Aprendizaje asociativo aversivo y formación de la memoria mediante el emparejamiento de dos sustancias químicas en Caenorhabditis elegans

El aprendizaje y la memoria son vitales para que los animales sobrevivan y se reproduzcan navegando eficientemente en entornos en constante cambio. También es una de las principales asignaturas estudiadas en neurociencia. Caenorhabditis elegans es un organismo atractivo para el estudio del aprendizaje y la memoria debido a la simplicidad de su sistema nervioso.

Sus diagramas de cableado químico y eléctrico también están completamente reconstruidos. El análisis de comportamiento de Caenorhabditis elegans es extremadamente complicado y se ve afectado por una serie de parámetros como las tensiones químicas, mecánicas y de temperatura. Para comenzar, prepare un medio de crecimiento de nematodos de seis centímetros, o placas NGM, esparciendo 0,2 mililitros de un cultivo líquido de E. coli OP50 en un medio Luria-Bertani e incubándolos a temperatura ambiente durante no más de 24 horas.

El primer día, recoger y colocar cinco animales grávidos bien alimentados en cada placa NGM de seis centímetros con un recolector de lombrices de platino y dejar que pongan alrededor de 50 huevos durante tres horas a temperatura ambiente para obtener una población sincronizada de animales adultos. Para detener la puesta de huevos, retire los animales parentales de los platos con un recolector de lombrices de platino. Cultive a los animales a temperatura ambiente durante unos cinco días para alcanzar la etapa adulta madura, no la etapa adulta joven.

Después de cinco días, recoja alrededor de 200 animales adultos en un recolector de animales lavando cada plato con un mililitro de gelatina acuosa al 0,25% que evitará la adhesión de los animales a la superficie de plásticos, como puntas de pipetas. Luego, lave a los animales moviendo suavemente el colector hacia arriba y hacia abajo dos veces en 10 mililitros de agua destilada doble. Repita el proceso dos veces.

Sumerja suavemente el colector de animales que contiene alrededor de 200 animales en 40 mililitros de una mezcla de 1%1-propanol y ácido clorhídrico a pH 4 en una fuente de cristalización durante un segundo. Lave los animales en el colector sumergiendo muy suavemente el colector una vez en un pocillo de su placa de cultivo de tejido de 6 pocillos que contiene 10 mililitros de agua destilada doble. Luego coloque el colector en un césped E. coli OP50 en una placa NGM de seis centímetros durante 10 minutos para que los animales descansen.

A continuación, lave los animales en el colector con 10 mililitros de agua destilada doble moviendo suavemente el colector hacia arriba y hacia abajo. Repita este lavado tres veces y proceda al ensayo de quimiotaxis. Lave secuencialmente a los animales en un colector con mezcla de propanol y agua destilada doble, una vez cada uno como se demostró anteriormente.

A continuación, coloque el colector en un césped E. coli OP50 en un agar NGM en una placa de Petri de seis centímetros durante 10 minutos para que los animales descansen. A continuación, lave los animales tres veces moviendo suavemente el colector hacia arriba y hacia abajo dos veces en 10 mililitros de agua destilada doble para evitar la contaminación bacteriana y proceda al ensayo de quimiotaxis. Prepare placas de barrena para el ensayo de quimiotaxis en placas de Petri de plástico de seis centímetros.

Luego use una punta de pipeta recortada que tenga una abertura de más de un milímetro para transferir los animales del colector a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga un mililitro de gelatina acuosa al 0,25%. Después de que los animales se asienten en el fondo del tubo por gravedad, retire el sobrenadante del tubo. Vuelva a suspender a los animales en un mililitro de tampón de ensayo de quimiotaxis y déjelos asentarse por gravedad hasta el fondo del tubo durante aproximadamente un minuto.

Luego, retire la mayor cantidad posible de sobrenadante mediante pipeteo. A continuación, localice diagonalmente cuatro microlitros de 1-propanol acuoso al 5% en dos lugares, luego detecte cuatro microlitros de agua destilada doble en otros dos lugares de la placa de Petri. Luego use una punta de pipeta recortada con una abertura de un milímetro para detectar seis microlitros de la suspensión animal en un tampón de ensayo de quimiotaxis que contiene alrededor de 60 animales en el centro de tres placas.

Retire el líquido tanto como sea posible con una mecha de tejido de laboratorio sin tocar a los animales. Coloque una tapa en el plato y permita que los animales se muevan libremente sobre el plato durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para detener la quimiotaxis, transfiera esta placa a una placa de Petri de vidrio en hielo durante tres minutos.

Luego, coloque el plato en un refrigerador hasta que cuente el número de animales en el plato. Cuente el número de animales en cuatro secciones, excepto los del círculo central bajo un microscopio estereoscópico, y calcule el índice de quimiotaxis usando la ecuación. A partir de los valores del índice de quimiotaxis, calcule los valores del índice de aprendizaje como la diferencia entre el valor del índice de quimiotaxis de los animales de referencia y el valor del índice de quimiotaxis de los animales condicionados.

En el ensayo de quimiotaxis, los animales acondicionados con la mezcla de 1-propanol y ácido clorhídrico no nos sentimos atraídos por el 5%1-propanol visto en placas de agar, mientras que los animales ingenuos y de referencia se sintieron atraídos por el 5%1-propanol. Los animales condicionados por el entrenamiento espaciado con una mezcla de 1-propanol acuoso y ácido clorhídrico ya no se sintieron atraídos por el 5%1-propanol en comparación con los animales tratados con 1%1-propanol o ácido clorhídrico, o agua doble destilada solamente. El estudio del efecto de las mutaciones en la memoria reveló que la formación de la memoria a corto y largo plazo dependía de que los genes desempeñaran papeles esenciales en el condicionamiento clásico de los animales.

Después de cada acondicionamiento, los animales deben lavarse suavemente solo una vez con agua destilada doble. Después de que se forma la memoria a largo plazo mediante el procedimiento, las imágenes de calcio y la electrofisiología pueden identificar los circuitos neuronales responsables de la memoria. A través de análisis genéticos y de neuronas individuales, los procesos de almacenamiento y recuperación de la memoria se pueden abordar a nivel molecular y de células individuales.