Name: La técnica Peel-Blot: Un método de preparación de muestras crio-EM para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Aprende la técnica peel-blot para preparación de muestras criomicroscopía electrónica, separando capas múltiples en monocapas. Este método reduce el grosor, aumenta la concentración y mejora el procesamiento de imágenes biológicas.

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Parte de este trabajo fue apoyado por la subvención HL090630 (ISK) de los NIH.

1. Pasos de preparación para la técnica peel-blot
NOTA: La preparación requiere que los siguientes elementos se coloquen uno al lado del otro.
<ol><li>Apile dos piezas de papel de filtro de tamaño de poro de 20-25 μm (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Coloque una película de parafina de ~8 cm x 10 cm de largo adyacente al papel de filtro con el papel hacia arriba.</li>
	<li>Coloque un trozo de papel de filtro submicrónico encima de dos trozos adicionales de papel de filtro #4 (Figura 1-1).</li>
	<li>Coloque las pinzas anticapilares con la pierna doblada hacia arriba y la pierna recta hacia abajo. Luego, seleccione una cuadrícula de malla 600 con el lado liso / brillante hacia arriba. Coloque las pinzas sobre una placa de Petri u otra superficie elevada para evitar el contacto de la rejilla limpia con otros elementos.</li>
	<li>Retire el papel de la película de parafina y tire de los lados (~ 5 mm) para crear un borde pequeño. Pipetear dos gotas de 150 μL de solución de trehalosa al 4% ~1-2 cm de un lado corto de la película de parafina y ~1 cm de distancia en la película de parafina.</li>
	<li>En un banco separado o en el piso, vierta nitrógeno líquido en un recipiente pequeño de espuma de poliestireno (consulte la Tabla de materiales). PRECAUCIÓN: Reciba capacitación para el manejo adecuado con guantes y un protector facial para evitar la picadura de escarcha.</li>
	<li>Coloque un pequeño recipiente de rejilla crio-EM en el nitrógeno líquido y cubra el recipiente de espuma de poliestireno con toallitas sin pelusa.</li>
</ol>2. Colocación de la película de carbono en la rejilla
<ol><li>Use pinzas Dumont #5 (consulte la Tabla de materiales) para hacer flotar la película de carbono de la mica tocando un lado de la mica en un ligero ángulo hacia abajo (~ 20 ° -40 °) en una de las gotas de solución de trehalosa y lentamente deje que la tensión del agua se levante de la película de carbono moviendo la mica hacia abajo. Libere la mica una vez que la película de carbono flote en la superficie de la gota.</li>
	<li>Inspeccione visualmente la película de carbono para evitar el uso de carbono con daños en forma de fracturas.</li>
	<li>Inserte la rejilla sujeta por las pinzas anticapilares en un ángulo (~ 20 ° -30 °) en una gota de trehalosa en una posición adyacente y luego centrada debajo de la película de carbono. Recoja la película de carbono (Figura 1-2).</li>
	<li>Mantenga la rejilla en la misma orientación y bájela lentamente sobre la superficie de la segunda gota de trehalosa sin romper la tensión superficial de la gota para eliminar la película de carbono innecesaria que puede haberse envuelto alrededor del borde de la rejilla hacia el lado áspero.</li>
</ol>3. Separación de cristales 2D multicapa en capas individuales
<ol><li>Gire las pinzas anticapilares (consulte la Tabla de materiales) y colóquelas en una placa de Petri con el lado de carbono de la rejilla hacia abajo (Figura 1-3).</li>
	<li>Pipetear 1,3 μL de la muestra en el menisco de trehalosa leve en la parte superior de la rejilla. Pipetear la solución ~8-10 veces para mezclar y distribuir la trehalosa y la muestra en ambos lados de la rejilla.</li>
	<li>Mientras incuba la solución durante 1 minuto, pipete una o más gotas de 1,7 μL de solución de trehalosa sobre la película de parafina.</li>
	<li>Gire la rejilla a su posición original con la película de carbono hacia arriba.</li>
	<li>Utilice las pinzas anticapilares para presionar la rejilla sobre el papel de filtro submicrónico (Figura 1-4). Una vez que la solución haya sido absorbida por el papel de filtro y la película de carbono esté plana, espere 3s antes de levantar la rejilla y moverla verticalmente sobre la gota de 1,7 μL de solución de trehalosa (Figura 1-5). NOTA: Repita este paso varias veces para muestras muy apiladas, o la cuadrícula se prepara para la vitrificación en los pasos siguientes.</li>
	<li>Seque la rejilla en las dos piezas de papel de filtro y luego levante la rejilla del papel de filtro (Figura 1-6). Después de aproximadamente 13 s, dependiendo de la humedad y el tampón de muestra, sumerja la rejilla en el nitrógeno líquido en el recipiente pequeño de espuma de poliestireno y coloque la rejilla en el contenedor de rejilla crio-EM o transfiérala directamente para la detección crio-EM o la recopilación de datos. NOTA: Para optimizar rápidamente el protocolo, manche negativamente la rejilla borrada en este paso en lugar de sumergirla en nitrógeno líquido. Tiñe negativamente la muestra aplicando 3 μL de acetato de uranilo al 1% a la rejilla, incubar la rejilla durante 30 s y secarla con un trozo rasgado de papel de filtro de 20-25 μm de tamaño de poro. Las rejillas de cristales 2D vitrificados en trehalosa, tanino o glucosa se sumergen rutinariamente a mano para la vitrificación, ya que la trehalosa, el tanino y la glucosa evitan la formación de hielo cristalino a las tasas utilizadas para la inmersión manual2.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).</li>
	<li>Ku&#776;hlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 &#197; resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207&#160;(4), 823-828 (1989).</li>
	<li>Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2&#160;(1), 1-8 (2018).</li>
	<li>Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27&#160;(3), 545-548 (2019).</li>
	<li>Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438&#160;(7068), 633-638(2005).</li>
	<li>Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).</li>
	<li>Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).</li>
	<li>Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157&#160;(1), 64-72 (2007).</li>
	<li>Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198&#160;(2), 124-133 (2017).</li>
	<li>Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses.

El peel-blot es un método poderoso para superar el apilamiento y el grosor de cristales 2D de múltiples capas y muestras similares para la recopilación de datos crio-EM y el procesamiento de imágenes. La decisión sobre el uso del peel-blot se basará en los parámetros biológicos de la muestra y también requerirá una evaluación una vez que esté disponible un modelo 3D crio-EM. La importancia biológica de los contactos y la flexibilidad potencial de las regiones de contacto serán particularmente importantes en esta evaluaci...

La técnica peel-blot se desarrolló con el fin de separar cristales bidimensionales apilados de proteínas de membrana en capas individuales para obtener muestras adecuadamente delgadas para la recolección de datos crio-EM 2D y 3D y facilitar el procesamiento de imágenes1. El protocolo es igualmente adecuado para otros tipos de muestras multilaminares, así como para lograr altas concentraciones de muestra de cualquier tipo de muestra en la rejilla sin aumentar el grosor en Z.
La reducción de las capas de muestra a una capa se logra aplicando una combinación de presión capilar y fuerzas de cizallamiento en un protocolo que amplía sustancialmente y modifica el método de inyección posterior2. Un primer paso de secado da como resultado un sándwich apretado y adherencia a la película de carbono y una barra de rejilla a cada lado de la muestra de varias capas durante la secado en submicrónico en lugar del tamaño de poro del papel de filtro de 20-25 μm en el método de inyección posterior. La separación, o pelado, de una capa individual ocurre al forzar la separación de las capas intercaladas una vez que la rejilla se presiona verticalmente sobre una gota de trehalosa, forzando la película de carbono lejos de la barra de rejilla (Figura 1). El reposicionamiento de la película de carbono lejos del punto de contacto original con la barra de rejilla se produce en el siguiente paso, cuando la rejilla se borra una vez más en papel de filtro submicrónico. El número de iteraciones de estos pasos se puede optimizar para muestras específicas. Además, el protocolo se puede utilizar para aumentar las concentraciones de la muestra evitando la agregación en Z. Debido a la dependencia de la adherencia a la barra de rejilla y la película de carbono, así como a la separación forzada, este enfoque puede no ser adecuado para moléculas altamente frágiles como ciertas proteínas delicadas y / o inestables y complejos de proteínas.
La técnica peel-blot no requiere equipo especializado ni suministros costosos. Sin embargo, la aplicabilidad a muestras específicas requerirá consideraciones cuidadosas de los parámetros biológicos. La decisión es más fácil para los cristales 2D, ya que se requiere una película de carbono para garantizar la planitud, pero la manipulación a través de la técnica peel-blot puede afectar la integridad biológica de la muestra o el orden cristalino. La idoneidad de la técnica peel-blot para partículas individuales está restringida y puede probarse para aquellas que requieren película de carbono y son estables a la manipulación. Los especímenes con interacciones biológicas críticas entre capas pueden no ser adecuados para la caracterización con la ayuda de la técnica peel-blot debido a la interrupción de tales interacciones.
La técnica peel-blot ("peel-blot") se optimiza más rápidamente mediante pruebas y cribado con tinción negativa o muestras no teñidas por TEM a temperatura ambiente. Una vez que se ha identificado el número óptimo de iteraciones de peel-blot, se puede determinar el tiempo para controlar el grosor antes de la vitrificación.

<table><tbody><tr><td>Rejillas de malla 600</td><td>SPI</td><td>2060-C-XA</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas anticapilares</td><td>Ted Pella</td><td>510-5</td><td></td></tr><tr><td>Carbono para recubrir mica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cryo-EM</td><td></td><td></td><td>Las rejillas crio-EM pueden tamizarse a 120 kV o 200 kV. Los datos de alta resolución se recogen a 300 kV.</td></tr><tr><td>Pinza Dumpont #5</td><td>Ted Pella</td><td>5622</td><td></td></tr><tr><td>Caja de rejilla para almacenamiento crio-EM</td><td>Ted Pella</td><td>160-40</td><td></td></tr><tr><td>Kim Wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td>Mica</td><td>Ted Pella</td><td>56</td><td>La mica está recubierta de carbono y cortada en cuadrados que son ligeramente más grandes que una rejilla TEM. El espesor del carbono puede requerir una optimización para evitar el carbono delgado que se rompe fácilmente con múltiples manchas de cáscara.</td></tr><tr>El acetato de uranilo con <td>tinción</td><td></td><td></td> negativa <td>al 1-2% es adecuado para muchas muestras. Se pueden sustituir otras tinciones como el ácido fosfotúngstico.</td></tr>Contenedor de poliestireno <tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> Se utiliza para vitrificar la rejilla de pelado-mancha.<td></td><td></td><td> Un contenedor de poliestireno puede reciclarse para este propósito y forrarse con papel de aluminio.</td></tr><tr><td>Papel de filtro submicrónico</td><td>MilliporeSigma</td><td>DAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión</td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td>Cualquier TEM operado a un voltaje de aceleración de 80-120 kV será adecuado para el cribado de rejillas teñidas negativamente.</td></tr><tr><td>Trehalosa</td><td></td><td></td><td>Prepare una solución de trehalosa al 4%.</td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman #4</td><td>MilliporeSigma</td><td>WHA1004150</td><td>Esto corresponde a los 20-25 &mu; Papel de filtro de tamaño de poro m en el protocolo.</td></tr></tbody></table>

la técnica peel-blot: un método de preparación de muestras crio-em para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

La técnica de preparación de rejilla crio-EM peel-blot es un método de retroinyección significativamente modificado con el objetivo de lograr una reducción en las capas de muestras de múltiples capas. Esta eliminación de capas antes de la congelación por inmersión puede ayudar a reducir el grosor de la muestra a un nivel adecuado para la recopilación de datos crio-EM, mejorar la planitud de la muestra y facilitar el procesamiento de imágenes. La técnica peel-blot permite la separación de membranas multilamelares en capas individuales, de cristales 2D en capas en cristales individuales, y de estructuras apiladas, en forma de lámina, de proteínas solubles que también se separan en capas individuales. El alto espesor de muestra de este tipo de muestras con frecuencia plantea problemas insuperables para la recopilación de datos crio-EM y el procesamiento de imágenes crio-EM, especialmente cuando la etapa del microscopio debe inclinarse para la recopilación de datos. Además, se pueden preparar rejillas de altas concentraciones de cualquiera de estas muestras para una recopilación de datos eficiente, ya que la concentración de la muestra antes de la preparación de la rejilla se puede aumentar y ajustar la técnica de peel-blot para dar como resultado una distribución densa de muestras de una sola capa.

Un experimento exitoso de peel-blot dará como resultado capas individuales de muestras a concentraciones a menudo altas. Es de esperar que algunas regiones en la mayoría de los cuadrados de cuadrícula todavía contengan múltiples capas, especialmente en un menor número de iteraciones de los pasos de peel-blot. La mayoría de los cuadrados de cuadrícula, sin embargo, contendrán extensas regiones de capas individuales como se observa para cristales 2D de leucotrieno humano C4 sintasa (Figura 2) y liposomas (agrega...

La técnica peel-blot es un método de preparación de rejilla crio-EM que permite la separación de muestras biológicas concentradas y de múltiples capas en capas individuales para reducir el espesor, aumentar la concentración de la muestra y facilitar el procesamiento de imágenes.

La técnica Peel-Blot: Un método de preparación de muestras crio-EM para separar capas individuales de muestras biológicas de múltiples capas o concentradas

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

La técnica peel-blot permite la separación de muestras crio-EM biológicas concentradas y de múltiples capas en capas individuales para reducir el grosor, aumentar la concentración y facilitar el procesamiento de imágenes. Las concentraciones de muestra se pueden aumentar antes de la preparación de la rejilla, y el peel-blot se puede ajustar para dar como resultado una distribución densa de muestras de una sola capa para una recopilación de datos altamente eficiente. Para comenzar, apile dos piezas de papel de filtro de tamaño de poro de 20-25 micrómetros y coloque una película de parafina larga adyacente a ella con el papel hacia arriba.Coloque un trozo de papel de filtro submicrónico encima de dos trozos adicionales de papel de filtro. Coloque las pinzas anticapilares con la pierna doblada hacia arriba y la pierna recta hacia abajo y seleccione una rejilla de malla 600 con el lado liso o brillante hacia arriba. Coloque las pinzas sobre una placa de Petri u otra superficie elevada para evitar el contacto de la rejilla limpia con otros elementos.Retire el papel de la película de parafina y tire de los lados para crear un pequeño borde. Pipetear dos gotas de 150 microlitros, por lo que la solución de trehalosa al 4% a aproximadamente uno o dos centímetros de un lado corto de la película de parafina. Las dos gotas deben estar separadas por alrededor de un centímetro.Luego, en un banco separado o en el piso, vierta nitrógeno líquido en un pequeño recipiente de espuma de poliestireno y coloque un pequeño recipiente de rejilla crio-EM en el nitrógeno líquido. Cubra el recipiente de espuma de poliestireno con toallitas sin pelusa. Para hacer flotar la película de carbono de la mica, use Dumont 5 Fórceps y toque un lado de la mica en un ligero ángulo hacia abajo en una de las gotas de solución de trehalosa.Mueva la mica hacia abajo para permitir que la tensión del agua levante la película de carbono lentamente. Libere la mica una vez que la película de carbono flote en la superficie de la gota. Inspeccione visualmente la película de carbono para evitar el uso de carbono con daños en forma de fracturas.Inserte la rejilla sujeta por las pinzas anticapilares en un ángulo de 20-30 grados en una gota de trehalosa en una posición adyacente y luego centre la rejilla debajo de la película de carbono. Recoge la película de carbono, mantén la rejilla en la misma orientación y baja lentamente la rejilla sobre la superficie de la segunda gota de trehalosa sin romper la tensión superficial de la gota. Esto eliminará la película de carbono innecesaria que puede haberse envuelto alrededor del borde de la rejilla hacia el lado áspero.Gire las pinzas anticapilares y colóquelas en una placa de Petri con el lado de carbono de la rejilla hacia abajo. Pipetear 1,3 microlitros de la muestra en el ligero menisco trehalosa en la parte superior de la rejilla. Luego, pipetear la solución aproximadamente 8-10 veces para mezclar y distribuir la trehalosa y la muestra en ambos lados de la rejilla.Pipetear una o más gotas de 1,7 microlitros de solución de trehalosa sobre la película de parafina mientras se incuba la solución de trehalosa de muestra en la rejilla durante un minuto. Gire la rejilla a su posición original con la película de carbono hacia arriba y presione la rejilla sobre el papel de filtro submicrónico con las pinzas anticapilares. Una vez que la solución haya sido absorbida por el papel de filtro y la película de carbono esté plana, espere tres segundos antes de levantar la rejilla y moverla verticalmente sobre la gota de 1,7 microlitros de solución de trehalosa.Estos pasos se pueden repetir entre una y tres reiteraciones o más, dependiendo de la muestra. Seque la rejilla en los dos trozos de papel de filtro y luego levante la rejilla del papel de filtro. Después de aproximadamente 13 segundos, dependiendo de la humedad y el tampón de muestra, sumerja la rejilla en el nitrógeno líquido en el recipiente pequeño de espuma de poliestireno y colóquelo en el recipiente de rejilla crio-EM o transfiéralo directamente para el cribado crio-EM o la recopilación de datos.Aquí se muestra una muestra de cristal 2D de leucotrieno C4 sintasa humana sometida al método peel-blot. La región a la izquierda de la flecha se redujo en gran medida a cristales 2D de una sola capa en una región de contacto entre la película de carbono y la barra de rejilla que se borró y luego se desplazó. La región a la derecha de la flecha no se vio afectada por la mancha de cáscara.La mitad inferior de la imagen representa las regiones con grandes bicapas de fosfolípidos de una sola capa, en su mayoría de una sola capa, resultantes de la aplicación de la mancha de cáscara. La mitad superior no estaba en una zona de contacto entre la barra de rejilla y la película de carbono, y por lo tanto contenía liposomas completos con dos bicapas de fosfolípidos. El cuadrado de cuadrícula de una cuadrícula de malla 400 muestra la huella de la barra de cuadrícula y las regiones resultantes borradas de cáscara, así como las regiones que no estuvieron en contacto con una barra de cuadrícula o sometidas a menos iteraciones de borrado de cáscara.Estas imágenes mostraron la secación de una rejilla EM preparada por la inyección posterior en un papel de filtro submicrónico utilizando una película de carbono muy delgada. Las imágenes son fotogramas individuales en contacto inicial con la membrana, 1.000 milisegundos después del contacto y 2.000 milisegundos después del contacto. La flecha indica cuadrados de cuadrícula donde la presión capilar rompió la película de carbono.Evitar fracturas en la película de carbono y combinar papel de filtro submicrónico con una gota de trehalosa de 1,7 microlitros para succionar y luego separar las capas son pasos clave. Las muestras borradas se utilizan para la recopilación de datos crio-EM de alta resolución, seguida del procesamiento de imágenes para la determinación de la estructura. El peel-blot permite la determinación estructurada de cristales 2D de proteína de una sola capa que anteriormente eran demasiado gruesos para crio-EM.Además, puede concentrar varias muestras en capas individuales en una película de carbono.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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