In vivo Imágenes crónicas de dos fotones de microglia en el hipocampo del ratón
6 de julio de 2022
Este artículo describe un método para la observación crónica in vivo de la microglía en reposo en el hipocampo de ratón CA1 utilizando cirugía controlada con precisión y microscopía de dos fotones.
Las funciones de la microglía en el hipocampo aún no se comprenden completamente. Este protocolo puede obtener imágenes directas de cómo la microglía contacta y regula las neuronas. Las imágenes in vivo de la microglía en reposo y las neuronas en el hipocampo han sido muy difíciles.
Este método puede resolver este problema. Para implantar la ventana de observación, haga un surco circular de tres milímetros en el cráneo utilizando un punzón dérmico, asegurando la alineación del surco con el área previamente marcada. Cuando el punzón dérmico alcance la capa más interna del cráneo antes de tocar la duramadre subyacente, levante suavemente la isla ósea central con una aguja de calibre 30.
A continuación, retire con cuidado la duramadre con un recolector de dura. Aspirar la pia, los vasos piales y el tejido cortical de la superficie. Mantenga la profundidad de la superficie del tejido expuesto homogénea en toda la ventana craneal y profundice gradualmente la aspiración hasta que las fibras de la cápsula externa queden expuestas.
Después de colocar la punta de succión en la cápsula externa cerca del ventrículo lateral en el extremo rostrolateral de la ventana craneal, retire la capa superficial de la cápsula externa que corre en la dirección caudomedial a la dirección rostrolateral. Luego retire la capa interna que corre en la dirección mediolateral. Confirme la extracción de toda la cápsula externa comprobando la exposición completa de la superficie del alvéo y la comisura dorsal del hipocampo.
Después de asegurarse de que el sangrado se haya detenido por completo, llene el orificio con solución salina estéril hasta el nivel de la superficie del cráneo. A continuación, inserte el tubo de metal del fondo de vidrio verticalmente en el orificio mientras aspira el exceso de agua que se desborda desde los lados del tubo hasta que el fondo de vidrio presione ligeramente contra el alveo y aplane parcialmente el CA1 subyacente. Usando el cemento de resina dental, fije la pared del tubo insertado al cráneo circundante.
Coloque el ratón en el dispositivo de sujeción de la cabeza debajo de la lente del objetivo del microscopio de dos fotones y en la etapa de escaneo XY motorizada. Luego llene el espacio entre el fondo de vidrio y la lente del objetivo con agua sin crear burbujas de aire. Ajuste el enfoque a CA1 con la guía de fluorescencia emitida por el parénquima cerebral y la luz reflejada desde el borde del tubo de metal bajo iluminación continua por el láser pulsado.
Ajuste el ángulo de la cabeza del ratón inclinando el dispositivo de sujeción de la cabeza para que el fondo del cristal quede paralelo al plano de imagen. Luego ajuste el collar de corrección del objetivo para lograr la resolución más alta a una profundidad de la estructura objetivo en el CA1. A continuación, confirme que las células fluorescentes en la capa molecular del giro dentado o DG a una profundidad de 500 micrómetros desde el fondo del vidrio se visualizan en todo el campo de visión.
Solo en caso de una cirugía exitosa, las señales DG se pueden detectar inmediatamente. Elevar el ratón postoperatorio en una carcasa individual durante varias semanas. Coloque el ratón anestesiado bajo el microscopio de dos fotones.
Realizar las imágenes del hipocampo. Confirmar si la calidad y la intensidad de las imágenes captadas tras la reducción del edema postoperatorio son mejores o comparables a las captadas el día de la cirugía. Asegúrese de que la microglía ha recuperado su morfología ramificada.
A continuación, realice imágenes in vivo en la capa de interés en el CA1. La microglía en ratones CX3CR1-GFP capturados inmediatamente después de la cirugía no mostró una activación prominente. Después de una cirugía exitosa sin inducción de edema, las profundidades de imagen de dos fotones excedieron todas las capas de CA1 y alcanzaron los 500 micrómetros de la superficie quirúrgica.
La microglía en la fase crónica de más de tres semanas después de la cirugía exhibió una mayor intensidad y resolución fluorescente y una distribución más homogénea debido a la reducción del edema y la inflamación. La microglía en todas las capas ya restauró su morfología ramificada y exhibió cuerpos celulares inmóviles y procesos altamente modales. Las imágenes de alta resolución sobre todo el CA1 se proporcionaron durante varios meses.
Las señales de la microglía fluorescente ayudan a identificar las capas del hipocampo. La microglía en el alvéo tenía cuerpos celulares alargados y procesos que se extendían a lo largo de los tractos axonales. La microglía en el estrato piramidal podría distinguirse por la menor densidad de sus procesos.
La frontera entre el CA1 y el DG podía ser reconocida por los vasos sanguíneos gruesos que corrían a lo largo del límite, lo que se reconocía mejor etiquetando los vasos con sulforhodamine 101. Como ejemplo de aplicación, se obtuvieron imágenes simultáneas de la microglía positiva GFP y de las neuronas piramidales marcadas con tdTomato. El etiquetado neuronal ayudó a comprender las estructuras exactas de la capa del CA1.
El punto más importante es reducir el daño de la cirugía. Evite el daño tisular por aspiración. Aplique una presión suave al insertar el fondo de vidrio y evite que el cemento dental toque la superficie del cerebro.
Este enfoque ayudará a identificar el papel de la microglía en el hipocampo. Por ejemplo, cómo interactúan las microglías con las neuronas, cómo están involucradas en el aprendizaje y cómo controlan las enfermedades cerebrales.
Descripción general
Este estudio presenta un método para la imagenología crónica in vivo de microglía en reposo en la región CA1 del hipocampo de ratón, que utiliza un enfoque quirúrgico y microscopía de dos fotones. Investiga cómo la microglía interactúa con las neuronas y sus funciones en los procesos cerebrales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Neuroimagen
Antecedentes
- Las funciones de las microglías en el hipocampo no se comprenden completamente.
- El estudio mediante imágenes in vivo de microglías en reposo y neuronas ha presentado desafíos significativos.
- Este protocolo tiene como objetivo llenar el vacío identificado en la obtención de imágenes de microglías.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para observar el comportamiento de las microglías y su interacción con las neuronas.
- Reducir el daño quirúrgico durante el proceso de observación.
- Proporcionar información sobre los roles de las microglías en el aprendizaje y los trastornos cerebrales.
Métodos Utilizados
- Se empleó microscopía de dos fotones para la obtención de imágenes.
- La obtención de imágenes crónicas in vivo se centró en la región CA1 del hipocampo del ratón.
- El método implicó técnicas quirúrgicas precisas para minimizar el daño tisular.
- Se utilizaron tubos metálicos con fondo de vidrio para garantizar acceso óptico y estabilidad.
- Tras la cirugía, los ratones fueron monitoreados durante la recuperación y la obtención de imágenes se realizó varias semanas después.
Resultados principales
- Las microglías recuperaron su morfología ramificada y sus prolongaciones después de la cirugía.
- La resolución mejorada de la imagen permitió la observación detallada del comportamiento microglial.
- Se identificaron diferentes morfologías microgliales en las capas del hipocampo.
- Las interacciones neuronales se examinaron mediante imágenes duales de microglías marcadas con GFP y neuronas piramidales marcadas con tdTomato.
Conclusiones
- Este método permite la observación a largo plazo de la dinámica de las microglías in vivo.
- Los hallazgos respaldan la comprensión de las interacciones entre microglías y neuronas en el contexto del aprendizaje y la enfermedad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagenología crónica in vivo mediante microscopía de dos fotones de microglía en el hipocampo de ratón permite la observación directa y longitudinal de las interacciones entre microglía y neuronas en una región cerebral relevante para enfermedades. Esta capacidad facilita la desactivación de riesgos mecanicistas y la validación de dianas para programas de neuroinflamación y neurodegeneración. La imagenología de alta resolución y mínimamente invasiva a través de las capas del hipocampo mejora la confianza predictiva en programas de descubrimiento temprano y neurociencia traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa de la dinámica de los procesos microgliales y el contacto con neuronas in situ.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la correlación entre la morfología microglial y los estados neuronales.
- Facilita la reducción de riesgos mecanicistas para hipótesis terapéuticas dirigidas a la microglía.
- Proporciona resolución espacial y temporal para aclarar la participación de vías en circuitos hipocampales.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Establece una plataforma in vivo validada para cuantificar las respuestas microgliales a compuestos candidatos.
- Proporciona resultados de imagen cuantitativos y reproducibles para la estandarización de ensayos.
- Permite la evaluación de intervenciones que afectan las interacciones microglia-neurona en un contexto de tejido nativo.
- Facilita la escalabilidad para estudios longitudinales y la comparación cruzada de condiciones experimentales.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Se alinea con modelos relevantes para la investigación de la neurodegeneración y la neuroinflamación.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante el seguimiento del comportamiento de las microglías a lo largo del tiempo.
- Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo basadas en lecturas funcionales in vivo.
- Proporciona información sobre biomarcadores traslacionales al correlacionar fenotipos de imágenes con la progresión de la enfermedad.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de imagen abarca desde el descubrimiento temprano hasta la investigación preclínica, integrando estudios mecanicistas y validación traslacional en las líneas de investigación en neurobiología.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los roles de las microglías en la remodelación sináptica y la regulación neuronal.
- Selección: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles de imágenes para la evaluación de compuestos en tejido vivo.
- Análisis: Permite la medición de la morfología de las microglías, la motilidad de sus prolongaciones y las interacciones entre células en las diferentes capas del hipocampo.
- Investigación Traducional: Facilita la correlación con modelos de enfermedades y el desarrollo longitudinal de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma de imágenes in vivo reutilizable y adaptable a múltiples objetivos e intervenciones neurobiológicos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la validación de objetivos neuroinmunes.
- Valor operativo: Estandariza los flujos de trabajo de imágenes crónicas y mejora la reproducibilidad entre estudios.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al proporcionar datos longitudinales de alto contenido.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas de neuroinflamación y neurodegeneración.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microcirugía, microscopía de dos fotones y manejo de animales.
- Exige acceso a infraestructura avanzada de imágenes y capacidades de etiquetado con fluorescencia.
- Necesita una estandarización rigurosa entre equipos de los protocolos quirúrgicos y de obtención de imágenes.
- La adaptación a otras regiones cerebrales o modelos de enfermedad puede requerir optimización del protocolo.
- La inflamación transitoria posoperatoria limita la obtención inmediata de imágenes y requiere períodos de recuperación para lograr una calidad óptima de los datos.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Implantation of the Observation Window
2:34
Two‐Photon Microscopy Immediately After Surgery for Quality Check
3:55
In Vivo Chronic Two‐Photon Imaging of Microglia Using CX3CR1‐GFP Mice
4:29
Results: In Vivo Imaging of Microglia in CX3CR1‐GFP Mice
6:20
Conclusion
