de diferentes tamaños muestran diferentes formas; por ejemplo, QD 525, 565 y 585 son virtualmente esféricos con diferentes tamaños, mientras que QD 605, 655 y 705 son irregulares de forma oblonga. De estos diferentes nanocristales QD, QD 525, 565 y 655 son fácilmente distinguibles entre sí11,29. Estas diferencias en los espectros y formas de emisión hacen de QD un gran candidato para el etiquetado múltiple de proteínas y la visualización por fluorescencia y microscopía electrónica. En este estudio, se utilizó un QD disponible comercialmente, QD 655, para etiquetar la proteína Sigmar1 para distinguirla de cualquier fondo no específico en las secciones teñidas.
Otra contraparte de QD para el etiquetado de proteínas en microscopía de alta resolución es la partícula de inmunooro. Las partículas de inmunooro se utilizan tradicionalmente para etiquetar proteínas para microscopía de alta resolución. Estas partículas de oro son altamente densas en electrones y fácilmente identificables en comparación con los nanocristales QD. Sin embargo, QD exhibe una mejor eficiencia con mejor penetración en los tejidos, mayor estabilidad y vida útil, y mejor retención de componentes ultraestructurales, lo que los convierte en un mejor candidato para el etiquetado de proteínas 4,5. QD también tiene una capacidad única para ser detectado por microscopía óptica y electrónica, lo que aumenta su valor sobre el etiquetado de inmunooro10.
Una limitación de este inmunomarcaje mediado por QD es el uso de tetróxido de osmio durante el procesamiento. El tetróxido de osmio se utiliza para aumentar la densidad electrónica, la conductividad y el contraste de estructuras de membrana biológicas menos densas en electrones y menos contrastantes 5,30. Sin embargo, el uso de tetróxido de osmio destruye instantánea e irreversiblemente la propiedad del espécimen para crear fluorescencia cuando se marca con QD6. Esto limita el uso de QD en microscopía de fluorescencia. Un enfoque alternativo que omita el uso de tetróxido de osmio será ventajoso para conservar las propiedades fluorescentes y, por lo tanto, la aplicación dual del inmunomarcado mediado por QD. Algunos de los modelos más nuevos de TEM tienen la opción de conectar el sistema de análisis de rayos X por dispersión de energía (EDX) que permite la identificación de la composición elemental de los materiales. Otra limitación del estudio es la falta de mapeo elemental de una muestra y análisis de imágenes utilizando EDX. Por lo tanto, los estudios futuros deben centrarse en el análisis EDX de los espectros QD para analizar la composición elemental.
El etiquetado QD de proteínas ha ganado mucha atención en los últimos tiempos. QD ofrece varias aplicaciones y ventajas tanto en la investigación biológica como en la terapéutica médica. QD al estar envuelto adicionalmente con ligando polidentado exhibe una mayor estabilidad manteniendo el rendimiento cuántico. Además, la encapsulación de QD con estos agentes biofavorables también aumenta su biodisponibilidad en los tejidos, lo que lo convierte en un buen candidato para su posible aplicación en la detección de tumores, imágenes de células vivas, administración de fármacos e imágenes de tejidos 3,31,32.

El cuerpo humano está compuesto de muchas proteínas responsables de numerosas funciones corporales. La función de las proteínas depende en gran medida de su localización en el órgano y los orgánulos celulares. Varias técnicas, incluyendo el fraccionamiento subcelular, la inmunofluorescencia y la extracción de proteínas mediada por detergente, se utilizan comúnmente para determinar la localización subcelular de la proteína 1,2. La microscopía con colorante inmunofluorescente es el método más utilizado entre estas técnicas. Sin embargo, los colorantes fluorescentes utilizados en esta técnica son menos estables y propensos al fotoblanqueo3. Otras técnicas involucraron microscopía de alta resolución para visualizar la proteína a nivel ultraestructural mediante inmunomarcaje de proteínas con nanocristales densos en electrones, metales pesados (oro, ferritina) o puntos cuánticos y seguidos visualizándolos mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM)4,5.
QD es un nanocristal semiconductor compuesto de compuestos metálicos semiconductores con propiedades de fotoluminiscencia controlables que tienen una gran importancia en los sistemas biológicos3. Los nanocristales QD se fabrican en un formato núcleo-cáscara donde un nanocristal se encapsula en la formación de nanocristales para asegurar su correcta estabilidad y funcionamiento. La combinación de nanocristales núcleo-cáscara comúnmente utilizada es CdSe/ZnS, CdSe/CdS CdSe/ZnSe, CdTe/CdS, CdTe/ZnS y CdTe/CdS/ZnS (núcleo/capa/cáscara)3. Entre estas combinaciones de nanocristales, CdSe/ZnS y CdSe/CdS son estudiadas más vigorosamente y utilizadas con frecuencia como conjugados secundariosde anticuerpos 3,6. Estas nanopartículas QD también poseen propiedades fluorescentes con diferentes espectros de excitación y emisión que los fluoróforos tradicionales. QD emplea la excitación de electrones de la banda de valencia a granel para exhibir mayores rendimientos cuánticos de fluorescencia en comparación con los fluoróforos tradicionales. La disposición de nanocristales de los metales semiconductores hace que el etiquetado mediado por QD sea más estable y resistente al fotoblanqueo6. Además, el núcleo nanocristalino en QD y su estructura cristalina permite que QD de diferentes tamaños tenga una amplia gama de espectros de absorción y picos de emisión muy estrechos7. Además, estas partículas QD son lo suficientemente grandes como para producir una alta densidad de electrones, lo que las hace útiles en técnicas de microscopía de alta resolución, incluida la microscopía electrónica de transmisión 5,8,9. Estos nanocristales QD también están disponibles comercialmente en múltiples tamaños con diferentes espectros y formas de emisión de fluorescencia, lo que los convierte en un gran candidato para el etiquetado con múltiples anticuerpos10,11.
La tecnología QD atrajo gran importancia en la investigación biológica debido a múltiples propiedades funcionales, incluido el uso en imágenes de células vivas, el estudio de los mecanismos de transporte en la célula, el transporte de membrana del movimiento de difusión de proteínas, la heterogeneidad funcional de las células y el marcado del orgánulo intracelular 3,12,13,14,15,16 . QD también es útil en el diagnóstico molecular para atacar y detectar tejidos cancerosos, caracterizar el perfil molecular y el estado inmune del tumor, y visualizar el cuerpo vítreo y las membranas epirretinianas 3,17,18. Además, QD también se puede utilizar en terapias médicas para tratar tumores malignos a través de terapia fotodinámica y anomalías oftálmicas mediante la administración de medicamentos a los ojos 3,17,18,19.
Utilizando estos nanocristales QD altamente útiles, el presente estudio determinó la localización subcelular de una proteína llamada receptor Sigma 1 (Sigmar1). Sigmar1 es una proteína chaperona molecular multitarea expresada ubicuamente. Extensos estudios centrados en la localización subcelular de Sigmar1 en diferentes tejidos y órganos reportaron una localización subcelular específica de células y tejidos que provoca una función molecular20. En diferentes células (neuronales, fotorreceptoras y células inmunes) y tejidos (hígado y cerebro) utilizando diferentes enfoques bioquímicos, los estudios informaron la localización de Sigmar1 en retículo endoplásmico (RE), membrana ER asociada a mitocondrias (MAM), envoltura nuclear, membrana plasmática, retículo nucleoplásmico, núcleo y mitocondrias. A pesar de todos estos estudios, la localización subcelular de Sigmar1 en el corazón permaneció desconocida20. Por lo tanto, la localización subcelular de Sigmar1 en el tejido cardíaco se determinó utilizando el inmunomarcaje mediado por QD seguido de imágenes TEM.

<table><tbody><tr><td>Rejilla de cobre de malla 200</td><td>Ted Pella</td><td>G200HH</td><td></td></tr><tr><td>Ratones machos de 6 meses con fondo FVB/N</td><td>Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona 100%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A949</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente</td><td>de anticuerpos Dako</td><td>S3022</td><td></td></tr><tr><td>anti-Sigmar1 anticuerpo</td><td>Señalización celular</td><td>61994S</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo IgG anti-conejo de cabra biotinilado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7389</td><td></td></tr><tr><td>BSAc (10%)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>25557</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal Xyl</td><td>Thermo fisher</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>DER 732C36AA10:C33</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>13010</td><td></td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante</td><td>diatome</td><td>Histo; Ultra 450</td><td></td></tr><tr><td>DMAE</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td>13300</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico</td><td>JEOL</td><td>JEOL-1400 Flash</td><td></td></tr><tr><td>ERL 4221</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>15004</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>Fisher Chemicals</td><td>A405P</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído 3%</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>16538-15</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13816</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico</td><td>Micromoldes Fisher Scientific</td><td>SA56</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Microtomo Ted Pella</td><td>10505</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Microsystem</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>NSA</td><td>Ciencias de Microscopía Electrónica</td><td>19050</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Genesse Scientific</td><td>16-101</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71640</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 Estreptavidina conjugada</td><td>Invitrogen Q10121MP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP334</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato de sodio</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Metaperiodato de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio dibásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Cuchilla quirúrgica (tamaño 10)</td><td>Aspen surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>TEM&nbsp; software de imagen</td><td>AMT-V700</td><td>AMT Sistemas</td><td></td>de</tr><tr><td>imagen TEM Cámara de imagen TEM</td><td>XR80 TEM series</td><td>AMT Sistemas</td><td></td>de imagen TEM</tr><tr><td>Solución de azul O de toluidina (0,5%)</td><td>Fisher Scientic</td><td>S25612</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de uranilo</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización de la localización subcelular de una proteína en el corazón utilizando inmunoetiquetado mediado por puntos cuánticos seguido de microscopía electrónica de transmisión

Visualizing Subcellular Localization of a Protein in the Heart Using Quantum Dots-Mediated Immuno-Labeling Followed by Transmission Electron Microscopy

La localización subcelular es crítica para delinear la función adecuada y determinar los mecanismos moleculares de una proteína en particular. Se utilizan varias técnicas cualitativas y cuantitativas para determinar la localización subcelular de las proteínas. Una de las técnicas emergentes para determinar la localización subcelular de una proteína es el inmunomarcaje mediado por puntos cuánticos (QD) de una proteína, seguido de imágenes de ellas con microscopía electrónica de transmisión (TEM). QD es un nanocristal semiconductor con una doble propiedad de estructura cristalina y alta densidad de electrones, lo que los hace aplicables a la microscopía electrónica. Este método actual visualizó la localización subcelular de la proteína del receptor Sigma 1 (Sigmar1) utilizando QD-TEM en el tejido cardíaco a nivel ultraestructural. Pequeños cubos de las secciones de tejido cardíaco de un ratón de tipo salvaje se fijaron en glutaraldehído al 3%, posteriormente osmicados, teñidos con acetato de uranilo, seguidos de deshidratación secuencial con etanol y acetona. Estas secciones de tejido cardíaco deshidratado se incrustaron en resinas epoxi de baja viscosidad, se cortaron en secciones delgadas de 500 nm de espesor, se colocaron en la rejilla y posteriormente se sometieron a desenmascaramiento de antígenos con metaperiodato de sodio al 5%, seguido de enfriamiento de los aldehídos residuales con glicina. Los tejidos fueron bloqueados, seguidos de incubación secuencial en anticuerpo primario, anticuerpo secundario biotinilado y QD conjugado con estreptavidina. Estas secciones teñidas se secaron con manchas y se obtuvieron imágenes a gran aumento utilizando TEM. La técnica QD-TEM permitió la visualización de la localización subcelular de la proteína Sigmar1 a nivel ultraestructural en el corazón. Estas técnicas se pueden utilizar para visualizar la presencia de cualquier proteína y localización subcelular en cualquier sistema de órganos.

La presente metodología QD-TEM visualizó la presencia de Sigmar1 y su localización en los compartimentos cardíacos subcelulares mediante la realización de un etiquetado QD dirigido anti-Sigmar1 en secciones cardíacas ultradelgadas de ratones adultos. Las imágenes QD marcadas con anti-Sigmar1 denso en electrones en membranas mitocondriales (internas y externas), lisosomas y la interfaz membrana-mitocondrial del retículo endoplásmico / retículo sarcoplásmico (ER / SR) (Figura 2A, B) se ilustraron con imágenes QD-TEM. Además, las secciones del corazón también se marcaron con IgG y QD de conejo como un control de isotipo para el anticuerpo primario de conejo anti-Sigmar1 (Figura 2C, D). Por lo tanto, la imagen QD-TEM destacó la localización de Sigmar1 endógeno y su enriquecimiento principalmente en los lisosomas y las membranas mitocondriales.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig01.jpg"> Figura 1: Ilustración esquemática que muestra los pasos secuenciales y los procedimientos utilizados para realizar QD-TEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64085/64085fig02.jpg"> Figura 2: Sigmar1 inmuno-marcado QD en tejidos cardíacos de ratones adultos . (A,B) Imágenes representativas de TEM que muestran Sigmar1 marcado QD en mitocondrias (membrana externa e interna), retículo endoplásmico asociado a mitocondrias (RE) / retículo sarcoplásmico (SR) membranas y lisosomas. (C,D) Imagen TEM de las secciones cardíacas del control del isotipo marcadas con QDs e IgG de conejo. Barra de escala: 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo complementario 1: Composición de PBS y otras soluciones utilizadas para la deshidratación tisular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64085/64085_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

El presente protocolo describe un método de inmunomarcaje de una proteína en las secciones del tejido cardíaco utilizando puntos cuánticos. Esta técnica proporciona una herramienta útil para visualizar la localización y expresión subcelular de cualquier proteína a nivel ultraestructural.

Visualización de la localización subcelular de una proteína en el corazón utilizando inmunoetiquetado mediado por puntos cuánticos seguido de microscopía electrónica de transmisión

The subcellular localization is critical to delineating proper function and determining the molecular mechanisms of a particular protein. Several ...

Determinar la localización subcelular de una proteína es fundamental para delinear su función adecuada y los mecanismos involucrados en ella. Este método puede ayudarnos a visualizar la localización subcelular de una proteína a nivel de ultraestructura. El inmunomarcaje mediado por puntos cuánticos es más estable, resistente al fotoblanqueo, tiene sus propios espectros de emisión, produce una alta densidad de electrones y muestra una mayor eficiencia y retención en los tejidos con una mejor penetración en los tejidos.Múltiples pasos del proceso, es decir, fijación, grabado, bloqueo y concentración óptima de puntos cuánticos, son pasos difíciles de optimizar. Es aconsejable probar múltiples puntos de tiempo y concentraciones de los reactivos utilizados. Otro desafío es manejar cuadrículas para las que solo funciona la paciencia y, por supuesto, la práctica.Demostrando el procedimiento estarán Chowdhury Abdullah, un becario postal, Naznin Remex, un estudiante graduado de mi laboratorio, y Brandon Hartman, supervisor de microscopía electrónica de nuestros servicios de microscopía electrónica. Después de anestesiar a los ratones y abrir la cavidad torácica, profundir el corazón usando glutaraldehído helado al 3% en 0.1 molar de tampón de cacodilato de sodio durante dos minutos. Use una aguja de calibre 25 de cinco por ocho pulgadas para introducir los fijadores en el corazón usando la presión de gravedad.Inmediatamente después de que el corazón comience a llenarse con el fijador, levante el ápice del corazón para aliviar la presión. Corte los vasos debajo a uno o dos milímetros del corazón y permita que los líquidos drenen. Disecciona el corazón.Retire las aurículas y deje caer los ventrículos en una placa de Petri que contenga glutaraldehído helado al 3% y cacodilato de sodio molar 0.1. Haga un corte de mariposa después de 30 a 60 minutos de fijación y coloque el ventrículo nuevamente en la placa de Petri. Picar el corazón con una cuchilla quirúrgica en cubos pequeños de un milímetro cúbico.Fijar y sumergir el tejido cardíaco disecado en solución de glutaraldehído y cacodilato durante 24 horas a cuatro grados centígrados. Después de 24 horas de fijación, lave el tejido en tampón de cacodilato de sodio molar 0.1 dos veces durante 20 minutos. Retire el tejido del tampón de cacodilato de sodio y sumérjalo en una solución de tetróxido de osmio al 2% durante cuatro horas a temperatura ambiente.Después de la osmicación, sumerja el tejido en una solución de acetato de sodio al 2% durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, sumerja el tejido en una solución de acetato de uranilo al 2% durante una hora a temperatura ambiente. Después de la tinción de acetato de uranilo, deshidrate el tejido secuencialmente a través de los alcoholes graduados y la acetona.Incruste el tejido deshidratado en resina epoxi de baja viscosidad como se describe en el manuscrito. Coloque el tejido en resina fresca en micromoldes de ocho milímetros y cure el tejido incrustado a 70 grados centígrados durante la noche. Después de encontrar el área de interés, usando un cuchillo ultra 45 grados, produzca secciones ultradelgadas de oro pálido.Coloque estas secciones ultrafinas en el lado opaco de una rejilla de cobre de malla 200. Comience la tinción desenmascarando el antígeno poniendo 20 microlitros de solución de grabado metaperiodato en una película de parafina limpia. Coloque la rejilla seca con secciones de tejido en la gota de la solución de grabado.Deje la rejilla de sección en la solución durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave las secciones de tejido grabadas colocándolas en una gota de agua destilada durante 60 segundos. Bloquee los aldehídos residuales colocando la rejilla de sección en una gota de solución molar de glicina 0,05 durante 10 minutos a temperatura ambiente.Seque los bordes de la rejilla en papel de filtro para eliminar la solución de glicina residual. Coloque la rejilla de sección en 10 a 20 microlitros de solución de bloqueo durante 25 minutos a temperatura ambiente. Seque los bordes de la rejilla en papel de filtro y coloque las secciones de la rejilla en diluyente de anticuerpos para acondicionarlo a temperatura ambiente durante 10 minutos.Incubar las secciones de rejilla con anticuerpos primarios durante una hora y 30 minutos en una cámara humidificada. Seque la rejilla y lave las secciones de la rejilla con diluyente de anticuerpos dos veces durante cinco minutos cada una. Incubar las secciones de rejilla con anticuerpo secundario biotinilado durante una hora en una cámara humidificada.Una vez que la rejilla esté seca, lave las secciones de la rejilla con diluyente de anticuerpos dos veces durante cinco minutos cada una. Incubar las secciones de rejilla en QD conjugado con estreptavidina disponible comercialmente durante una hora en una cámara a temperatura ambiente. Evite la exposición a la luz cubriendo la cámara con papel de aluminio.Después de secar los bordes de la rejilla con papel de filtro, lave las secciones de la rejilla colocándolas en gotas de agua durante dos minutos y seque los bordes de la rejilla para que se sequen. Inserte el portamuestras en la columna del microscopio y active el interruptor de la bomba para evaluar el goniómetro, seguido de la inserción completa del portamuestras en la columna del microscopio. Concéntrese bien en el área deseada.Capture la imagen con una cámara digital de alta velocidad y guarde el archivo en formato tif. Las membranas mitocondriales, los lisosomas y el retículo endoplásmico o la interfaz mitocondrial de la membrana del retículo sarcoplásmico mostraron la presencia de puntos cuánticos marcados con Sigmar1. Las secciones del corazón se visualizaron utilizando inmunoglobulina G de conejo y puntos cuánticos como control de isotipo para el anticuerpo primario de conejo anti-Sigmar1.Una cosa importante a considerar al trabajar en este protocolo es desenmascarar el tiempo para el antígeno. Si las secciones de tejido están grabadas durante demasiado tiempo, la solución de metaperiodato creará perforaciones en secciones delgadas de tejido. El etiquetado mediado por puntos cuánticos está ganando atención en la detección de tumores, el perfil molecular e inmunológico del tumor, y las imágenes de tejido allanando un nuevo camino para el diagnóstico médico.Los puntos cuánticos también son útiles en el tratamiento de tumores a través de terapias fotodinámicas y anomalías oftálmicas mediante la administración de medicamentos a los ojos.

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Visualización de la localización subcelular de una proteína en el corazón utilizando inmunoetiquetado mediado por puntos cuánticos seguido de microscopía electrónica de transmisión (Video) | JoVE Journal

Visualización de la localización subcelular de una proteína en el corazón utilizando inmunoetiquetado mediado por puntos cuánticos seguido de microscopía electrónica de transmisión

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