Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Este protocolo guiará a aquellos que trabajan en proteínas de unión a membrana para determinar cómo la forma de la membrana juega un papel en la organización de ensamblajes de proteínas. La principal ventaja de esta técnica es su versatilidad para el tipo de proteína, la composición de la membrana y la geometría de la membrana. También permite interrogar cómo una bicapa lipídica puede alterar las propiedades de las proteínas asociadas.

Para identificar una buena membrana para el experimento, sugerimos establecer una lista de verificación que podría incluir tasas de difusión de lípidos, movilidad de la proteína de interés y si hay liposomas sin estallar o liposomas fusionados adheridos a la superficie. Para comenzar la limpieza con plasma de los portaobjetos, purgue el limpiador de plasma durante cinco minutos con oxígeno para eliminar el aire de las líneas y la cámara. Coloque los portaobjetos de vidrio de cubierta seca en una cuna de cerámica.

Mientras purga, haga correr un gas inerte sobre los portaobjetos de vidrio de la microcubierta para eliminar el polvo y las partículas. Coloque la cuna en la parte posterior de la cámara de plasma de modo que los cubreobjetos queden paralelos al borde largo de la cámara. Haga funcionar el limpiador de plasma durante 15 minutos con oxígeno a máxima potencia.

Para la preparación de la cámara, corte la tapa justo debajo de la parte esmerilada de un tubo de PCR de 0,2 mililitros. Pintar el borde del tubo de PCR con adhesivo activado UV evitando el interior del tubo. Coloque suavemente el pegamento del tubo de PCR en el centro de un cubreobjetos limpio con plasma, luego coloque la cámara bajo luz UV de longitud de onda larga durante cinco a siete minutos para curar el adhesivo.

Para formar una bicapa, agregue los reactivos al pozo. Agite suavemente las cámaras de lado a lado para interrumpir los SUV y luego incube a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, enjuague la bicapa seis veces con 150 microlitros de SLBB pipeteando para eliminar el exceso de lípidos, luego lave la bicapa seis veces con 150 microlitros de tampón de reacción antes de incubar con las septinas.

En el último paso de lavado, retire el tampón de reacción, dejando 75 microlitros en el pozo. Añadir 25 microlitros de septinas diluidas en SSB e imagen por microscopía TIRF. Primero, vorete la botella que contiene microesferas de sílice durante 15 segundos, luego bañe sonicate durante un minuto y vuelva a vorátice durante 15 segundos para romper cualquier grupo.

Mezcle las perlas con SLBB y 10 microlitros de cinco SUV milimolares en un tubo de microcentrífuga de baja adherencia. Incubar la mezcla lipídica de perlas durante una hora a temperatura ambiente en un agitador para evitar la sedimentación. Mientras tanto, descongele un cubreobjetos pegilado y pegue un tubo de PCR cortado de 0,2 mililitros.

Después de la incubación, centrifugar las perlas durante 30 segundos en el RCF designado. Después del primer giro, retire 50 microlitros de sobrenadante, luego agregue 200 microlitros de PRB y mezcle con un pipeteo vigoroso. Para las siguientes rondas, retire 200 microlitros de PRB y agregue otros 200 microlitros después del segundo y tercer giro y agregue 220 microlitros de PRB después del cuarto giro.

Si realiza un ensayo de competencia con múltiples tamaños de perlas, prepare la reacción mezclando volúmenes iguales de cada tamaño de perla y diluyendo 29 microlitros de esta mezcla de perlas con 721 microlitros de tampón de reacción, luego agregue 75 microlitros de perlas diluidas y 25 microlitros de la proteína diluida en SSB a los pocillos y mezcle. Si mide septinas en un estado estacionario, incube la mezcla a temperatura ambiente durante una hora y luego obtenga una imagen cerca de TIRF o microscopía confocal. Las micrografías TIRF de SLB planas incubadas con septinas mostradas en verde mostraron una distribución homogénea de proteínas.

Los SLB hechos con cubreobjetos de vidrio mal limpiados mostraron agujeros o huecos en la bicapa en regiones de baja septina. Los liposomas tubulados y sin estallar pueden acumularse en la superficie si se usan liposomas viejos o si los lavados no son estrictos. En micrografías de microesferas recubiertas de lípidos visualizadas usando rodamina PE mostró una deposición lisa de bicapa.

Los soportes esféricos estaban recubiertos uniformemente por la membrana y había pocos grupos de cuentas. El lavado insuficiente del exceso de lípidos causó un recubrimiento desigual de la membrana como se observó por los grupos de lípidos y el manejo inadecuado causó brechas en la bicapa. La mezcla insuficiente de perlas causó aglutinación que no es ideal para medir la absorción total de proteínas.

Utilizando las bicapas lipídicas soportadas presentadas aquí, se pueden realizar otros métodos como la microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida, la citometría de masas de membranas y la microscopía de fuerza atómica de alta velocidad para examinar diferentes dinámicas proteína-proteína o proteína-membrana.