Name: Desarrollo de líneas celulares musculares knock-out utilizando la edición de genes CRISPR/Cas9 mediada por lentivirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende a generar líneas celulares musculares knock-out mediante edición CRISPR/Cas9 mediada por lentivirus. Este método permite estudiar funciones génicas en mioblastos humanos de forma más rápida y económica que los modelos animales tradicionales.

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Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) y de Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA).

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Un paso importante en el camino hacia la caracterización de genes de función desconocida implicados en patologías es el desarrollo de modelos celulares relevantes para estudiar la función de estos genes. El uso de la edición de genes utilizando CRISPR / Cas9 es un campo de investigación en crecimiento exponencial, y el desarrollo de modelos knock-out como se presenta aquí se encuentra entre sus aplicaciones más utilizadas. En este contexto, proponemos aquí un protocolo versátil para desarrollar un knock-out de línea celu...

Con el progreso de la secuenciación de genes y la identificación de mutaciones en genes de funciones desconocidas en un tejido específico, el desarrollo de modelos celulares relevantes para comprender la función de un nuevo gen objetivo y confirmar su participación en los mecanismos fisiopatológicos relacionados constituye una herramienta esencial. Además, estos modelos son de gran importancia para futuros desarrollos terapéuticos 1,2, y constituyen una alternativa interesante al desarrollo de modelos animales knock-out en línea recta con las recomendaciones internacionales para la reducción del uso de animales en experimentación. La edición de genes utilizando CRISPR / Cas9 se encuentra entre las herramientas más poderosas actualmente disponibles, lo que ha permitido el desarrollo de muchos modelos knock-out / knock-in, y la validación de genes dirigidos utilizando CRISPR / Cas9 se encuentra entre las aplicaciones más utilizadas de CRISPR / Cas93. El éxito de la edición de genes se basa en la capacidad de introducir las herramientas CRISPR (la guía de ARN y la nucleasa Cas9) en el modelo de célula objetivo, lo que puede ser un desafío en muchas células difíciles de transfectar, como las células musculares4. Este desafío se puede superar con el uso de virus, generalmente lentivirus, que tiene la gran ventaja de transducir eficientemente muchos tipos de células y entregar su transgén. Pero su mayor inconveniente es la integración del transgén en el genoma de la célula huésped, lo que lleva a una posible alteración de los genes localizados en el sitio de integración y a la expresión permanente del transgén, lo que en el caso de la nucleasa Cas9 tendría consecuencias perjudiciales5. Merienne y sus colegas6 han propuesto una solución inteligente, que consiste en la introducción en las células de un ARN guía dirigido al propio gen Cas9, lo que lleva a la inactivación de Cas9. Una adaptación de esta estrategia se presenta aquí como un protocolo fácil de usar y versátil que permite eliminar prácticamente cualquier gen en células difíciles de transfectar.
El objetivo del protocolo aquí presentado es inducir la inactivación de un gen de interés en células musculares inmortalizadas. Se puede utilizar para eliminar cualquier gen de interés, en diferentes tipos de células inmortalizadas. El protocolo aquí descrito contiene pasos para diseñar los ARN guía y su clonación en plásmidos lentivirales, para producir las herramientas CRISPR en vectores lentivirales, para transducir las células con los diferentes lentivirus y para clonar las células para producir una línea celular editada homogénea.
Usando este protocolo, se han desarrollado células musculares esqueléticas humanas inmortalizadas con la deleción del receptor de rianodina tipo 1 (RyR1), un canal de calcio esencial involucrado en la liberación intracelular de calcio y la contracción muscular7. El knock-out (KO) del gen se ha confirmado a nivel de proteína usando Western blot, y a nivel funcional usando imágenes de calcio.

<table><tbody><tr><td>Anticuerpo anti-CACNA1S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>Enzima de restricción</td></tr><tr><td>CalPhos Kit de transfección de mamíferos</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp;</td><td>Kit de transfección</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario Easy blot anti IgG de ratón</td><td>GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP Anticuerpo secundario</td></tr> anti <tr><td>IgG de conejo</td><td>GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Fluo-4 directo</td><td>Sondas moleculares</td><td>F10472</td><td>Imágenes de calcio</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Conejo mAb&nbsp;</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>#2118</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>Enzima de restricción</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>Kit de ligadura</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion de alta fidelidad con GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>Mix para reacción de PCR con polimerasa Taq de alta fidelidad y anticuerpo de cadena pesada miosina dNTPs</td></tr><tr><td></td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp; 740424</td><td>Kit de Maxipreparación para la purificación de plásmidos</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel y PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>Purificación de ADN</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td><td></td><td>Kit de 740952 para la extracción de ADN de la célula</td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Químicamente competente&nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>Células químicamente competentes</td></tr><tr><td>Plásmido #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>Plásmido lentiviral que codifica el SpCas9 (para LV-Cas9)</td></tr><tr><td>Plásmido #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>Columna vertebral lentiviral para la inserción de casete con guías (para LV-guide-target)</td></tr><tr><td>Plásmido #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Plásmido lentiviral que codifica empaquetamiento lentiviral GAG POL</td></tr><tr><td>Plásmido #8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Proteína de envoltura que codifica plásmido lentiviral para producir partículas retrovirales lentivirales y MuLV</td></tr><tr><td>V5 Tag Monoclonal</td><td>Antibody Invitrogene</td><td>R96025&nbsp;</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>XL10-Gold Células ultracompetentes</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>Células químicamente competentes</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Enzima de restricción</td></tr></tbody></table>

desarrollo de líneas celulares musculares knock-out utilizando la edición de genes crispr/cas9 mediada por lentivirus

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

Una aplicación importante de las repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas reguladoras agrupadas (CRISPR)/Cas 9 es el desarrollo de líneas celulares knock-out, específicamente para estudiar la función de nuevos genes/proteínas asociados con una enfermedad, identificados durante el diagnóstico genético. Para el desarrollo de tales líneas celulares, dos cuestiones principales deben desenredarse: la inserción de las herramientas CRISPR (el Cas9 y el ARN guía) con alta eficiencia en las células elegidas, y la restricción de la actividad cas9 a la deleción específica del gen elegido. El protocolo aquí descrito está dedicado a la inserción de las herramientas CRISPR en células difíciles de transfectar, como las células musculares. Este protocolo se basa en el uso de lentivirus, producidos con plásmidos disponibles públicamente, para los cuales se describen todos los pasos de clonación para dirigirse a un gen de interés. El control de la actividad de Cas9 se ha realizado mediante una adaptación de un sistema previamente descrito llamado KamiCas9, en el que la transducción de las células con un lentivirus que codifica un ARN guía dirigido al Cas9 permite la abolición progresiva de la expresión de Cas9. Este protocolo se ha aplicado al desarrollo de una línea celular muscular humana RYR1-knock out, que se ha caracterizado aún más a nivel proteico y funcional, para confirmar el knockout de este importante canal de calcio implicado en la liberación de calcio intracelular muscular y en el acoplamiento excitación-contracción. El procedimiento descrito aquí se puede aplicar fácilmente a otros genes en las células musculares o en otras células difíciles de transfectar y producir herramientas valiosas para estudiar estos genes en las células humanas.

Este protocolo se aplicó a mioblastos inmortalizados de un sujeto sano15 (las llamadas células HM, para mioblastos humanos), en el que previamente se ha caracterizado el RyR116, con el fin de eliminar el gen RYR1 que codifica la proteína RyR1. El diseño de las guías de ARN se realizó para eliminar la secuencia que abarca parte del exón 101 y el intrón 101 del gen. Se prevé que la eliminación de parte del exón 101 provoque la interrupción del marco de lectura. Ademá...

El protocolo describe cómo generar mioblastos knock-out utilizando CRISPR/Cas9, desde el diseño de arneses guía hasta la clonación celular y caracterización de los clones knock-out.

Desarrollo de líneas celulares musculares knock-out utilizando la edición de genes CRISPR/Cas9 mediada por lentivirus

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Este protocolo permite el desarrollo de la eliminación de células musculares en cualquier gen, con el fin de estudiar más a fondo la función de este gen en el músculo. La ventaja es que es barato y más rápido que el desarrollo de animales knock-out para estudiar cualquier gen. Esta técnica se puede utilizar, por ejemplo, para estudiar la implicación de un gen recién identificado en una miopatía.Si la técnica descrita aquí se aplica a las células iPS, puede conducir al desarrollo de células knock-out para cualquier gen en cualquier tipo de células. Para comenzar a agrupar repeticiones palindrómicas cortas regularmente interespaciadas o la deleción de genes mediada por CRISPR, primero use herramientas de navegador del genoma como ensembl. org para identificar el gen objetivo junto con las secuencias de ADN en ambos lados del mismo.Para obtener la lista de los exones genéticos, primero haga clic en la transcripción de la secuencia codificante de proteínas y luego en Exones. A continuación, haga clic en Descargar secuencia y seleccione solo Secuencia genómica para descargar la secuencia de consenso completa de todo el gen. Desplácese por la lista de los exones e intrones del gen para seleccionar los dirigidos.Para diseñar el ARN guía, primero seleccione las secuencias de nucleótidos de los intrones inmediatamente aguas arriba y aguas abajo de la secuencia objetivo. Luego vaya a un sitio web como crispr.tefor. net y use las secuencias seleccionadas para diseñar dos ARN guía, cada uno de 20 nucleótidos de largo sin el Motivo Adyacente protoespaciador separado por unos pocos cientos de pares de bases.A continuación, determine la secuencia inversa del complemento para cada ARN guía y ordene los cebadores. Para construir casetes de ARN guía para la clonación de plásmidos, primero ejecute una PCR con un conjunto de cebadores utilizando la receta y el programa descritos en el texto, luego separe los productos de PCR en gel de agarosa al 1% utilizando el tampón Tris-borate-EDTA. A continuación, elimine el fragmento del par de 300 bases y purifique con un kit.Del mismo modo, después de ejecutar otra PCR con el otro conjunto de imprimación, purifique un fragmento de ADN largo de 400 pares de bases en 20 microlitros de tampón de elución. Para insertar los casetes de ARN guía en una columna vertebral de plásmido lentiviral, primero configure una reacción de doble digestión del plásmido con las enzimas de restricción Xma 1 y Blp 1 como se describe en el texto. Después de incubar el tubo de reacción a 37 grados Celsius durante una hora, incube a 65 grados Celsius durante 20 minutos, luego ejecute el producto de digestión en un gel de agarosa al 1% y purifique el plásmido de aproximadamente 10 pares de kilobases utilizando un kit apropiado.También cuantificar el producto purificado midiendo la densidad óptica. Para ligar el casete de ARN guía con el plásmido, prepare una mezcla de reacción con el ARN guía purificado, el ADN plásmido linealizado, la enzima y el agua a un volumen final de 10 microlitros, luego incube el tubo de reacción a 50 grados Celsius durante 15 minutos para generar el plásmido final, llamado pGuide. Para la producción de lentivirus, primero sembra una placa de 145 centímetros con 1 millón de células HEK 293 en DMEM con alta glucosa y piruvato suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina o estreptomicina.Luego cultive las células a 37 grados Celsius durante tres días en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Al cuarto día, verifique las células para garantizar una confluencia del 60 al 65%. A continuación, prepare la solución de transfección que consiste en el plásmido de interés, el plásmido que codifica la envoltura del virus, el plásmido de empaque lentiviral psPAX2 y el fosfato de calcio.Ajuste el volumen final a 1000 microlitros con agua. A continuación, agregue la solución de transfección gota a gota a un mililitro de 2X HBS bajo agitación e incube a temperatura ambiente durante al menos 10 minutos. Después de eso, agregue la solución gota a gota a las celdas.Para una distribución homogénea de la solución de transfección, incline suavemente la placa en todas las direcciones, luego incube las células a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono al 5% durante al menos cinco horas. A continuación, retire los medios de las placas y lave las células con PBS para deshacerse de los reactivos de transfección, luego agregue 12 mililitros de medio fresco. Después de 48 horas de incubación a 37 grados centígrados, agrupe los medios de todas las placas en un tubo.Coloque el tubo en un cucharón sellado y centrífuga a 800 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius, luego filtre el sobrenadante usando un filtro de 0.45 micrómetros y centrífique el filtrado a 68, 300 veces G durante dos horas a cuatro grados Celsius, usando un rotor de cucharón oscilante. Después de retirar el sobrenadante, mantenga los tubos boca abajo en una toalla de papel en un gabinete de seguridad durante cinco a 10 minutos para la máxima eliminación del líquido de los gránulos. Agregue 100 microlitros de medio de proliferación de HEC y mantenga los tubos a cuatro grados centígrados durante al menos dos horas.Luego vuelva a suspender el pellet mediante pipeteo. Después de recolectar todos los gránulos resuspendidos, haga alícuotas de 10 o 25 microlitros, luego almacene las alícuotas a menos 80 grados Celsius después de la congelación instantánea en hidrógeno líquido. Para la transducción de mioblastos, primero sembra cada pocillo de una placa de 96 pocillos con 100 microlitros de medio de proliferación que contiene 10, 000 células de mioblastos.Al día siguiente, agregue volúmenes precalculados de guías LV y LV Cas9 a las celdas en un gabinete de seguridad. Después de cinco días de incubación, libere las células del pozo agregando tripsina. Después de contar los números de células, transfiera las células de los pozos con 40 a 50% de confluencia a una nueva placa.Después de cinco horas de incubación, agregue volúmenes calculados de LV killer a una multiplicidad de infección de 20 e incube durante cinco a 10 días o al menos dos pasajes intermedios. Para la caracterización funcional de los clones editados genéticamente por imágenes de calcio, placa 50, 000 células en el centro de un plato de 35 milímetros recubierto de laminina. Para inducir la diferenciación, agregue el medio de diferenciación como se describe en el texto.Después de seis días de incubación, retire el medio de cultivo y delinee las células con una pluma hidrofóbica. Luego agregue 50 microlitros de Fluo-4 Direct, diluidos uno a uno en medio de diferenciación, a los miotubos diferenciados. Después de incubar los platos a 37 grados centígrados durante 30 minutos, lave las células dos veces con el tampón Krebs complementado con un miligramo por mililitro de glucosa.A continuación, use un microscopio de fluorescencia invertida o un microscopio confocal con un objetivo 10X para medir las variaciones de fluorescencia a una velocidad de un cuadro por segundo durante 90 segundos y elija un campo con al menos 10 miotubos. Después de eliminar el tampón Krebs adicional, estimule las células con dos mililitros de cloruro de potasio para la despolarización de la membrana o dos mililitros de metacresol florocloral o estimulación directa 4CmC o RyR1. Visualice la variación de fluorescencia después de la estimulación, luego cuantifique la variación de fluorescencia en cada miotubo.Este protocolo podría usarse con éxito para eliminar el gen RyR1 de los mioblastos humanos, lo que resultó en un ADN genómico más corto en las células. El knock-out de RyR1 también se confirmó a nivel de proteína, ya que la proteína RyR1 no pudo ser detectada en las células objetivo por Western blotting. La ausencia de actividad de RyR1 en los miotubos diferenciados de las células knock-out de RyR1 se verificó aún más mediante imágenes de calcio Fluo-4 después de la estimulación directa de RyR1 por 4CmC o la estimulación indirecta por la despolarización de la membrana inducida por cloruro de potasio.La secuencia que se eliminará debe ser necesaria para la predicción de una proteína funcional. Esta técnica es ideal para el desarrollo de herramientas post-genómicas para estudiar la implicación de nuevos genes en la enfermedad muscular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El sistema / Cas9 CRISPR ofrece el potencial para que la edición del genoma específico accesible y asequible para la comunidad científica. Este protocolo está destinado a demostrar cómo crear virus que Knockout un gen de interés utilizando el sistema / Cas9 CRISPR y, a continuación, inyectarlos estereotáxica en el cerebro del ratón adulto.

Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

Los recientes avances en la capacidad de manipular genéticamente las líneas celulares somáticas tienen un gran potencial para la investigación básica y aplicada. En este sentido, presentamos dos enfoques para CRISPR / Cas9 generado producción de eliminación y el cribado en líneas de células de mamíferos, con y sin el uso de marcadores seleccionables.

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

Aquí, presentamos un protocolo para modificar genéticamente las células primarias o ampliadas humano naturales del asesino (NK) usando Cas9 ribonucleoproteínas (Cas9/RNPs). Mediante este protocolo, hemos generado las células NK humanas deficientes para el receptor 2 del factor de crecimiento-b de transformación (TGFBR2) y la hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).

Generación de células NK humano primario y ampliado de Knock-out utilizando ribonucleoproteínas Cas9

Se describen protocolos para la edición del genoma altamente eficiente de células madre hematopoyéticas murinas (HSPC) por el sistema CRISPR/Cas9 para desarrollar rápidamente sistemas de modelos de ratón con modificaciones genéticas específicas del sistema hematopoyético.

Edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 para el estudio de células hematopoyéticas en modelos de enfermedades

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar modelos de ratón modificados genéticamente utilizando células madre embrionarias, especialmente para ADN grande knock-in (KI). Este protocolo se ajusta utilizando la edición del genoma CRISPR / Cas9, lo que resulta en una eficiencia de KI significativamente mejorada en comparación con el método convencional de orientación de ADN linealizado mediado por recombinación homóloga.

Focalización génica altamente eficiente mediada por CRISPR/Cas9 en células madre embrionarias para desarrollar modelos de ratón manipulados genéticamente

A medida que los protocolos relacionados con CRISPR se vuelven cada vez más útiles y accesibles, aún pueden surgir complicaciones y obstáculos en condiciones experimentales específicas. Este protocolo describe la creación de una línea celular humana knockout de serina/treonina-proteína quinasa 1 (RIPK1/RIP1) que interactúa con el receptor utilizando CRISPR/Cas9 y destaca los posibles desafíos encontrados durante este proceso.

Generación de una línea celular RIP1 knockout U937 utilizando el sistema CRISPR-Cas9

El método presentado describe la generación de un knockout génico mediado por CRISPR en la línea H9 de células madre embrionarias humanas (hESC), que expresa de manera estable sgRNAs dirigidos al gen L2HGDH utilizando un sistema de entrega de genes mediado por lentivirales altamente eficiente.

Deleción génica mediada por CRISPR-Cas9 en células madre pluripotentes humanas cultivadas en condiciones libres de alimentadores

La línea celular THP-1 se utiliza ampliamente como modelo para investigar las funciones de los monocitos/macrófagos humanos en diversas áreas de investigación relacionadas con la biología. Este artículo describe un protocolo para la ingeniería eficiente basada en CRISPR-Cas9 y el aislamiento de clones de una sola célula, lo que permite la producción de datos fenotípicos robustos y reproducibles.

Knockout génico mediado por CRISPR-Cas9 basado en electroporación en células THP-1 y aislamiento de clones de una sola célula

Los detalles se presentan sobre cómo mapeo QTL con un mapa genético basado en la secuencia del genoma completo se puede utilizar para identificar un gen de resistencia a los medicamentos en Toxoplasma gondii y cómo esto se puede verificar con el sistema CRISPR / Cas9 que edita eficientemente un objetivo genómico, en este caso el Gen de resistencia a fármacos.

QTL Mapping y CRISPR / Cas9 Edición para identificar un gen de resistencia a fármacos en<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Aprende a generar líneas celulares musculares knock-out mediante edición CRISPR/Cas9 mediada por lentivirus. Este método permite estudiar funciones génicas en mioblastos humanos de forma más rápida y económica que los modelos animales tradicionales.

Desarrollo de líneas celulares musculares knock-out utilizando la edición de genes CRISPR/Cas9 mediada por lentivirus

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