Name: Obtención de imágenes de células B CD19+ en un modelo experimental de ratón con encefalomielitis autoinmune mediante tomografía por emisión de positrones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Aprende a cuantificar células B CD19+ en el sistema nervioso central mediante PET en un modelo de encefalomielitis autoinmune experimental en ratón. Esta técnica permite visualizar la dinámica de subpoblaciones de células B in vivo con alta precisión.

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Estamos agradecidos por el apoyo de la instalación de imágenes de animales pequeños SCi3 en Stanford y al Dr. Frezghi Habte por su asistencia técnica con la PET/CT. La LC-MS es realizada por el personal central de la instalación central de Espectrometría de Masas de la Universidad de Stanford (SUMS) y agradecemos al personal por brindar este servicio. Agradecemos a Horizon Therapeutics por proporcionar muy amablemente el hCD19-mAb y a Jodi Karnell en particular por su orientación y apoyo técnico. Este trabajo fue financiado por el NIH NINDS (1 R01 NS114220-01A1).

<ol><li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+with+Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).</li>
<li>Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inebilizumab%2C+a+B+cell-depleting+anti-CD19+antibody+for+the+treatment+of+autoimmune+neurological+diseases%3A+Insights+from+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107(2016).</li>
<li>Stevens, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+CD19+PET+tracer+for+detecting+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275(2020).</li>
<li>Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+neuroinflammation+using+%5B11C%5DDPA-713+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57243(2018).</li>
<li>Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+antigen-specific+antibody+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+recombinant+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).</li>
<li>Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+follicle-like+structures+in+multiple+sclerosis-With+focus+on+the+role+of+B+cell+activating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor.</a> Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).</li>
<li>James, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis+using+64Cu-Rituximab+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li>
<li>Lyons, J. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+are+critical+to+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+protein+but+not+by+a+short+encephalitogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide.</a> European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).</li>
</ol>

El anticuerpo CD19 fue proporcionado por Horizon Therapeutics.

En este artículo se describe un método simplificado para obtener imágenes de células B CD19+ humanas en un modelo de ratón de EM utilizando CD19-PET. Debido a la presentación heterogénea de la EM y a las diferentes respuestas a los tratamientos, su manejo en la clínica puede ser un reto y se necesitan nuevos enfoques para la selección y el seguimiento de la terapia. Las imágenes PET podrían servir como una herramienta poderosa para monitorear la progresión de la enfermedad y la respuesta individual a la terapia de agotamiento de células B. Además de la esclerosis múltiple, las imágenes por TEP-CD19 podrían utilizarse para controlar la depleción de células B después del tratamiento en subtipos de linfomas y leucemia u otras enfermedades mediadas por células B. Este protocolo y datos representativos muestran la utilidad de la obtención de imágenes de células B en enfermedades neurológicas.
Para estudiar los linfocitos B CD19+ humanos en el contexto de la EM, elegimosel modelo 7 de EAE MOG1-125 dependiente de linfocitos B. Al igual que otros modelos EAE, este modelo presenta síntomas de parálisis progresiva e infiltración de células inmunitarias en el SNC. Sin embargo, el modelo MOG1-125 es único en el sentido de que es un modelo impulsado por células B: los ratones contienen un número variable de células B en el espacio subaracnoideo de las meninges, el tronco encefálico, el parénquima y los ventrículos. Estos linfocitos pueden estar escasamente dispersos a lo largo de estas regiones y/o formar estructuras similares a folículos, que también se observan en humanos con EM 8,9. Además de utilizar ratones ingenuos como controles, se puede utilizar un kit completo de inducción solo con adyuvante de Freund (CFA) (es decir, una emulsión de inducción idéntica a la que se administra a los ratones EAE sin la proteína MOG). En el modelo de ratón EAE, la barrera hematoencefálica (BHE) es disfuncional y permite que entidades más grandes, como los anticuerpos, se crucen. La radiosonda CD19-mAb solo se unirá y permanecerá en el SNC si hay células B presentes; el marcador circulará de nuevo hacia el depósito de sangre si las células B no están presentes. Lo hemos demostrado mediante el recuento gamma y la autorradiografía ex vivo de los tejidos del SNC mediante perfusión antes de medir los niveles de radiactividad en los tejidos. También hemos demostrado esto en publicaciones anteriores que informan sobre el uso de radiotrazadores PET basados en mAb (es decir, enfoques de imagen inmunoPET) para detectar células B en el SNC 1,2.
El quelante DOTA se utilizó ya que se ha utilizado en imágenes PET clínicas con péptidos y anticuerpos marcados con cobre-64, y nuestro objetivo es traducir el hCD19-mAb para la imagen clínica de pacientes con EM. DOTA tiene una afinidad de unión adecuada al cobre-64 in vivo. La estabilidad in vivo es muy importante porque el 64Cu libre va al hígado y puede oscurecer la señal de la radiosonda unida; Por lo tanto, es importante medir la señal en el hígado para calcular la señal relativa en comparación con otros órganos. Por lo general, el músculo se toma como tejido de control, pero en el caso de EAE, puede haber inflamación presente en los músculos. La vida media de 64Cu es de 12,7 h, lo que proporciona tiempo suficiente para que el DOTA-hCD19-mAb se una a su objetivo, al tiempo que garantiza que la señal pueda medirse mediante PET. Al preparar el conjugado, se deben realizar reacciones de prueba a pequeña escala (75-125 μg) para determinar la cantidad de DOTA que se debe agregar al AcM para producir la relación DOTA/AcM deseada (p. ej., una reacción de 6-10 veces el exceso de éster de DOTA-NHS por mol de AcM puede proporcionar un conjugado de 1-2 DOTA/AcM). El tiempo de reacción y la temperatura (por ejemplo, 2-4 h o toda la noche a 4 °C o temperatura ambiente) también influyen en la relación DOTA/mAb y deben optimizarse. Se puede realizar una valoración con cobre no radiactivo para calcular el número de DOTAs por mAb; sin embargo, recomendamos realizar MALDI-MS y/o LC-MS para obtener resultados más fiables y precisos.
La relación DOTA/mAb calculada es un valor promedio para una muestra en particular y se espera cierta variación. En el caso de MALDI, se toman varias inyecciones por muestra para los anticuerpos monoclonales conjugados y no conjugados. A continuación, calculamos la relación entre conjugados y no conjugados para determinar el número medio de DOTA/mAb. La relación DOTA/mAb es importante porque demasiados quelantes interrumpirán la unión de anticuerpos y muy pocos darán lugar a un radiomarcaje inconsistente y a una señal baja. La relación debe ser muy estrecha entre los lotes de conjugados para mantener una intensidad de señal y una cinética de unión constantes; Idealmente, se debe usar el mismo lote de conjugado para todos los experimentos dentro de un estudio en particular. Una técnica prometedora para reducir los posibles efectos sobre la inmunorreactividad debido a una posible sobreconjugación es el uso de la conjugación específica del sitio10 , en la que la conjugación del quelante es selectiva del sitio en los glicanos de cadena pesada del anticuerpo, garantizando así la adición de 1 quelante por mAb.
Las condiciones de la reacción de radiomarcaje deben optimizarse para garantizar la máxima eficiencia y rendimiento de marcado, ya que las diferencias en los anticuerpos, la relación DOTA/mAb y la actividad molar de 64Cu, entre otras condiciones, afectarán al radiomarcado. El uso de la relación óptima de conjugado de 64Cu a mAb puede permitir que el radiotrazador se utilice sin purificación, lo que reduce el tiempo necesario para el radiomarcaje y la pérdida debida a la columna de flujo por gravedad y la desintegración radiactiva. También se puede lograr una actividad molar consistente y confiable cuando se utiliza la misma proporción conjugada de 64Cu a mAb, lo cual es especialmente importante cuando se comparan los resultados en múltiples cohortes de ratones o estudios de imagen. Las condiciones de ITLC también pueden ser modificadas para adaptarse a cada usuario. Si es necesaria la purificación, se debe guardar una alícuota para la espectrofotometría por HPLC y/o UV/Vis, de modo que se pueda calcular la actividad molar.
Es importante tener en cuenta que el uso de anticuerpos radiomarcados para la obtención de imágenes puede ser un desafío. Es esencial que el anticuerpo utilizado para la radiosonda sea biológicamente inerte para no tener un efecto fisiológico. Además, dado que los anticuerpos tienen una larga residencia en la sangre, se debe esperar el tiempo suficiente para la circulación, la unión y la eliminación de un mAb determinado para garantizar una señal de fondo adecuada sin comprometer la calidad de la imagen. Por lo general, es suficiente esperar de 20 a 48 h para un mAb marcado con 64 Cu, pero se deben obtener imágenes a las 2, 4, 6, 12, 24, 48 h después de la inyección cuando se evalúa un nuevo trazador PET de mAb para determinar el mejor momento para obtener imágenes en un modelo de roedor determinado. Lo mismo ocurre con la adquisición de imágenes ARG con la mayor relación señal-fondo. Las imágenes representativas de este protocolo se tomaron a las 18-20 h después de la inyección, aunque se pueden utilizar otros puntos de tiempo dependiendo del radioisótopo utilizado. Diferentes anticuerpos que se unen a diferentes epítopos de CD19 producirán resultados variables y deben caracterizarse rigurosamente.
Al analizar la señal de la médula espinal, es importante colocar a los ratones boca arriba en la cama de exploración para reducir el movimiento causado por la respiración. Además, la colocación en decúbito supino puede ayudar a enderezar la columna vertebral en ratones que tienen una mayor curvatura de la columna vertebral debido a la progresión de la enfermedad EAE. Otro aspecto importante a tener en cuenta cuando se trata de detectar señales en la columna vertebral y la médula espinal es evitar inyectar MOG1-125 en el flanco, ya que los sitios de inyección pueden unirse al trazador debido a la respuesta inmunitaria asociada en esas áreas. La proximidad del lugar de la inyección puede interferir con el análisis de la médula espinal; Por lo tanto, las inyecciones en el pecho son preferibles para la aplicación descrita en este documento.
Las técnicas de análisis de imágenes utilizadas son específicas para la obtención de imágenes del SNC. Una herramienta de atlas cerebral dentro del software de análisis de imágenes proporciona resultados reproducibles y fiables siempre que el registro de PET y CT sea preciso. El uso del atlas cerebral 3D semiautomatizado y su ajuste para que se ajuste al cráneo de cada ratón permite obtener un retorno de la inversión consistente entre los animales. Dado que actualmente no existe un enfoque automatizado o semiautomatizado para analizar la señal en la médula espinal, se deben trazar ROI manuales. En particular, al cuantificar las células B CD19+ (o cualquier tipo de célula presente tanto en la médula ósea como en la médula espinal), es fundamental eliminar la señal que surge de la columna vertebral y la médula ósea tanto como sea posible. La razón de esto es que se sabe que los ratones naïve contienen más células B CD19+ en su médula ósea que los ratones EAE, en los que las células B abandonan la periferia para infiltrarse en el SNC 5,11. Esta señal de la médula ósea puede oscurecer la verdadera señal en la médula espinal.
Para delinear la verdadera señal de la médula espinal y minimizar la contribución de la señal de la columna vertebral y la médula ósea, se puede utilizar el umbral Otsu de la imagen de TC para hacer un ROI inmutable para la columna vertebral. A continuación, se puede dibujar fácilmente una ROI separada de la médula espinal dentro de la columna vertebral. La misma técnica también se puede aplicar para medir la médula ósea en el fémur. Este es un método muy útil para obtener información sobre la unión de los trazadores en la médula espinal. Sin embargo, debido a la resolución espacial relativamente baja de la PET y a los problemas relacionados con el efecto de volumen parcial al explorar pequeñas regiones anatómicas de ratones, el uso de técnicas adicionales de confirmación ex vivo (p. ej., recuento gamma, ARG) permite la validación de la unión de radiotrazadores en la médula espinal sin la presencia de sangre, líquido cefalorraquídeo o señal de derrame de la columna vertebral.
La señal en la médula espinal cervical/torácica tiende a variar en los ratones EAE dependiendo de la gravedad de la enfermedad y de la cantidad de células B que se infiltran durante la respuesta inmunitaria adaptativa. Esta variación en el número de linfocitos B que se infiltran, así como la pequeña cantidad de linfocitos B en el SNC en comparación con los de la médula ósea pélvica/espinal de ratones naïve, puede hacer que la cuantificación in vivo del tejido de la médula espinal sea un desafío en ratones. Dada la resolución espacial de la PET en imágenes de animales pequeños, la señal de la médula ósea puede extenderse a la señal de la médula espinal. La biodistribución ex vivo y la autorradiografía completadas aquí ayudan a validar la señal PET de las vértebras frente al tejido de la médula espinal. Los ratones se perfunden antes de la disección para eliminar cualquier marcador no unido en el depósito de sangre, de modo que los resultados del recuento gamma y la autorradiografía reflejen el marcador que realmente está unido en cada órgano en lugar del marcador que está en el depósito de sangre en ese órgano.
Las radiosondas circulan a través de la sangre, y con los trazadores de anticuerpos, específicamente, a menudo hay radiosondas no unidas presentes en la sangre durante semanas después de la inyección inicial. Dado que estamos tomando imágenes del cerebro y la médula espinal, que tienen muchos vasos sanguíneos, es importante comprender qué parte de la señal se debe realmente a la unión del marcador en el cerebro/tejido de interés en comparación con la presente en la reserva de sangre. Por lo tanto, es necesario dividir la señal cerebral por señal en el corazón/piscina de sangre. En el ámbito clínico, se pueden utilizar las mismas técnicas de análisis de imágenes de umbral de Otsu de vértebras y ROI de tejidos de la médula espinal para la cuantificación. Dados los mayores volúmenes de tejido en humanos en comparación con los ratones, debería haber un impacto significativamente menor de los efectos de volumen parcial, lo que llevaría a una mayor precisión y anularía la necesidad de técnicas ex vivo para confirmar los hallazgos in vivo . El uso de PET en la clínica permitirá a los médicos personalizar la terapia para cada paciente en función de su carga individual de células B.
El ARG es particularmente útil para adquirir imágenes de alta resolución que permitan una delineación más precisa de la ubicación espacial de la unión de trazadores en regiones pequeñas como el tronco encefálico y el cerebelo. Las mismas secciones y/o secciones adyacentes se pueden guardar para tinciones inmunohistoquímicas para confirmar la presencia de células B. Previamente hemos teñido tejidos del SNC con CD45R/B220 (Figura suplementaria S1) para correlacionar el número de linfocitos B con la señal PET y ARG 5,9. A continuación, la tinción se puede comparar espacialmente con los resultados del ARG para verificar que la señal del radiotrazador coincide con el patrón de tinción. Las células B pueden estar presentes en grupos o de forma difusa en todo el tronco encefálico; La sensibilidad de la PET es lo suficientemente alta como para medir la señal, lo que es alentador para la traslación clínica. En el caso de la ARG de la médula espinal, la extracción de la médula espinal de las vértebras garantiza que la señal medida se deba a la unión del marcador en el tejido de la médula espinal en lugar de en la médula ósea y/o la sangre, lo que puede oscurecer las imágenes de la PET debido a los efectos parciales del volumen.
Al igual que el ARG, el recuento gamma ex vivo permite la cuantificación de la señal radiactiva en órganos individuales. Para esta técnica en particular, es importante medir el peso húmedo de los tejidos y asegurarse de que estén en el fondo de sus respectivos tubos antes de colocar los tubos en el contador gamma. Los tubos deben estar etiquetados con el número de ratón y el tejido, de modo que se utilice el tubo correcto; A continuación, el tubo se pesa en una balanza calibrada y se insertan los órganos con una precisión de una décima parte de microgramo (0,0001 mg). Algunos tejidos son extremadamente pequeños y la diferencia en la masa del tubo antes y después será del orden de 0,0001 mg. Los tejidos deben pesarse inmediatamente después de la disección para evitar la pérdida de humedad, lo que resulta en una masa más baja. Después del pesaje, los tubos del cerebro y la médula espinal deben llenarse con PBS para evitar que se sequen antes de congelar estos tejidos para la ARG.

La esclerosis múltiple es un trastorno neurológico mediado por el sistema inmunitario; La presentación única de cada paciente puede dificultar el manejo tanto para los pacientes como para los médicos1. La enfermedad en sí se caracteriza por la presencia de lesiones desmielinizantes e infiltración de células inmunitarias en el cerebro y la médula espinal, lo que resulta en deterioro físico y cognitivo2. El paradigma tradicional de que la EM es una enfermedad mediada por células T se cuestionó por primera vez en un ensayo clínico de fase II de rituximab3, una terapia dirigida al subconjunto CD20+ de células B. Desde entonces, se han desarrollado terapias adicionales de células B que se dirigen a CD194, un biomarcador de células B panorámico que se expresa en una gama más amplia de células B, lo que puede ser ventajoso tanto desde el punto de vista diagnóstico como terapéutico. Además, los métodos existentes para evaluar la eficacia del tratamiento (es decir, la monitorización del número de recaídas y de la actividad de las imágenes por resonancia magnética [IRM]) no permiten medir la respuesta de forma temprana, lo que pone a los pacientes en un riesgo significativo de daño en el SNC debido a la selección y optimización de la terapia subóptima. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de estrategias para monitorear células inmunitarias específicas, como las células B CD19+ , en tiempo real en el SNC y la periferia de los pacientes con EM.
La PET es una técnica de imagen robusta que permite la visualización in vivo de todo el cuerpo de un objetivo de interés determinado, como el CD19. Mientras que las extracciones de sangre, los registros de las tasas de recaída y el seguimiento de las lesiones a través de la resonancia magnética proporcionan instantáneas de la eficacia del tratamiento, las imágenes PET pueden permitir a los investigadores y médicos controlar la eficacia de una terapia en todo el cuerpo. Este enfoque proactivo de la monitorización terapéutica permite a los médicos evaluar la eficacia de la medicación en tiempo real, lo que permite realizar ajustes rápidos según sea necesario. El monitoreo de la ubicación y la densidad de las poblaciones celulares asociadas con la enfermedad también permite una evaluación longitudinal de la gravedad utilizando información anatómica específica del paciente. Por lo tanto, es esencial establecer métodos analíticos reproducibles para utilizar de forma fiable todo el potencial de las imágenes PET en entornos clínicos y preclínicos.
En este artículo se describen los métodos (Figura 1) para realizar imágenes PET, recuento gamma ex vivo y autorradiografía (ARG) de células B CD19+ con un anticuerpo monoclonal (mAb) CD19 humano marcado con 64 Cu, conocido como 16C4-TM (64Cu-hCD19-mAb), en el modelo experimental de ratón de encefalomielitis autoinmune (EAE) de EM inducida en ratones transgénicos que expresan CD19 humano (hCD19) utilizando glicoproteína 1-125 de oligodendrocitos de mielina recombinante humana (MOG1-125). También proporcionamos métodos para evaluar la unión de radiotrazadores de forma precisa y reproducible en el cerebro y la médula espinal, ambos sitios críticos de patogénesis a menudo gravemente afectados en este y otros modelos neurodegenerativos. Estas técnicas permiten la investigación no invasiva del papel de las células B en la patología de la enfermedad y tienen el potencial de traducirse clínicamente para evaluar la eficacia de las terapias anti-células B en la EM.

<table><tbody><tr><td>0.5 mL 50 kDa MWCO Filtro centrífugo</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC505008</td><td>filtro centrífugo</td></tr><tr><td>64Cu-CuCl3</td><td>Washington University en St. Louis; Universidad de Wisonsin, Madison; u otro proveedor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner</td><td>Eckert & Casete</td> de autorradiografía <td>Ziegler AR-2000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td> Aluminio, película de autorradiografía de <td>8" x 10"</td></tr>&<tr><td></td><td>nbsp; GE Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td>Pantalla de fósforo de almacenamiento BAS-IP SR 2025 E Super Resolución, 20 x 25 cm, solo pantalla</td></tr><tr><td>Catéter de aguja de mariposa</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>BLF-24</td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS-ester</td><td>Macrocíclicos</td><td>B-280</td><td></td></tr><tr><td>EAE Kit de inducción</td><td>Hooke Laboratories</td><td>EK-2160</td><td></td></tr><tr><td>Contador Geiger</td><td>Ludlum</td><td>14C</td><td></td></tr><tr><td>Escáner GNEXT PET/CT</td><td>Sofie</td><td>GNEXT</td><td></td></tr><tr><td>Hidex Contador Gamma Automático</td><td>Hidex</td><td>AMG</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Columna</td><td>Phenomenex</td><td>&nbsp; 00H-2146-K0</td><td>5 &mu; m SEC-s3000 400 &Aring;, 300 x 7,8 mm</td></tr><tr><td>Columna Illustra NAP-5 Columna de</td> gravedad <td>Cytiva</td><td>17085301</td><td>DNA</td></tr><tr><td>Imagen J</td><td>Software de análisis NIH</td><td></td><td></td> ARG</tr><tr><td>Tubos de recolección de baja unión a proteínas (1,5 mL)</td><td>Espectrofotómetro Thermo Scientific</td><td>PI90410</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite</td> Micro<td>/nanofotómetro Thermo Scientific 840281400 UV-Vis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR de 0,2 mL, para grado de ADN</td><td>Eppendorf</td><td>30124707</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon generador de imágenes de fósforo 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td>versión 4 parche 3</td><td>software de análisis PET; debe comprar el complemento Brain Atlas</td></tr><tr><td>Columnas de desalinización Zeba Spin, 7K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89882</td><td>Columna de desalinización</td></tr></tbody></table>

obtención de imágenes de células b cd19+ en un modelo experimental de ratón con encefalomielitis autoinmune mediante tomografía por emisión de positrones

Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography

La esclerosis múltiple (EM) es la enfermedad desmielinizante más común del sistema nervioso central (SNC) que afecta a los adultos jóvenes, lo que a menudo resulta en déficits neurológicos y discapacidad a medida que avanza la enfermedad. Los linfocitos B desempeñan un papel complejo y crítico en la patología de la EM y son el objetivo de varias terapias en ensayos clínicos. En la actualidad, no hay forma de seleccionar con precisión a los pacientes para terapias específicas con células B o de cuantificar de forma no invasiva los efectos de estos tratamientos sobre la carga de células B en el SNC y los órganos periféricos. La tomografía por emisión de positrones (PET) tiene un enorme potencial para proporcionar información cuantitativa altamente específica sobre la distribución espacio-temporal in vivo y la carga de las células B en sujetos vivos.
Este artículo informa de los métodos para sintetizar y emplear un trazador PET específico para las células B CD19+ humanas en un modelo de ratón de EM bien establecido impulsado por células B, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), que se induce con la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina recombinante humana 1-125. Aquí se describen técnicas optimizadas para detectar y cuantificar las células B CD19+ en el cerebro y la médula espinal mediante imágenes PET in vivo . Además, este artículo informa de métodos simplificados para el recuento gamma ex vivo de órganos relevantes para la enfermedad, como la médula ósea, la médula espinal y el bazo, junto con la autorradiografía de alta resolución de la unión del marcador CD19 en los tejidos del SNC.

El hCD19-mAb fue conjugado con DOTA y radiomarcado con 64Cu como se muestra en la Figura 2. Los ratones EAE y los ratones naïve se sometieron a la exploración PET/TC (Figura 3) 18-24 h después de la inyección con 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. Las imágenes PET/CT se registraron conjuntamente utilizando el software de análisis PET, y los tejidos del SNC se analizaron utilizando ROI manuales o un atlas cerebral 3D semiautomatizado. La unión de radiotrazadores en ROIs (Figura 4) fue mayor en ratones EAE que en ratones naïve. El recuento gamma ex vivo y el ARG mostraron un aumento de la unión en la médula espinal (segmentos torácicos lumbares y cervicales) y en el cerebro (solo ARG) de los ratones EAE en comparación con los naïve (Figura 5 y Figura 6). El recuento gamma ex vivo de ratones perfundidos también mostró una disminución de la unión de radiotrazadores en órganos periféricos, incluidos el bazo, el fémur y la médula ósea (Figura 5), lo que es consistente con que las células B abandonan la periferia e infiltran el SNC en este modelo EAE.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig02.jpg"> Figura 2: Esquema de conjugación y radiomarcaje para generar 64 anticuerpos monoclonales CD19 específicos para humanos marcados con Cu, 16C4-TM mAb (64Cu-DOTA-hCD19-mAb), además de datos de control de calidad. (A) Reacción del éster DOTA-NHS con el anticuerpo monoclonal hCD19 para producir el conjugado hCD19-DOTA (no a escala) y el radiomarcaje con 64 Cu-CuCl3 para producir 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. (B) Cromatógrafo ITLC representativo. El pico a los 40-60 cm es el anticuerpo radiomarcado; El 64Cu-CuCl3 sin consolidar se desplaza con la fase móvil y estaría presente de 200 a 240 cm. No hay 64Cu-CuCl3 libre detectable en este cromatógrafo. (C) Las especificaciones de control de calidad del anticuerpo radiomarcado. Abreviaturas: éster DOTA-NHS = éster mono-N-hidroxisuccinimida del ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético; ITLC/HPLC = cromatografía instantánea en capa fina/cromatografía líquida de alta resolución; MALDI/LC-MS = desorción/ionización/cromatografía líquida-espectrometría de masas por láser asistida por matriz; CPM = recuentos por minuto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig03.jpg"> Figura 3: Fotografías que demuestran cómo asegurar ratones en una cama impresa en 3D dentro del escáner PET para permitir imágenes de alta calidad de la médula espinal y el cerebro mientras se minimiza el movimiento. (A) Cama de escáner de cuatro ratones impresa en 3D (también conocida como "hotel de ratones") equipada con elementos calefactores y tubos de anestesia. (B) Ratones anestesiados en posición supina para maximizar la rectitud de la columna vertebral; Se registra la posición de la cama de cada ratón. (C) Ratones pegados con cinta adhesiva a través de la cabeza para minimizar el movimiento en el cerebro y a través del vientre para minimizar el movimiento de la respiración, sin afectar la respiración. (D) Cama de ratón colocada dentro del escáner y pegada con cinta adhesiva a la base de escaneo. Los tubos de anestesia se conectaron del escáner a la cama y el isoflurano se ajustó al 2%. Se monitorizó la respiración de los ratones para garantizar un nivel adecuado de isoflurano antes de cerrar la puerta del escáner. Abreviatura: PET = Tomografía por emisión de positrones. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig04.jpg"> Figura 4: Imagen de la médula espinal y análisis cerebral y resultados utilizando el software de análisis PET . (A) i) ROI (rosa y bronceado ) dibujados en la columna vertebral para separar las vértebras lumbares de las torácicas y cervicales y preparar la imagen para el umbral de Otsu. ii ) Las vértebras de la columna vertebral (turquesa y rojo) se segmentaron mediante el umbral de Otsu. iii ) Las vértebras se hicieron inmutables en el menú 3D ROI, y la médula espinal se dividió en ROI cervical/torácica (púrpura) y lumbar (azul marino). iv) Se eliminó la ROI vertebral, quedando aplicadas las ROI de la médula espinal y el atlas cerebral representativo. (B) Análisis representativo de los resultados de la PET de varias regiones del SNC representadas como %ID/g normalizado al ROI del corazón dentro de cada animal. La adquisición de PET fue una exploración estática de 10 minutos a través de imágenes PET/CT. Regiones cerebrales cuantificadas utilizando un enfoque de atlas cerebral semiautomatizado, que se muestra en el panel A. iv) Los resultados representativos muestran una significación o una tendencia hacia un aumento significativo en la unión de trazadores en el cerebro y la médula espinal torácica. Estadística realizada mediante la prueba t de Student (*: p &lt; 0,0332). Abreviaturas: PET = Tomografía por emisión de positrones; ROI = regiones de interés; SNC = sistema nervioso central; TC = tomografía computarizada; %ID/g = porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido; EAE = encefalomielitis autoinmune experimental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig05.jpg"> Figura 5: Cuantificación representativa del recuento gamma ex vivo en varios órganos en ratones EAE y naïve expresado como %ID/g. Después de la tomografía por emisión de positrones, los ratones se perfundieron con PBS para eliminar la radiosonda presente en la sangre, ya sea libre o unida a las células B CD19+ residentes en la sangre, y los órganos se diseccionaron y pesaron rápidamente para tener un peso exacto de cada órgano. La unión al trazador está significativamente disminuida en el bazo y la médula ósea en los ratones EAE en comparación con los naïve. Se observa un aumento de la unión de radiotrazadores tanto en los segmentos lumbares como en los cervicales/torácicos de la médula espinal de los ratones EAE. El cerebro no muestra un aumento significativo en la señal de la radiosonda, aunque tiende a un aumento significativo. Estadística realizada mediante la prueba t de Student (*: p &lt; 0,0332; ****: p &lt; 0,0001). Abreviaturas: PET = Tomografía por emisión de positrones; %ID/g = porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido; EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; PBS = solución salina tamponada con fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig06.jpg"> Figura 6: Las imágenes de ARG ex vivo muestran la unión de 64Cu-DOTA-hCD19-mAb en secciones cerebrales sagitales y médula espinal completa de EAE en comparación con ratones naïve. Las películas digitales de almacenamiento de fósforo se escanearon con un generador de imágenes de fósforo después de haber sido expuestas a muestras de tejido radiactivo durante aproximadamente 10 vidas medias (127 h o 5 días). Las imágenes resultantes revelan una señal visualmente mayor en el cerebro de los ratones EAE en comparación con las secciones cerebrales de los ratones naïve, lo que es esperable debido a las regiones que se sabe que contienen células B en este modelo5. En concreto, hay un aumento de la señal trazadora en el tronco encefálico, el cerebelo y los ventrículos de las secciones cerebrales de ratón EAE. Este aumento en la señal para las secciones cerebrales de ratón EAE refleja lo que se encontró en la cuantificación PET de todo el cerebro detallada anteriormente. Del mismo modo, hay un aumento en la unión de radiotrazadores en los segmentos de la médula espinal cervical/torácica y lumbar en comparación con la médula espinal ingenua, lo que refleja lo que se encontró utilizando el recuento gamma ex vivo . Abreviaturas: PET = Tomografía por emisión de positrones; EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; Cloaca = ventrículos; Cb = cerebelo; BS = tronco encefálico; TSc = médula espinal torácica y cervical combinadas; LSc = médula espinal lumbar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura suplementaria S1: Tinción de tejidos del SNC de tejido cerebral de ratón naïve y EAE con CD45R/B220. Las células B se observan en el tronco encefálico, las meninges y la sustancia blanca de ratones EAE (n = 7 EAE, n = 5 ratones ingenuos, con un promedio de cuatro cortes por animal). Esta cifra es de 5. Barras de escala = 5 mm (aumento bajo [1x]) en imágenes cerebrales sagitales, 100 μm (aumento alto [20x]) en tronco encefálico, meninges y sustancia blanca cerebelosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/Suppl%20Fig%201.pdf" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

En este artículo se detalla la metodología para el radiomarcaje de un anticuerpo monoclonal anti-CD19 específico para humanos y cómo utilizarlo para cuantificar las células B en el sistema nervioso central y los tejidos periféricos de un modelo murino de esclerosis múltiple mediante imágenes PET in vivo, recuento gamma ex vivo y enfoques de autorradiografía.

Obtención de imágenes de células B CD19+ en un modelo experimental de ratón con encefalomielitis autoinmune mediante tomografía por emisión de positrones

Multiple sclerosis (MS) is the most common demyelinating central nervous system (CNS) disease affecting young adults, often resulting in neurological ...

Esta técnica utiliza imágenes PET para dilucidar la distribución in vivo y la dinámica de las células B en el sistema nervioso central. Nuestro enfoque es beneficioso para el estudio de enfermedades neurológicas, donde la médula espinal afectada hace que el análisis sea más difícil. Así que hay un par de ventajas principales en nuestra técnica.En primer lugar, hemos creado una nueva herramienta para rastrear un biomarcador de células B que nos permite capturar una serie de subconjuntos de células B y visualizarlos in vivo. En segundo lugar, nuestro método de análisis de la médula espinal permite una cuantificación altamente precisa y reproducible de las señales PET en esta región. Lo mejor de nuestra técnica es que es independiente de la enfermedad.Se puede utilizar desde imágenes PET preclínicas hasta clínicas en cualquier escenario, donde las células B y/o la médula espinal sean de interés. De 18 a 24 horas después del radiomarcaje e inyección del anticuerpo en el ratón, prepare el ratón para la exploración aplicando gel ocular en los ojos. Asegúrese de que la cama de escaneo de cuatro ratones esté equipada con una almohadilla térmica con isoflurano configurada de 1,5 a 2 % Coloque el ratón en posición supina sobre la cama de escaneo y tire suavemente de la cola del ratón para enderezar la columna vertebral.Una vez que el ratón esté en posición supina, péguelo firmemente con cinta adhesiva suave para microscopio sobre la cabeza y el vientre para minimizar el movimiento de la respiración. Registre la posición de escaneo de cada ratón en un cuaderno de laboratorio. Después de asegurar el primer grupo, cierre la cama y verifique la ubicación de la cama realizando una tomografía computarizada.Haga clic en el campo de visión central de la tomografía computarizada y, una vez que la cama esté en posición, ejecute la exploración de prueba de tomografía computarizada para asegurarse de que la ubicación sea correcta. Repita hasta que la posición de la cama sea satisfactoria. Coloque una pequeña cinta blanca en la base del escáner para marcar la ubicación correcta de la cama durante el resto del estudio.Abra el menú Controlador de movimiento y haga clic en el campo de visión central de PET para mover los ratones al anillo de PET. Una vez que la cama esté en el anillo PET, inicie la secuencia de escaneo haciendo clic en Ejecutar, y espere a que el escáner complete automáticamente la exploración PET y pase del anillo PET al CT para la adquisición de CT. Dado que la encefalomielitis autoinmune experimental, o EAE, los ratones tienen una curvatura pronunciada de la columna vertebral debido a la progresión de la enfermedad, escanearlos mientras están boca arriba ayuda a enderezar la columna vertebral.Haz una incisión en el lado dorsal del animal y retira la piel y el pelaje para exponer la columna vertebral. Corte a lo largo de tres planos transversales a través de la columna vertebral en el cuello, directamente debajo de la caja torácica y en la parte superior de la pelvis para separar las regiones lumbar de las cervicales y torácicas. Retire con cuidado la columna vertebral segmentada para obtener dos piezas, lumbar y cervical torácica.A continuación, aísle la columna vertebral lumbar recortando cuidadosamente la columna vertebral desde el extremo pélvico hasta que la médula espinal lumbar sea visible. Para expulsar la médula espinal lumbar, use una jeringa de punta deslizante llena de PBS y cree un sello entre la jeringa y la columna vertebral con el pulgar y el índice. Empuje suavemente el PBS a través de la jeringa para expulsar la médula espinal sobre una almohadilla absorbente, y repita para la médula espinal torácica cervical insertando la jeringa desde el lado cervical.Coloque los tejidos de la médula espinal en un tubo de conteo gamma. Registre el peso seco y agregue PBS para asegurarse de que el tejido esté en el fondo del tubo para evitar que se seque. Coloque el tubo sobre hielo hasta que esté listo para contar.Para comenzar el análisis de las regiones de interés en la médula espinal, abra la herramienta Región de interés 3D en el menú de navegación. En el encabezado Regiones de interés, use el signo más en la parte inferior del menú para crear seis regiones de interés, región lumbar de interés, región torácica cervical de interés, esqueleto lumbar, esqueleto torácico, médula espinal lumbar, médula espinal torácica. Para evitar la interferencia visual de la señal PET, haga clic en F3 para apagar la PET.Ve a la parte superior del Operador de la Herramienta Región de Interés 3D, y haz clic en el punto sólido a la derecha del símbolo del cursor para abrir el Modo de Pintura 3D, y el menú Erosionar/Dilatar. Seleccione Esfera y cambie el tamaño a 20 píxeles. Del mismo modo, establezca dilatar a más cinco.Antes de continuar, vaya a la parte inferior del menú y asegúrese de que la región lumbar de interés esté seleccionada. En la tomografía computarizada, busque la vértebra L6 de la columna vertebral. Comenzando con una vértebra por encima de L6, dibuja una región lumbar áspera de interés sobre las cinco vértebras por encima de las caderas.A continuación, cambie a la región torácica cervical de interés y trace el resto de la columna vertebral hasta la base del cráneo. Después de dibujar las regiones de interés generalizadas, vaya a la parte superior del operador y seleccione el menú Algoritmos de segmentación. En el menú desplegable, seleccione Otsu Thresholding, luego seleccione la región lumbar de interés para la entrada y asegúrese de que el esqueleto lumbar esté elegido en la parte inferior del menú.En el menú desplegable junto a Imagen, asegúrese de que la tomografía computarizada esté seleccionada, indicada aquí por el número cero. Haga clic en Aplicar y repita el procedimiento para la región torácica cervical de interés y el esqueleto torácico. Después de usar Otsu Thresholding para crear las regiones de esqueleto de interés, regrese al menú de navegación y elimine la región de interés, o marque la columna H para las regiones torácicas lumbar y cervical de interés para ocultarlas.Marque la columna I para ambas regiones esqueléticas de interés, de modo que no se puedan editar. Por último, vuelva a la parte superior del operador de la herramienta Región de interés 3D y vaya al menú Pintura 3D para dibujar las regiones de interés de la médula espinal. Vuelva a seleccionar la herramienta Esfera y trace la médula espinal dentro del esqueleto tanto para la zona lumbar como para la torácica, asegurándose de seleccionar la región de interés correcta en la parte inferior del menú.Para borrar cualquier región de interés, haga clic en Comando/Control y dibuje sobre la parte que desea borrar. Verifique la región de interés de la médula espinal desde los tres planos para asegurarse de que no se dibuje ninguna región de interés fuera de la columna vertebral. Si se desactivó la señal PET, presione F3 después de dibujar las regiones de interés de la médula espinal para volver a encender el PET, o seleccione el controlador visual y haga clic en la barra PET.Vuelva al menú de navegación. Haga clic en el icono de cuadrícula para mostrar la tabla. Copie la tabla en un software de hoja de cálculo y guarde el archivo.Las imágenes PET revelaron una unión elevada de radiotrazadores en el cerebro y la médula espinal torácica de los ratones EAE en comparación con los ratones naïve. El recuento gamma ex vivo mostró un aumento de la unión en los segmentos espinales torácicos lumbares y cervicales, y en el cerebro de los ratones EAE en comparación con los naïve. Las imágenes de autorradiografía ex vivo mostraron un aumento de la unión de radiotrazadores en secciones cerebrales sagitales, específicamente en el tronco encefálico, el cerebelo y los ventrículos de los ratones EAE en comparación con los ratones naïve.Del mismo modo, se observó un aumento de la unión a radiotrazadores en los segmentos de la médula espinal cervical torácica y lumbar de los ratones EAE en comparación con la médula espinal naïve. Después de la PET y el conteo gamma, podemos investigar la relación entre la señal PET y la diana de interés a través de técnicas de biología molecular, como la citometría de flujo y la inmunohistoquímica. Nuestra técnica ha allanado el camino para que los investigadores hagan preguntas sobre el papel in vivo de las células B en múltiples áreas de enfermedades, incluidos los accidentes cerebrovasculares, la esclerosis múltiple, otras enfermedades autoinmunes y el cáncer.

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Investigación

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Neurociencia

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Obtención de imágenes de células B CD19+ en un modelo experimental de ratón con encefalomielitis autoinmune mediante tomografía por emisión de positrones (Video) | JoVE Journal

Obtención de imágenes de células B CD19⁺ en un modelo experimental de ratón con encefalomielitis autoinmune mediante tomografía por emisión de positrones

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