Name: Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Aprende a reconstituir ensamblajes de septina en membranas para estudiar propiedades biofísicas. Este protocolo versátil permite analizar cómo la geometría de la membrana influye en la organización de proteínas.

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Este trabajo fue apoyado por la subvención no. R01 GM-130934 y National Science Foundation (NSF) Grant MCB- 2016022. B.N.C, E.J.D.V. y K.S.C. fueron apoyados en parte por una subvención del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales bajo el premio T32 GM119999.

<ol><li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (1), 9-19 (2006).</li>
<li>Parthasarathy, R., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curvature+and+spatial+organization+in+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Curvature and spatial organization in biological membranes.</a> Soft Matter. 3 (1), 24-33 (2007).</li>
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<li>Pan, J., Dalzini, A., Song, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+and+phosphatidylethanolamine+lipids+exert+opposite+effects+on+membrane+modulations+caused+by+the+M2+amphipathic+helix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Cholesterol and phosphatidylethanolamine lipids exert opposite effects on membrane modulations caused by the M2 amphipathic helix.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1861 (1), 201-209 (2019).</li>
<li>Beckers, D., Urbancic, D., Sezgin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+nanoscale+hindrances+on+the+relationship+between+lipid+packing+and+diffusion+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Impact of nanoscale hindrances on the relationship between lipid packing and diffusion in model membranes.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 124 (8), 1487-1494 (2020).</li>
<li>Lee, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity+and+positive+feedback+enable+enzyme+kinetics+at+the+membrane+to+sense+reaction+size%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stochasticity and positive feedback enable enzyme kinetics at the membrane to sense reaction size.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (47), 2103626118(2021).</li>
<li>Ferhan, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoplasmonic+sensing+architectures+for+decoding+membrane+curvature-dependent+biomacromolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanoplasmonic sensing architectures for decoding membrane curvature-dependent biomacromolecular interactions.</a> Analytical Chemistry. 90 (12), 7458-7466 (2018).</li>
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<li>Lou, H. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+curvature+underlies+actin+reorganization+in+response+to+nanoscale+surface+topography%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).</li>
<li>Bridges, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+assemblies+form+by+diffusion-driven+annealing+on+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Septin assemblies form by diffusion-driven annealing on membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (6), 2146-2151 (2014).</li>
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<li>Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+steps+of+supported+bilayer+formation+probed+by+single+vesicle+fluorescence+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays.</a> Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).</li>
<li>Lobato-Márquez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+into+bacterial+entrapment+by+septin+cage+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight into bacterial entrapment by septin cage reconstitution.</a> Nature Communications. 12 (1), 4511(2021).</li>
<li>Gladfelter, A. S., Pringle, J. R., Lew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+septin+cortex+at+the+yeast+mother-bud+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The septin cortex at the yeast mother-bud neck.</a> Current Opinion in Microbiology. 4 (6), 681-689 (2001).</li>
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<li>Bridges, A. A., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+septin+assemblies+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of septin assemblies on supported lipid bilayers.</a> Methods in Cell Biology. 136, 57-71 (2016).</li>
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<li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Current Protocols in Cytometry. (1), Chapter 12, Unit 12.29(2012).</li>
<li>Gidi, Y., Bayram, S., Ablenas, C. J., Blum, A. S., Cosa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+one-step+PEG-silane+passivation+of+glass+surfaces+for+single-molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Efficient one-step PEG-silane passivation of glass surfaces for single-molecule fluorescence studies.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (46), 39505-39511 (2018).</li>
<li>Woods, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+governing+septin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties governing septin assembly.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Cannon, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+duplication+of+a+septin+provides+a+developmentally-regulated+filament+length+control+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A gene duplication of a septin provides a developmentally-regulated filament length control mechanism.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Pincet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+to+characterize+molecular+diffusion+and+interaction+in+various+membrane+environments%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">FRAP to characterize molecular diffusion and interaction in various membrane environments.</a> PLOS One. 11 (7), 0158457(2016).</li>
<li>Reimhult, E., Höök, F., Kasemo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intact+vesicle+adsorption+and+supported+biomembrane+formation+from+vesicles+in+solution%3A+Influence+of+surface+chemistry%2C+vesicle+size%2C+temperature%2C+and+osmotic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Intact vesicle adsorption and supported biomembrane formation from vesicles in solution: Influence of surface chemistry, vesicle size, temperature, and osmotic pressure.</a> Langmuir. 19 (5), 1681-1691 (2003).</li>
<li>Cha, T., Guo, A., Zhu, X. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+phospholipid+bilayers+on+molecular+surfaces%3A+Role+of+surface+charge+density+and+electrostatic+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Formation of supported phospholipid bilayers on molecular surfaces: Role of surface charge density and electrostatic interaction.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1270-1274 (2006).</li>
<li>Andrews, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+lipid+bilayers+%28SLBs%29+from+buffers+containing+low+concentrations+of+group+I+chloride+salts%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of supported lipid bilayers (SLBs) from buffers containing low concentrations of group I chloride salts.</a> Langmuir. 37 (44), 12819-12833 (2021).</li>
<li>Gurtovenko, A. A., Vattulainen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+NaCl+and+KCl+on+phosphatidylcholine+and+phosphatidylethanolamine+lipid+membranes%3A+Insight+from+atomic-scale+simulations+for+understanding+salt-induced+effects+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Effect of NaCl and KCl on phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine lipid membranes: Insight from atomic-scale simulations for understanding salt-induced effects in the plasma membrane.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 112 (7), 1953-1962 (2008).</li>
<li>Danuser, G., Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+fluorescent+speckle+microscopy+of+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Quantitative fluorescent speckle microscopy of cytoskeleton dynamics.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35 (1), 361-387 (2006).</li>
<li>Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Las membranas celulares adquieren muchas formas, curvaturas y propiedades fisicoquímicas diferentes. Para estudiar la maquinaria a escala nanométrica a través de la cual las células construyen ensamblajes a escala micrométrica, es necesario diseñar sistemas de reconstitución mínimos de mimética de membrana. Este protocolo presenta técnicas que controlan con precisión tanto la curvatura como la composición de la membrana, al tiempo que permiten al usuario tomar fácilmente mediciones cuantitativas de fluorescencia utilizan...

Las formas de las células y muchos de sus compartimentos internos dependen de las membranas lipídicas que las rodean. Las membranas son estructuras viscoelásticas que pueden deformarse a través de interacciones con proteínas, clasificación de lípidos y fuerzas internas y externas que actúan para generar una variedad de formas 1,2,3,4. Estas formas a menudo se describen en términos de curvatura de la membrana. Las células utilizan un conjunto diverso de proteínas capaces de ensamblar preferentemente o "detectar" curvaturas de membrana particulares para garantizar un control espacio-temporal definido sobre procesos que incluyen tráfico celular, citocinesis y migración 5,6. La dinámica de la maquinaria celular en la membrana es notablemente difícil de observar debido a la dificultad de equilibrar el tiempo y la resolución espacial con la salud celular. Si bien las técnicas de superresolución pueden ofrecer una visión detallada de tales estructuras, requieren adquisiciones prolongadas que no son susceptibles a las escalas de tiempo de ensamblaje / desmontaje para la mayoría de la maquinaria. Además, la complejidad molecular de estos ensamblajes en su entorno nativo y la multitud de funciones que puede desempeñar un solo componente hacen que los sistemas de reconstitución mínima sean una herramienta valiosa para estudiar la capacidad funcional de las moléculas.
Se han desarrollado miméticos mínimos de membrana para estudiar las propiedades de la membrana y las interacciones proteína-membrana fuera de la célula. Los miméticos de membrana varían desde bicapas lipídicas independientes, como liposomas o vesículas unilamelares gigantes, hasta bicapas lipídicas soportadas (SLB)7,8,9,10. Los SLB son membranas biomiméticas ancladas al soporte subyacente, típicamente compuestas de vidrio, mica o sílice 11,12. Se puede utilizar una variedad de geometrías, incluidas superficies planas, esferas, varillas e incluso sustratos ondulados o micropatronados para sondear las interacciones proteína-membrana en curvaturas cóncavas y convexas simultáneamente1 3,14,15,16,17,18 . La formación de bicapa comienza con la adsorción de vesículas sobre una superficie hidrófila, seguida de fusión y ruptura para formar una bicapa continua (Figura 1)19. Las bicapas soportadas son particularmente susceptibles a la luz y la microscopía electrónica, proporcionando una mejor resolución temporal y espacial de lo que a menudo se puede lograr en las células. Los SLB curvos proporcionan especialmente un medio atractivo para sondear la sensibilidad a la curvatura de la proteína en ausencia de una deformación significativa de la membrana, lo que permite distinguir entre la detección de curvatura y la inducción de curvatura, que a menudo son imposibles de separar en sistemas independientes.
Las septinas son una clase de proteínas citoesqueléticas formadoras de filamentos bien conocidas por su capacidad de ensamblarse en membranas curvadas positivamente 6,18,20. En el transcurso del ciclo celular en la levadura, las septinas se ensamblan en un anillo y deben reorganizarse para formar las estructuras de reloj de arena y doble anillo asociadas con la aparición de brotes y la citocinesis, respectivamente21. Si bien se ha realizado un hermoso trabajo utilizando microscopía electrónica de réplica de platino para observar la arquitectura de la septina en diferentes etapas del ciclo celular22, observar el ensamblaje de la septina a lo largo del tiempo utilizando la microscopía de luz en la levadura se ha encontrado con una resolución espacial limitada. Trabajos previos sobre septinas utilizando monocapas lipídicas visualizadas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) fueron capaces de reconstituir varias estructuras de septina interesantes como anillos, haces y gasas23. Sin embargo, las técnicas EM también están limitadas en su resolución temporal, a diferencia de la microscopía de fluorescencia. Con el fin de resolver mejor los parámetros cinéticos del proceso multiescala de ensamblaje de septina, recurrimos a la mimética de membrana soportada, donde se puede controlar cuidadosamente la geometría de la membrana, las condiciones de la muestra y la modalidad de imagen.
Los protocolos descritos aquí utilizan SLB planos o curvos, proteína purificada y una combinación de técnicas de microscopía. La microscopía confocal de fluorescencia cuantitativa y la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) se utilizaron para medir tanto la unión de proteínas a granel en varias curvaturas de membrana, como para medir la cinética de unión de moléculas individuales. Además, este protocolo ha sido adaptado para ser utilizado con microscopía electrónica de barrido (SEM) para examinar la ultraestructura de proteínas en diferentes curvaturas de membrana. Si bien el enfoque de estos protocolos está en el citoesqueleto de septina, los protocolos se pueden modificar fácilmente para investigar la sensibilidad a la curvatura de cualquier proteína que el lector encuentre interesante. Además, aquellos que trabajan en campos como la endocitosis o el tráfico vesicular pueden encontrar estas técnicas útiles para sondear los ensamblajes dependientes de la curvatura de complejos multiproteicos.

<table><tbody><tr><td>Tubos de PCR de 0,2 mL con tapa plana, Natural</td><td>Watson</td><td>137-211C(EX)</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de baja adherencia de 0,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>Beta mercaptoetanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4612-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos para la fabricación de cubreobjetos de PEGilado</td><td>Thermo Scientific</td><td>152450</td><td>Richard-Allan Scientific SLIP-RITE Cubreobjetos 24x50 #1.5</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Huevo Liss Rhodamina PE</td><td>Avanti Lípidos Polares</td><td>810146</td><td></td></tr><tr><td>EMS Glutaraldehído Acuoso 25%, Grado EM VWR</td><td></td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>EMS Tampón de Cacodilato de Sodio</td><td>VWR</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 grados</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-223EA</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexametildisilazano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio</td><td>VWR</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>Metilcelulosa 4000cp</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M052-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cubertades de microvidrio para bicapas planas</td><td>Matsunami</td><td>Descatalogada</td><td>22x22</td></tr><tr><td>Mini centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microesferas de sílice no funcionalizadas</td><td>Bangs Laboratories, Inc.</td><td>Depende del tamaño: SS0200*-SS0500*</td><td>Sílice en suspensión acuosa</td></tr><tr><td>Adhesivo óptico</td><td>Norland Thorlabs</td><td>NOA 68</td><td>Adhesivo flexible para vidrio o plástico</td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>Millipore Sigma</td><td>20816-12-0</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Grabado de plasma</td><td>PE-25</td><td>Voltaje: 120V, 60Hz. Corriente: 15 AMPERIOS</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>VWR</td><td>0395-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos redondo, #1.5 12mm&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>64-0712</td><td></td></tr><tr><td>Baño de sonicador</td><td>Branson</td><td>1510R-MT</td><td>Bransonic Limpiador ultrasónico. 50-60 Hz. Salida: 70W</td></tr><tr><td>Soy PI</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840044</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa</td><td>Eppendorf</td><td>22331</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara UV</td><td>Spectroline</td><td>ENF-260C</td><td>115 voltios, 60 Hz, 0,20 amperios Papel de</td></tr><tr><td>filtro de microfibra WhatmanGlass</td><td>VWR</td><td>28455-030</td><td>42,5 mm de diámetro, grado GF/C</td></tr></tbody></table>

reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

La mayoría de las células pueden detectar y cambiar su forma para llevar a cabo procesos celulares fundamentales. En muchos eucariotas, el citoesqueleto de septina es un componente integral en la coordinación de cambios de forma como la citocinesis, el crecimiento polarizado y la migración. Las septinas son proteínas formadoras de filamentos que se ensamblan para formar diversas estructuras de orden superior y, en muchos casos, se encuentran en diferentes áreas de la membrana plasmática, especialmente en regiones de curvatura positiva a escala micrométrica. El monitoreo del proceso de ensamblaje de la septina in vivo se ve obstaculizado por las limitaciones de la microscopía de luz en las células, así como por la complejidad de las interacciones tanto con las membranas como con los elementos citoesqueléticos, lo que dificulta la cuantificación de la dinámica de la septina en los sistemas vivos. Afortunadamente, ha habido un progreso sustancial en la última década en la reconstitución del citoesqueleto de septina en un sistema libre de células para diseccionar los mecanismos que controlan el ensamblaje de la septina a altas resoluciones espaciales y temporales. Los pasos centrales del ensamblaje de la septina incluyen la asociación y disociación del heterooligómero de la septina con la membrana, la polimerización en filamentos y la formación de estructuras de orden superior a través de interacciones entre filamentos. Aquí, presentamos tres métodos para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla. Estos métodos se pueden utilizar para determinar los parámetros biofísicos de las septinas en diferentes etapas de ensamblaje: como octamperadores individuales que se unen a la membrana, como filamentos y como ensamblajes de filamentos. Utilizamos estos parámetros combinados con mediciones de muestreo de curvatura y adsorción preferencial para comprender cómo opera la detección de curvatura en una variedad de escalas de longitud y tiempo.

Después de la preparación de cada SLB, las septinas o la proteína de interés pueden incubarse con el soporte deseado y obtener imágenes a través de TIRFM, microscopía confocal o SEM. Los resultados que se muestran aquí utilizan septinas expresadas y purificadas recombinantemente a partir de E. coli17. Utilizando TIRFM en SLB planos, es posible determinar la longitud de los filamentos y su flexibilidad, medir los coeficientes de difusión y observar el ensamblaje a lo largo del tiempo<sup c...

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Este protocolo guiará a aquellos que trabajan en proteínas de unión a membrana para determinar cómo la forma de la membrana juega un papel en la organización de ensamblajes de proteínas. La principal ventaja de esta técnica es su versatilidad para el tipo de proteína, la composición de la membrana y la geometría de la membrana. También permite interrogar cómo una bicapa lipídica puede alterar las propiedades de las proteínas asociadas.Para identificar una buena membrana para el experimento, sugerimos establecer una lista de verificación que podría incluir tasas de difusión de lípidos, movilidad de la proteína de interés y si hay liposomas sin estallar o liposomas fusionados adheridos a la superficie. Para comenzar la limpieza con plasma de los portaobjetos, purgue el limpiador de plasma durante cinco minutos con oxígeno para eliminar el aire de las líneas y la cámara. Coloque los portaobjetos de vidrio de cubierta seca en una cuna de cerámica.Mientras purga, haga correr un gas inerte sobre los portaobjetos de vidrio de la microcubierta para eliminar el polvo y las partículas. Coloque la cuna en la parte posterior de la cámara de plasma de modo que los cubreobjetos queden paralelos al borde largo de la cámara. Haga funcionar el limpiador de plasma durante 15 minutos con oxígeno a máxima potencia.Para la preparación de la cámara, corte la tapa justo debajo de la parte esmerilada de un tubo de PCR de 0,2 mililitros. Pintar el borde del tubo de PCR con adhesivo activado UV evitando el interior del tubo. Coloque suavemente el pegamento del tubo de PCR en el centro de un cubreobjetos limpio con plasma, luego coloque la cámara bajo luz UV de longitud de onda larga durante cinco a siete minutos para curar el adhesivo.Para formar una bicapa, agregue los reactivos al pozo. Agite suavemente las cámaras de lado a lado para interrumpir los SUV y luego incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, enjuague la bicapa seis veces con 150 microlitros de SLBB pipeteando para eliminar el exceso de lípidos, luego lave la bicapa seis veces con 150 microlitros de tampón de reacción antes de incubar con las septinas.En el último paso de lavado, retire el tampón de reacción, dejando 75 microlitros en el pozo. Añadir 25 microlitros de septinas diluidas en SSB e imagen por microscopía TIRF. Primero, vorete la botella que contiene microesferas de sílice durante 15 segundos, luego bañe sonicate durante un minuto y vuelva a vorátice durante 15 segundos para romper cualquier grupo.Mezcle las perlas con SLBB y 10 microlitros de cinco SUV milimolares en un tubo de microcentrífuga de baja adherencia. Incubar la mezcla lipídica de perlas durante una hora a temperatura ambiente en un agitador para evitar la sedimentación. Mientras tanto, descongele un cubreobjetos pegilado y pegue un tubo de PCR cortado de 0,2 mililitros.Después de la incubación, centrifugar las perlas durante 30 segundos en el RCF designado. Después del primer giro, retire 50 microlitros de sobrenadante, luego agregue 200 microlitros de PRB y mezcle con un pipeteo vigoroso. Para las siguientes rondas, retire 200 microlitros de PRB y agregue otros 200 microlitros después del segundo y tercer giro y agregue 220 microlitros de PRB después del cuarto giro.Si realiza un ensayo de competencia con múltiples tamaños de perlas, prepare la reacción mezclando volúmenes iguales de cada tamaño de perla y diluyendo 29 microlitros de esta mezcla de perlas con 721 microlitros de tampón de reacción, luego agregue 75 microlitros de perlas diluidas y 25 microlitros de la proteína diluida en SSB a los pocillos y mezcle. Si mide septinas en un estado estacionario, incube la mezcla a temperatura ambiente durante una hora y luego obtenga una imagen cerca de TIRF o microscopía confocal. Las micrografías TIRF de SLB planas incubadas con septinas mostradas en verde mostraron una distribución homogénea de proteínas.Los SLB hechos con cubreobjetos de vidrio mal limpiados mostraron agujeros o huecos en la bicapa en regiones de baja septina. Los liposomas tubulados y sin estallar pueden acumularse en la superficie si se usan liposomas viejos o si los lavados no son estrictos. En micrografías de microesferas recubiertas de lípidos visualizadas usando rodamina PE mostró una deposición lisa de bicapa.Los soportes esféricos estaban recubiertos uniformemente por la membrana y había pocos grupos de cuentas. El lavado insuficiente del exceso de lípidos causó un recubrimiento desigual de la membrana como se observó por los grupos de lípidos y el manejo inadecuado causó brechas en la bicapa. La mezcla insuficiente de perlas causó aglutinación que no es ideal para medir la absorción total de proteínas.Utilizando las bicapas lipídicas soportadas presentadas aquí, se pueden realizar otros métodos como la microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida, la citometría de masas de membranas y la microscopía de fuerza atómica de alta velocidad para examinar diferentes dinámicas proteína-proteína o proteína-membrana.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

En este video, demostramos un procedimiento para investigar la organización de la septina en una bicapa lipídica soportada por vidrio in vitro utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total.

Ensayo de bicapa lipídica soportada plana: una técnica in vitro basada en microscopía para investigar el ensamblaje de septinas en imitaciones de membranas biológicas

Este video describe la técnica de estudio del ensamblaje de la proteína septina en microesferas recubiertas con bicapas lipídicas. Esta técnica ayuda a comprender los ensamblajes dependientes de la curvatura de las proteínas en superficies curvas.

Ensayo de bicapa lipídica soportada esférica: una técnica para observar el ensamblaje de septinas en microesferas

Se describen procedimientos para la reconstitución completa de un canal de potasio dependiente de voltaje prototipo en las membranas lipídicas. Los canales reconstituidas son adecuadas para los ensayos bioquímicos, grabaciones eléctricas, detección ligando y estudios de cristalografía de electrones. Estos métodos pueden tener aplicaciones generales a los estudios estructurales y funcionales de otras proteínas de membrana.

La reconstitución de un canal Kv en las membranas lipídicas de Estudios estructurales y funcionales

El ensamblaje y posicionamiento del huso mitótico dependen de las fuerzas combinadas generadas por la dinámica de los microtúbulos, las proteínas motoras y los reticulantes. Aquí presentamos nuestros métodos recientemente desarrollados en los que el confinamiento geométrico de gotas de emulsión esférica se utiliza para la reconstitución ascendente de husos mitóticos básicos.

La reconstitución de Básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas

Aquí, presentamos un protocolo para reconstituir haces de microtúbulos in vitro y cuantificar directamente las fuerzas ejercidas dentro de ellos utilizando trampeo óptico simultáneo y microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Este ensayo permite la medición a nivel nanométrico de las fuerzas y desplazamientos generados por los conjuntos de proteínas dentro de las redes de microtúbulos activos.

Medición directa de las fuerzas dentro de haces de microtúbulos activos reconstituidos

La reconstitución in vitro de proteínas citoesqueléticas es una herramienta vital para comprender las propiedades funcionales básicas de estas proteínas. El presente artículo describe un protocolo para purificar y evaluar la calidad de los complejos de septina recombinantes, que desempeñan un papel central en la división y migración celular.

Purificación y control de calidad de complejos de septina recombinante para la reconstitución libre de células

Las septinas son proteínas citoesqueléticas. Interactúan con las membranas lipídicas y pueden sentir, pero también generar curvatura de la membrana a escala de micras. Describimos en este protocolo metodologías in vitro ascendentes para analizar deformaciones de membrana, unión de septina sensible a la curvatura y ultraestructura de filamentos de septina.

Métodos in vitro ascendentes para evaluar la organización ultraestructural, la remodelación de la membrana y el comportamiento de sensibilidad a la curvatura de las septinas

Este protocolo describe la formación de bicapas lipídicas soportadas y la adición de filamentos citoesqueléticos y proteínas motoras para estudiar la dinámica de las redes citoesqueléticas reconstituidas y atadas a la membrana utilizando microscopía de fluorescencia.

Reconstitución de corticidades mínimas de actina atadas a la membrana en bicapas lipídicas soportadas

Bacillus anthracis es el patógeno obligado del ántrax por inhalación fatal, por lo que los estudios de sus genes y proteínas están estrictamente regulados. Un enfoque alternativo es estudiar los genes ortólogos. Se describen los estudios biofísicoquímicos de un B. orthracis ortholog en B. cereus , bc1531, que requiere un mínimo de equipo experimental y la falta de graves preocupaciones de seguridad.

Expresión de Proteínas Recombinantes, Cristalización y Estudios Biofísicos de un<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservado Nucleótido Pirofosforilasa, BcMazG

En este método, presentamos procedimientos bioquímicos para el aislamiento rápido y eficiente de proteínas de filamento intermedio (IF) de múltiples tejidos de ratón. Se pueden usar IFs aisladas para estudiar los cambios en las modificaciones postraduccionales por espectrometría de masas y otros ensayos bioquímicos.

Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

Aprende a reconstituir ensamblajes de septina en membranas para estudiar propiedades biofísicas. Este protocolo versátil permite analizar cómo la geometría de la membrana influye en la organización de proteínas.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

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