Microtensómetro para microscopía confocal Visualización de interfaces dinámicas

El método combina un microscopio confocal con un microtensiómetro de presión capilar creando una poderosa herramienta que se puede utilizar para estudiar las interfaces de fluidos de curva a alta resolución espacial y temporal. Esta técnica puede examinar las relaciones de estructura y función para materiales tensioactivos tomando mediciones simultáneas de propiedades superficiales e imágenes confocales de morfologías superficiales en interfaces altamente curvadas. Nuestra hipótesis es que los productos de la inflamación inhiben el surfactante pulmonar que causa problemas respiratorios asociados con el síndrome de dificultad respiratoria precisa.

Esta puerta permite investigar las propiedades del surfactante pulmonar y la morfología y estabilidad pulmonar sometida a dichos materiales. Para comenzar, ensamble la celda CPM colocando el lado grande del capilar en la parte superior de la celda hasta que empuje hacia la parte inferior de la celda. Apriete suavemente el conector del pico para asegurar el capilar y luego conecte el tubo de la bomba microfluídica al lado grande del capilar.

Según sea necesario, conecte el depósito de intercambio de disolventes y/o el baño de control de temperatura a las entradas y salidas respectivas de la celda CPM. De lo contrario, enchufe las entradas y salidas no utilizadas. Conecte la celda CPM a la etapa del microscopio confocal alineándola aproximadamente con el objetivo CFM, la cámara CPM y la fuente de luz CPM.

Abra el flujo de gas a la bomba microfluídica a la presión de funcionamiento recomendada de la bomba y asegúrese de que el flujo al capilar esté abierto. Comience a ejecutar la interfaz virtual CPM configurando la presión de referencia a 25 milibares y cambie al modo de control de presión. A continuación, llene la celda CPM con agua con una pipeta.

Concéntrese en la punta capilar con la cámara del microtensiómetro y coloque el annus para superponer la burbuja. Ponga el objetivo de inmersión del microscopio confocal en contacto con el líquido en la célula y enfoque la burbuja usando el microscopio confocal. Haga clic en restablecer burbuja y asegúrese de que se haya formado una nueva burbuja.

Si la burbuja no explota, aumente la presión de restablecimiento o aumente el tiempo de retardo de restablecimiento en la pestaña de restablecimiento de burbuja debajo de la ventana de visualización. Saque el agua a través de la jeringa directa a la celda, vacíela y vuelva a conectarla. Llene la celda con la muestra deseada.

El uso de una pipeta esterilizada en autoclave mantiene el software CPM en modo de control de presión, asegurando que la tensión superficial inicial sea de alrededor de 73 mili Newton por metro cuando se crea una nueva interfaz de burbuja. Después de determinar el radio de la burbuja recién formada, ingrese ese valor en el control de área de línea central y cambie el tipo de control a control de área haciendo clic en la pestaña de control de área. Comience a grabar el video confocal, luego haga clic en restablecer burbuja e inmediatamente haga clic en recopilar datos.

Ajuste la velocidad de grabación de datos de acuerdo con el tiempo total de absorción de la muestra deslizando la barra. Después del final del experimento. Guarde el archivo eligiendo la ruta de archivo correcta y haciendo clic en el botón Guardar.

Detenga y guarde la grabación en el CFM también. Introduzca el valor de referencia deseado porcentaje de oscilación y frecuencia de oscilación y seleccione la ficha correspondiente decidiendo si la oscilación será una oscilación de presión, una oscilación de área o una oscilación de curvatura. Comience a grabar el video confocal y haga clic en recopilar datos en el software CPM.

Elija una velocidad de adquisición de datos para dar un número adecuado de puntos de datos para cada ciclo de oscilación. Si se desean otras amplitudes o frecuencias de oscilación, cambie los valores durante el experimento y guarde los resultados. Primero, inserte el tubo de entrada de la bomba peristáltica en la botella de solución de intercambio deseada e inserte el tubo de salida en el contenedor de residuos.

Comience a grabar el video en el software confocal y luego haga clic en recopilar datos en el software CPM. A continuación, ajuste la velocidad de la bomba peristáltica. Si es necesario intercambiar varios fluidos, detenga la bomba peristáltica y conecte la entrada a otra solución de intercambio.

Una vez finalizado el intercambio, guarde los resultados como se demostró anteriormente. Los resultados del microtensiómetro para una absorción de presión constante demostraron que el área de superficie de la burbuja aumenta significativamente a lo largo del estudio y conduce a una absorción mucho más lenta que el caso del área de superficie constante. Durante el proceso de absorción, la señal fluorescente de la interfaz comenzó baja y aumentó a medida que el surfactante se absorbe en la interfaz.

Si el surfactante forma dominios superficiales, estos dominios se pueden observar formándose y creciendo. Cuando se realiza un estudio de oscilación, la oscilación solo es verdaderamente sinusoide para el parámetro que se está controlando. Como se muestra aquí para un estudio controlado por área superficial, esto es importante al calcular el módulo dilatacional superficial ya que la oscilación en el área debe ser sinusoidal.

Los datos de tensión superficial y área recopilados de un estudio de oscilación se utilizaron para calcular directamente el módulo dilatacional interfacial de la capa de surfactante. Al oscilar una capa mono de fosfolípido, el movimiento de los dominios condensados de líquido negro se puede observar a lo largo de la fase expandida de líquido coloreado continuo. Los distintos dominios en la interfaz se reorganizaron en una red de ramificación que creció para cubrir la interfaz a medida que las oscilaciones tenían lugar en la burbuja curva.

Esto es corroborado por un cambio simultáneo en la tensión superficial y el módulo dilatador superficial. Durante un estudio de intercambio disolvente para una monocapa de surfactante pulmonar con solución tampón y luego solución de lazo PC, la morfología de los dominios cambió drásticamente a medida que se producía el intercambio. Es importante seguir visualmente la oscilación y fijación de la burbuja para asegurarse de que el capilar sea cuadrado y la burbuja mantenga su forma esférica.

Además de las interfaces aire-agua, también se pueden estudiar las interfaces aceite-agua para determinar la estabilidad y las propiedades de las emulsiones. Esta técnica ofrece un enfoque de cambios único para construir relaciones de propiedad de estructura de interfaces de curva. Permite una nueva exploración de los factores que gobiernan la morfología interracial que anteriormente solo se estudiaban en interfaces planas.