Name: Construcción de un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana para recapitular la tensión biomecánica en la pared aórtica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 47 s
Description: Aprende a construir un modelo de órgano en chip con células musculares lisas de aorta humana para simular la tensión biomecánica vascular. Esta plataforma permite el cribado de fármacos y avances en medicina personalizada para enfermedades aórticas.

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Los autores reconocen que este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Comisión de Ciencia y Tecnología de la Municipalidad de Shanghai (20ZR1411700), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81771971) y el Programa de Vela de Shanghai (22YF1406600).

Las muestras aórticas humanas se utilizaron para el aislamiento primario de HASMC bajo la aprobación del Hospital Zhongshan, Comité de Ética de la Universidad de Fudan (NO. B2020-158). Se recolectaron muestras aórticas de pacientes que se sometieron a cirugía de aorta ascendente en el Hospital Zhongshan, Universidad de Fudan. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes antes de participar.
1. Aislamiento primario de células del músculo liso aórtico humano
<ol><li>Lave la región lateral derecha de la aorta ascendente con PBS estéril, 1x-2x.</li>
	<li>Retire las capas íntima y adventicia del tejido con dos pinzas oftálmicas y retenga la capa de medios para cosechar las células.</li>
	<li>Coloque la capa de medios en una fuente de cultivo de 10 cm y córtela en trozos pequeños (2-3 mm) con tijeras. Agregue 5 ml de medio de cultivo de células musculares lisas (SMCM) que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina.</li>
	<li>Mueva el tejido pequeño al frasco de cultivo con un gotero estéril, extendiendo el tejido uniformemente. Deseche el medio de cultivo tanto como sea posible, luego invierta la botella boca abajo.</li>
	<li>Añadir 2 ml de SMCM en el frasco de cultivo invertido y colocarlo en la incubadora (5%CO2) a 37 °C durante 1-2 h, luego girarlo lentamente hacia arriba y añadir otros 2 ml de SMCM.</li>
	<li>Después de 5-7 días de incubación, cambie el SMCM con 4 ml de SMCM fresco. Generalmente, las células esporádicas del músculo liso salen en aproximadamente 2 semanas.</li>
	<li>Deseche lentamente el SMCM y agréguelo lentamente al cambiar el medio. Transporte la botella de cultivo lentamente cuando se mueva a una estación de microscopio; De lo contrario, los tejidos flotarán y las células crecerán lentamente.</li>
	<li>Cuando las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, lavar con 2 ml de PBS, digerir con 2 ml de tripsina al 0,25% y dividirlas en dos nuevos frascos de cultivo con 4 ml de SMCM fresco.</li>
	<li>Identificar las células a través de un análisis de inmunofluorescencia de cuatro marcadores específicos diferentes para las células del músculo liso (CNN1, SM22)14.</li>
</ol>2. Preparación del chip PDMS
<ol><li>Para polimerizar PDMS, agregue el agente de curado (componente B) a la base (componente A) en una relación de peso de A: B = 10: 1 w / w / w y mezcle el complejo completamente durante 5 min; El volumen depende de la necesidad del estudio.</li>
	<li>Coloque el gel PDMS preparado en un tanque de extracción al vacío durante 30-60 min y mantenga la presión por debajo de -0.8 mPa. NOTA: La alta presión conducirá a una extracción insuficiente de pequeñas burbujas dentro del gel PDMS que afectarán el siguiente paso de la fabricación de chips.</li>
	<li>Utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD), diseñe el molde con una estructura de marco externo de 100 mm × 40 mm × 8 mm y un canal de 70 mm × 6 mm × 4 mm.</li>
	<li>Haga a medida los moldes de las tres capas utilizando una máquina de grabado de control numérico computarizado de alta precisión. Talle el marco de los moldes y los microcanales utilizando placas de polimetacrilato de metilo (PMMA) y luego péguelos en otra placa de PMMA.</li>
	<li>Vierta el gel PDMS preparado en un molde con un marco exterior de 100 mm × 40 mm × 6 mm y un canal de 70 mm × 6 mm × 4 mm, y luego reticulación a 70 °C durante 1-2 h.</li>
	<li>Despegue las losas PDMS reticuladas del molde y corte las membranas PDMS comercializadas en secciones de 100 mm × 40 mm.</li>
	<li>Tratar las tres losas de PDMS preparadas y dos membranas de PDMS con plasma de oxígeno durante 5 min para la activación de la superficie de PDMS. Aplique los siguientes ajustes específicos: aire ambiente como gas de proceso; presión ajustada a -100 kPa; corriente establecida en 180--200 Ma; voltaje ajustado a 200 V; Tiempo de proceso a 5 min.</li>
	<li>Perfore agujeros en las tres losas PDMS utilizando un perforador de orificios de 1 mm para hacer la entrada y salida de aire y microcanales medios en el chip PDMS.</li>
	<li>Unir tres losas PDMS y dos membranas PDMS juntas en el orden: canal de aire PDMS slab (capa superior) - membrana PDMS - placa PDMS de canal medio (capa media) - membrana PDMS- canal de aire PDMS slab (capa inferior). Realice este paso bajo un microscopio estereoscópico a 4x para superponer completamente los microcanales de aire con los microcanales medios.</li>
	<li>Coloque el chip PDMS ensamblado en una incubadora a 70 °C durante 1 h.</li>
	<li>Prepare varias mangueras de látex de 1 mm de diámetro interior y 3 cm de longitud. Inserte una aguja de acero inoxidable de 1 mm de diámetro exterior y 1 cm de largo en un extremo de la manguera preparada, y luego inserte un Luer en el otro extremo de la manguera para crear el tubo conectado a los microcanales de aire y medio del chip PDMS.</li>
	<li>Inserte los tubos preparados en las salidas y entradas de los microcanales de aire y medio en el chip PDMS.</li>
</ol>3. Tratamiento y esterilización de la superficie del chip PDMS
<ol><li>Infundir 2 ml de colágeno de ratón de 80 mg/ml en el microcanal medio del chip PDMS usando una jeringa de 2 ml e incubar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Después de la incubación, retire el colágeno del canal y recoja con una jeringa de 2 ml. Coloque los chips PDMS recubiertos de colágeno en una incubadora a 60 °C durante la noche.</li>
	<li>Coloque los chips PDMS en un esterilizador UV durante más de 1 h. Coloque los chips PDMS esterilizados en un banco ultralimpio en preparación para el experimento celular.</li>
</ol>4. Siembra de células en el chip PDMS y proceso de estiramiento de células
<ol><li>Cultivo 4 x 10 5 células musculares lisas humanas primarias (HASMC) de pacientes que utilizan medio de células musculares lisas (SMCM) que contienen 2% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina en una incubadora deCO2 al5% a 37 °C.</li>
	<li>Cuando la densidad de HASMC alcance el 80%, deseche el SMCM y lave las células con 2 mL de PBS.</li>
	<li>Digerir las células usando 1 mL de tripsina al 0,25% durante 2 min y centrifugar a 100 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 ml de SMCM fresco. Use 8 ml de SMCM para cultivar las células en una placa de cultivo de 10 cm.</li>
	<li>Calcular el número de células utilizando un citómetro y utilizar las células a una concentración final de 2 x 105 células/ml.</li>
	<li>Vierta lentamente 2 ml de PBS en el microcanal medio del chip PDMS recubierto de colágeno y esterilizado y luego deséchelo con una jeringa de 2 ml.</li>
	<li>Vierta lentamente un total de 2 ml de 2 x 105 células /ml de suspensión HASMC en el microcanal medio del chip PDMS utilizando una jeringa de 2 ml. A continuación, cierre el Luer en la entrada y salida del chip PDMS. Colocar el chip PDMS en una incubadora (5%CO2) a 37 °C durante 1 día.</li>
	<li>Después de que las células se unen a la membrana PDMS en el chip PDMS, casi después de 24 h, conecte la salida del microcanal de aire en el chip PDMS al sistema de control de vacío. Cuando la célula está unida, se puede ver una forma celular alargada y normal bajo el microscopio, contrastando con las células redondas suspendidas.</li>
	<li>Encienda la válvula solenoide y la bomba de vacío. Abra el regulador de vacío y ajuste el nivel de presión a 10 kPa para una deformación de 7,18 ± 0,44 % y 15 kPa para una deformación de 17,28 ± 0,91 %.</li>
	<li>Una vez ajustados los parámetros del sistema de control, colocar los chips PDMS en una incubadora (5%CO2) a 37 °C y estirar durante 24 h.</li>
</ol>5. Preparación del sistema de control mecánico
<ol><li>Prepare varias válvulas solenoides, filtros de vacío, reguladores de vacío, una bomba de vacío, una bomba peristáltica y un controlador lógico programable (PLC) que controle la válvula solenoide.</li>
	<li>Programe el controlador PLC y ajuste el intervalo de tiempo de encendido / apagado a 1 Hz. Conecte las válvulas solenoides al controlador programado.</li>
	<li>Conecte la entrada de la bomba de vacío a los filtros de vacío y, a continuación, conecte la salida de los filtros de vacío a los reguladores de vacío. Conecte la salida de los reguladores de vacío a las válvulas solenoides y, finalmente, conecte la salida de las válvulas solenoides a las salidas de los microcanales de aire de los chips PDMS.</li>
	<li>Conecte la salida de la bomba peristáltica a la entrada del microcanal medio del chip PDMS y la entrada de la bomba peristáltica a la salida del chip PDMS de microcanal medio para el reemplazo del medio de cultivo y el manejo de fármacos.</li>
	<li>Ajuste la amplitud de la deformación por el regulador y la frecuencia de deformación por el microcontrolador.</li>
</ol>

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<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arterial+wall+stress+induces+phenotypic+switching+of+arterial+smooth+muscle+cells+in+vascular+remodeling+by+activating+the+YAP%2FTAZ+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Arterial wall stress induces phenotypic switching of arterial smooth muscle cells in vascular remodeling by activating the YAP/TAZ signaling pathway.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 51 (2), 842-853 (2018).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con el rápido desarrollo de la tecnología microfluídica, en los últimos años han surgido modelos OOC que pueden replicar la función biológica y la estructura de uno o más órganos in vitro para aplicaciones en biología, medicina y farmacología15. La OOC puede simular funciones clave del microambiente fisiológico humano, esencial para explorar los mecanismos de la enfermedad y promover la traducción preclínicade fármacos 8,16. Aunqu...

El aneurisma y disección aórtica torácica (TAAD) es una dilatación o delaminación localizada de la pared aórtica que se asocia con alta morbilidad y mortalidad1. Las células del músculo liso aórtico humano (HASMC) desempeñan un papel vital en la patogénesis de TAAD. Las HASMC no son células terminalmente diferenciadas, y las HASMC conservan una alta plasticidad, lo que les permite cambiar fenotipos en respuesta a diferentes estímulos2. Los HASMC se someten principalmente a tensión rítmica in vivo, y este es uno de los factores clave que regulan los cambios morfológicos del músculo liso, la diferenciación y las funciones fisiológicas 3,4. Por lo tanto, no se puede ignorar el papel de la deformación cíclica en el estudio de los HASMC. Sin embargo, los cultivos celulares 2D convencionales no pueden replicar la estimulación biomecánica de la cepa cíclica experimentada por los HASMC in vivo. Además, la construcción de un modelo animal de TAAD no es adecuada para algunos tipos de TAAD, como la TAAD relacionada con la válvula aórtica bicúspide (BAV). Además, no se puede ignorar la brecha entre los estudios clínicos en humanos y los experimentos con animales. Dificulta la traducción farmacéutica en la práctica clínica. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de sistemas más complejos y fisiológicos para simular el entorno biomecánico in vivo en la investigación de enfermedades aórticas.
Los experimentos con animales utilizados en la investigación biomédica y el desarrollo de fármacos son costosos, lentos y éticamente cuestionables. Además, los resultados de los estudios en animales con frecuencia no logran predecir los resultados obtenidos en los ensayos clínicos en humanos 5,6. La falta de modelos preclínicos humanos y la alta tasa de fracaso en los ensayos clínicos han resultado en pocos medicamentos efectivos para la clínica, lo que ha aumentado los costos de atención a la salud7. Por lo tanto, es urgente encontrar otros modelos experimentales para complementar los modelos animales. La microfabricación y las técnicas microfluídicas se han desarrollado enormemente en los últimos años, proporcionando técnicas novedosas para establecer modelos de organoides en un chip que remedian los inconvenientes de las técnicas tradicionales de cultivo celular 2D y establecen un modelo in vitro más realista, de bajo costo y eficiente para estudios fisiológicos y desarrollo de fármacos. Usando dispositivos microfluídicos, se establecen órganos en chips para cultivar células vivas en cámaras de tamaño micrométrico con diferentes estímulos para replicar las funciones clave de un tejido u órgano. El sistema consiste en microcanales microfluídicos únicos o múltiples, con un tipo de célula cultivada en una cámara perfundida que replica funciones de un tipo de tejido o diferentes tipos de células cultivadas en membranas porosas para recrear interfaces entre diferentes tejidos. Los organoides basados en microfluídicos combinados con células derivadas de pacientes tienen la ventaja única de salvar la gran diferencia de especies entre los modelos de enfermedades de ratones y humanos y superar las desventajas del cultivo celular 2D tradicional para la investigación de mecanismos de enfermedades y el descubrimiento de fármacos. Con el rápido desarrollo de la microfluídica en los últimos años, los investigadores se han dado cuenta de la utilidad de los modelos in vitro de órganos en un chip (OOC) que replican parámetros biológicos complejos in vivo 8. Estos organoides microfluídicos simulan entornos biomecánicos in vitro, como la tensión cíclica, el esfuerzo cortante y la presión del líquido, proporcionando un entorno de cultivo celular tridimensional (3D). Hasta la fecha, se han establecido varios modelos OOC para simular estímulos biomecánicos en órganos como el pulmón9, riñón 10, hígado 11, intestino12 y corazón 13, pero estos no se han aplicado ampliamente al estudio de la enfermedad aórtica humana.
En este estudio, presentamos un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana (HASMC-OOC) que puede controlar las fuerzas y ritmos mecánicos biomiméticos aplicados a los HASMC primarios derivados de pacientes con TAAD. El chip consiste en placas gruesas de tres capas de polidimetilsiloxano (PDMS) grabadas con canales y dos membranas PDMS altamente flexibles comercializadas. Los HASMC se cultivan en las membranas PDMS. El canal en el centro del chip se llena con un medio de cultivo para cultivo celular. Los canales superior e inferior del chip están conectados a un sistema de suministro de presión de vacío que puede controlar el ritmo y la frecuencia de la tensión mecánica de tracción de las membranas PDMS. La tensión rítmica experimentada por los HASMC se puede simular en HASMC-OOC, replicando el microambiente biomecánico de tejido u órgano no funcionalmente alcanzable con los sistemas de cultivo 2D convencionales. Con la ventaja de alta resolución, imágenes en tiempo real y microambiente biomecánico, las actividades bioquímicas, genéticas y metabólicas de las células vivas se pueden estudiar para el desarrollo de tejidos, fisiología de órganos, etiología de enfermedades, mecanismos moleculares e identificación de biomarcadores, enfermedades cardiovasculares y enfermedades aórticas. Combinado con células específicas de tejido y del paciente, este sistema se puede utilizar para la detección de drogas, la medicina personalizada y las pruebas de toxicidad. Este modelo HASMC-OOC proporciona una novedosa plataforma in vitro para estudiar la patogénesis de la enfermedad aórtica.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehído al 4%</td><td>Beyotime</td><td>P0099-100ml</td><td>Utilizado para la inmovilización</td></tr> celular <tr><td>Alexa Fluor 350-marcado Cabra Anti-Conejo IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0408</td><td>Anticuerpos utilizados para la inmunotinción</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Beyotime</td><td>ST025-20g</td><td></td></tr><tr><td>Calcio AM/PI</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular&nbsp;</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>CNN1</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>Ab46794</td><td></td></tr><tr><td>Membrana comercial flexible PDMS</td><td>Hangzhou Bald Advanced Materials</td><td>KYQ-200</td><td></td></tr><tr><td>F-actin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>M8318</td><td></td></tr><tr><td>Mangueras</td><td>Runze Fluid</td><td>96410</td> 1 <td>mm de diámetro interior; 3 mm de diámetro exterior; 1 mm de espesor de pared; Dirección del sitio web oficial: https://www.runzefluidsystem.com</td></tr><tr><td>Línea celular de músculo aórtico liso humano CRL1999</td><td>ATCC</td><td>Número de lote:70019189</td><td></td></tr><tr><td>Imagen J</td><td>Imagej.net/fiji/downloads</td><td>Descarga gratuita: https://fiji.sc</td><td>Plataforma de imágenes que se utiliza para identificar la intensidad de fluorescencia</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Garantiza que la temperatura, la humedad y la exposición a la luz se exactamente iguales durante todo el experimento .</td></tr><tr><td>Luer</td><td>Runze Fluid</td><td>RH-M016</td><td>Dirección del sitio web oficial: https://www.runzefluidsystem.com.</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ratón colágeno</td><td>Sigma</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>Plasma de oxígeno&nbsp;</td><td>Changzhou Hongming Instrument</td><td>HM-Plasma5L</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Biologix</td><td>30-0138A1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Beyotime</td><td>C0221A</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Sigma</td><td>P4458-100ml</td><td>Antibióticos utilizados para prevenir la contaminación bacteriana de las células durante el cultivo.</td></tr><tr><td>bomba peristáltica</td><td>Kamoer</td><td>F01A-STP-B046</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri Corning</td><td>430167</td><td></td><td></td></tr><tr><td>controlador PLC</td><td>Zhejiang Jun Teng (BenT) Fábrica CNC</td><td>BR010-11T8X2M</td><td>La configuración detallada del programa se puede encontrar en suplemento. Dirección del sitio web oficial: archivos.http://www.btcnc.net</td></tr><tr><td>polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>SM22</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>ab14106</td><td></td></tr><tr><td>SMCM</td><td>ScienCell</td> Válvula solenoide <td>Cat 1101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SMC (China)</td><td>VQZ300</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>Becton,Dickinson y compañía 300841</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Beyotime</td><td>ST795</td><td>Para penetrar en las membranas celulares</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>10296010</td><td>utilizado para la extracción de ARN</td></tr><tr><td>tripsina</td> Filtro de vacío <td>Sigma</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SMC (China)</td><td>ZFC5-6 Dirección del</td><td>sitio web oficial: Bomba</td>de</tr><tr><td>vacío</td><td>https://www.smc.com.cn Kamoer</td><td>KVP15-KL-S</td><td></td></tr><tr><td>regulador de vacío</td><td>AirTAC</td><td>GVR-200-06</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer Name</td><td>Forward (5' a 3')</td><td>Reversa (5' a 3')</td><td></td></tr><tr><td>SM22</td><td>CCGTGGAGATCCCAACTGG</td><td>CCATCTGAAGGCCAATGACAT</td><td></td></tr><tr><td>CNN1</td><td>CTCCATTGACTCGAACGACTC</td><td>CAGGTCTGCGAAACTTCTTAGA</td><td></td></tr></tbody></table>

construcción de un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana para recapitular la tensión biomecánica en la pared aórtica

Construction of a Human Aorta Smooth Muscle Cell Organ-On-A-Chip Model for Recapitulating Biomechanical Strain in the Aortic Wall

Las técnicas convencionales de cultivo celular bidimensional y los modelos animales se han utilizado en el estudio del aneurisma y la disección de la aorta torácica humana (TAAD). Sin embargo, el TAAD humano a veces no puede ser caracterizado por modelos animales. Existe una aparente brecha de especies entre los estudios clínicos en humanos y los experimentos con animales que pueden dificultar el descubrimiento de medicamentos terapéuticos. Por el contrario, el modelo de cultivo celular convencional es incapaz de simular estímulos biomecánicos in vivo . Con este fin, la microfabricación y las técnicas microfluídicas se han desarrollado enormemente en los últimos años, proporcionando técnicas novedosas para establecer modelos de organoides en un chip que replican el microambiente biomecánico. En este estudio, se desarrolló un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana (HASMC-OOC) para simular los parámetros fisiopatológicos de la biomecánica aórtica, incluida la amplitud y la frecuencia de la tensión cíclica experimentada por las células del músculo liso aórtico humano (HASMC) que desempeñan un papel vital en la TAAD. En este modelo, la morfología de los HASMC se hizo de forma alargada, alineada perpendicularmente a la dirección de la deformación y presentó un fenotipo más contráctil en condiciones de deformación que en condiciones convencionales estáticas. Esto fue consistente con la orientación celular y el fenotipo en las paredes aórticas humanas nativas. Además, utilizando TAAD relacionado con la válvula aórtica bicúspide (BAV-TAAD) y HASMC primario derivado de pacientes con TAAD RELACIONADO CON LA VÁLVULA AÓRTICA TRICÚSPIDE (TAV-TAAD), establecimos modelos de enfermedad BAV-TAAD y TAV-TAAD, que replican las características de HASMC en TAAD. El modelo HASMC-OOC proporciona una novedosa plataforma in vitro que es complementaria a los modelos animales para explorar más a fondo la patogénesis de TAAD y descubrir objetivos terapéuticos.

El modelo HASMC-OOC consiste en un sistema de control de vacío, un sistema de circulación y chips PDMS, y el diseño esquemático del modelo HASMC-OOC (Figura 1). El sistema de control de vacío consiste en una bomba de vacío, válvulas solenoides y un controlador PLC. Para actuar como sistema circulante, se utilizó una bomba peristáltica para refrescar el medio de cultivo celular y agregar medicamentos. El chip PDMS estaba compuesto por dos cámaras de vacío y una cámara central llena de SMCM pa...

Aquí, desarrollamos un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana para replicar la tensión biomecánica in vivo de las células del músculo liso en la pared aórtica humana.

Construcción de un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana para recapitular la tensión biomecánica en la pared aórtica

Conventional two-dimensional cell culture techniques and animal models have been used in the study of human thoracic aortic aneurysm and dissection ...

Este modelo estimula los estímulos biomecánicos experimentados por las células del músculo liso en la aorta humana. Combinado con células derivadas de pacientes, este sistema se puede utilizar para la detección de fármacos y la medicina personalizada de enfermedades aórticas. Este modelo puede imitar y controlar con precisión los parámetros mecánicos desnudos de las células del músculo liso en la aorta humana, lo que proporciona una nueva plataforma in vitro para el estudio y la patogénesis de las enfermedades aórticas.Demostrando el procedimiento estará Mieradilijiang Abudubat, un médico de nuestro laboratorio. Comience lavando la región lateral derecha de la aorta ascendente con PBS estéril, una o dos veces. Retire las capas íntima y adventicia del tejido con dos pinzas oftálmicas y retenga la capa de medios para cosechar las células.Coloque la capa de medios en un plato de 10 centímetros y córtelo en trozos de dos a tres milímetros. Luego, agregue cinco mililitros de SMCM que contengan 10% fbs y 1% de estreptomicina de penicilina a las muestras de tejido. Mueva el tejido pequeño al frasco de cultivo con un gotero estéril, extendiendo el tejido uniformemente.Deseche el medio de cultivo tanto como sea posible. Luego invierta la botella boca abajo. Agregue dos mililitros de SMCM en la botella de cultivo invertida y colóquela en la incubadora con 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados durante una o dos horas.Luego, gírelo lentamente hacia arriba y agregue otros dos mililitros de SMCM. Después de cinco a siete días de incubación, cambie el SMCM con cuatro mililitros de SMCM fresco. Deseche lentamente y agregue el SMCM al cambiar el medio.Generalmente, las células esporádicas del músculo liso salen en aproximadamente dos semanas. Transporte la botella de cultivo suavemente cuando se mueva a una estación de microscopio. De lo contrario, los tejidos flotarán y las células crecerán lentamente.Cuando las células hayan crecido, divídalas en dos nuevas botellas de cultivo con cuatro mililitros de SMCM fresco. Identificar las células a través de un análisis de inmunofluorescencia de cuatro marcadores específicos para las células del músculo liso. Para polimerizar PDMS, agregue el agente de curado o componente B a la base o al componente A y mezcle el complejo durante cinco minutos.El volumen dependerá de la necesidad del estudio. Coloque el gel PDMS preparado en un tanque de extracción al vacío durante 30 a 60 minutos y mantenga la presión por debajo de 0,8 mili pascales negativos. Usando software de diseño asistido por computadora, diseñe el molde.Personalice los moldes de las tres capas utilizando una máquina de grabado de control numérico computarizado de alta precisión. Después de tallar el marco de los moldes y los microcanales con placas de PMMA, péguelos en otra placa. Vierta el gel PDMS preparado en un molde diseñado.Luego entrecruza a 70 grados centígrados durante una o dos horas. Despegue las losas de PDMS reticuladas del molde y corte las membranas PDMS comercializadas en secciones de 100 milímetros por 40 milímetros. Perfore agujeros en las tres losas PDM utilizando un perforador de orificios de un milímetro para hacer la entrada y salida de aire y microcanales medios en el chip PDMS.Tratar las tres losas de PDMS preparadas y dos membranas de PDMS con plasma de oxígeno durante cinco minutos para la activación de la superficie de PDM. Ajuste el aire de la habitación para procesar gas, la presión a 100 kilopascales negativos, la corriente a muelles de 180 a 200 miliamperios, el voltaje a 200 voltios y el tiempo de procesamiento a cinco minutos. Unir tres losas PDMS y dos membranas PDMS bajo un microscopio estereoscópico, de modo que la capa superior consista en la losa PDMS del canal de aire, luego la membrana PDMS.El canal medio consiste en la losa PDMS, luego la membrana PDM, y la capa inferior es la losa PDMS del canal de aire. Coloque el chip PDMS ensamblado en una incubadora de 70 grados centígrados durante una hora. Prepare varias mangueras de látex de un milímetro de diámetro interior y tres centímetros de longitud.Inserte una aguja de acero inoxidable de un milímetro de diámetro exterior y un centímetro de largo en un extremo de la manguera preparada. Luego inserte un señuelo en el otro extremo de la manguera para crear el tubo conectado a los microcanales de aire y medio del chip PDMS. Inserte los tubos preparados en las salidas y entradas de los microcanales de aire y medio en el chip PDMS.Infundir dos mililitros de 80 miligramos por mililitro de colágeno de ratón en el microcanal medio del chip PDM, usando una jeringa de dos mililitros, e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, retire el colágeno del canal con una jeringa de dos mililitros. Coloque los chips PDMS codificados en colágeno en una incubadora de 60 grados centígrados durante la noche.Coloque los chips PDMS en un esterilizador UV durante más de una hora. Coloque los chips PDMS esterilizados en un banco ultra limpio en preparación para el experimento celular. Cultivo cuatro veces 10 a las cinco células primarias del músculo liso aórtico humano de pacientes que usan SMCM que contiene 2% FBS y 1% de estreptomicina de penicilina en una incubadora de dióxido de carbono al 5%, fijada a 37 grados centígrados.Cuando la densidad de células del músculo liso alcance el 80%, deseche el SMCM y lave las células con dos mililitros de PPS. Digerir las células usando un mililitro de 0,25% de tripsina durante dos minutos y centrifugar a 100 RCF durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de SMCM fresco.Use ocho mililitros de SMCM para cultivar las células en una placa de cultivo de 10 centímetros. Usando un citómetro, calcule el número de células y proceda con la concentración final de dos veces 10 a cinco células por mililitro. Vierta lentamente dos mililitros de PBS en el microcanal medio del chip PDMS codificado y esterilizado y luego deseche con una jeringa de dos mililitros.Vierta lentamente dos mililitros de dos veces 10 a las cinco células por mililitros de suspensión de células musculares lisas en el microcanal de medios del chip PDMS. Luego, cierre el señuelo en la entrada y salida del chip PDMS. Coloque el chip PDMS en una incubadora, fijada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante un día.Después de la incubación, cuando las células están unidas a la membrana PDMS en el chip PDMS, conecte la salida del microcanal de aire en el chip PDMS al sistema controlador de vacío. Una forma celular normal alargada se verá bajo el microscopio cuando la célula esté unida. Contrastando con las celdas redondas suspendidas.Encienda la válvula solenoide y la bomba de vacío. Abra el regulador de vacío y ajuste el nivel de presión en función de las deformación. Luego, coloque los chips PDMS y una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 24 horas.Prepare varias válvulas solenoides, filtros de vacío, reguladores de vacío, una bomba de vacío, una bomba peristáltica y un PLC que controle la válvula solenoide. Programe el controlador PLC y establezca el intervalo de tiempo de encendido en un hercio. Conecte las válvulas solenoides al controlador programado.Conecte la entrada de la bomba de vacío a los filtros de vacío y, a continuación, conecte la salida de los filtros de vacío a los reguladores de vacío. Conecte la salida de los reguladores de vacío a las válvulas solenoides. Y finalmente, conecte la salida de las válvulas solenoides a las salidas de los microcanales de aire de los chips PDMS.Conecte la salida de la bomba peristáltica a la entrada del microcanal medio del chip PDMS y la entrada de la bomba peristáltica a la salida del chip PDMS de microcanal medio para el reemplazo del medio de cultivo y el manejo de fármacos. Ajuste la amplitud de la deformación por el regulador y la frecuencia de deformación por el microcontrolador. La viabilidad de la línea celular del músculo liso aórtico humano, CRL 1990, en el chip PDMS, se estimó utilizando un ensayo vivo y muerto en el tercer y quinto día de cultivo celular.La viabilidad celular se encontró superior al 90% en el día tres y el día cinco. La tinción de actina F del citoesqueleto de CRL 1990, en el chip PDMS, mostró morfología celular normal y células alineadas perpendicularmente a la cepa después de estirar durante 24 horas. La inmunofluorescencia de los marcadores contráctiles SM22 y CNN1, fue mayor en condiciones de tensión en comparación con las condiciones estáticas.Además, los genes SM22 y CNN1 fueron regulados al alza en condiciones de tensión de las células musculares lisas. La tinción de actina F de BAV y TAV, el aneurisma de la aorta torácica y la disección de células primarias del músculo liso aórtico humano derivado del paciente, mostraron una morfología celular normal y células alineadas perpendicularmente a la dirección de la tensión después de estirar durante 24 horas. La fluorescencia SM22 y CNN1 en el aneurisma aórtico torácico BAVTAAD y TAV y la disección fueron mayores en condiciones de tensión que en condiciones estáticas.Similar a los niveles de expresión génica de SM22 y CNN1, que también se regularon al alza en condiciones de tensión en comparación con las condiciones estáticas. Se debe prestar atención al principio de esterilidad al aislar el HASMC primario. Después de que los laboratorios PDMS y las membranas se tratan con plasma, las superficies no deben ensuciarse.Sobre la base de este protocolo, las células endoteliales se pueden cocultivar con células musculares lisas y el estrés puro se puede dar a las células con tensión cíclica para simular aún más fuerzas mecánicas.

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Investigación

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Bioengineering

Bioingeniería

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Construcción de un modelo de órgano en un chip de células musculares lisas de la aorta humana para recapitular la tensión biomecánica en la pared aórtica

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