Name: Conceptos básicos de histología y detección de muerte celular en tejido de abeja melífera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Aprende técnicas de inmunohistoquímica para detectar apoptosis y necrosis en tejidos de abeja melífera. Este método permite evaluar los efectos celulares de pesticidas en el intestino medio y glándulas hipofaríngeas.

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Agradezco el apoyo de la Agencia de Investigación de Eslovenia, subvención nº P4-133.

1. Histología básica para la investigación de las abejas melíferas
<ol><li>Disección de tejido de abeja melífera NOTA: Para la disección de abejas obreras, use un microscopio de disección con una fuente de luz LED. El aumento más útil es ~20x.<ol><li>Manipulación y disección<ol><li>Tome con cuidado una abeja obrera con fórceps y póngala en hielo (o en el congelador a -20 ° C) durante 2 minutos para inmovilizarla22. Fije la abeja en la placa de Petri diagonalmente a través de la parte posterior superior del tórax dos veces, de izquierda a derecha y de derecha a izquierda.</li>
			<li>Vierta solución salina de insectos para cubrir el cuerpo. Coloque la placa de Petri bajo el microscopio, enfoque y ajuste.</li>
			<li>Prepare los instrumentos (consulte la Tabla de materiales).</li>
		</ol></li>
		<li>Disección del intestino medio<ol><li>Comience con el abdomen insertando un punto de las tijeras debajo de la tergita A5 (Figura 1) en el centro del lado derecho del cuerpo de la abeja. Corte a la tergita A2.</li>
			<li>Mantenga la hoja interna de las tijeras paralela al costado del cuerpo para evitar dañar los órganos internos. Gire las tijeras a la izquierda y haga un corte; Gire a la derecha y haga otro corte. Abra suavemente la parte izquierda del abdomen y fíjelo. Repita en el otro lado.</li>
			<li>Usando fórceps con una mano, tire suavemente del estómago de la abeja hacia arriba, y con tijeras en la otra mano, corte al final del esófago. Tire del estómago y el intestino medio lejos del abdomen y corte en el recto. Use una pipeta con solución salina de insectos y retire cualquier heces o partes del tejido.</li>
		</ol></li>
		<li>Disección de HPG<ol><li>Inmovilizar una abeja obrera en hielo como se describe en el paso 1.1.1. Corte la cabeza y colóquela en la placa más pequeña con las antenas hacia arriba. Asegure la cabeza con dos clavos: uno a través del ojo compuesto izquierdo y el segundo a través del ojo compuesto derecho.</li>
			<li>Haga un corte a través del primer ojo compuesto en el lado interno de los alfileres, continúe hasta el labrum y luego haga otro corte en el otro lado a través del segundo ojo compuesto (Figura 2).</li>
			<li>Corte las antenas. Quítese la máscara y córtela donde aún esté sujeta. Tome los fórceps y retire cuidadosamente las glándulas junto con el cerebro y parte de los ojos compuestos.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Fijación, deshidratación e incrustación de parafina NOTA: Use guantes protectores.<ol><li>Coloque el pañuelo en frascos de penicilina, llenos 3/4 con 10% de formalina. Conservar en nevera a 4 °C.</li>
		<li>Después de 24 h, deshidratar el tejido en una serie de alcoholes: 70%, 80%, 90%, 100%, durante 1 h cada uno, 100% 2-propanol durante 1 h, 100% 2-propanol durante 12 h, y finalmente 100% 2-propanol durante 1 h.</li>
		<li>Coloque el tejido en histocasetes; márquelos y colóquelos en las cámaras de vidrio con 2-propanol y parafina (1:1) en una incubadora a 60 °C durante 24 h.</li>
		<li>Mover los histocasetes a otra cámara con parafina (I.) durante otras 24 h. Repetir el procedimiento con parafina fresca dos veces más (II. y III.), ambas durante 24 h.</li>
		<li>Finalmente, prepare la estación de montaje y comience a incrustar el tejido en cera.<ol><li>Abra cada histocasete y retire la cubierta. Llene el molde con cera y coloque cuidadosamente el pañuelo con pinzas tibias en el centro del molde.</li>
			<li>Coloque el histocasete en el molde y cúbralo ligeramente con cera. Coloque inmediatamente el molde en la superficie fría de la estación de montaje durante unos segundos, luego colóquelo en la placa fría durante unos minutos hasta que la cera se endurezca y se separe del molde y del histocasete.</li>
		</ol></li>
		<li>Guarde las muestras terminadas en una caja, lejos del polvo y el calor.</li>
		<li>Corte secciones delgadas de 4 μm en un micrótomo: primero, dos secciones unidas entre sí y luego una por separado. Transfiera las secciones con pinzas y déjelas flotar en agua destilada (42 ° C), luego recójalas en toboganes limpios colocando dos secciones juntas en el lado izquierdo del vidrio objetivo y la tercera en el lado derecho, permaneciendo claramente separadas. Deje los portaobjetos marcados durante la noche en el dispositivo de calentamiento y finalmente guárdelos en una caja dedicada a muestras histológicas.</li>
	</ol></li>
	<li>Desparafinado y rehidratación NOTA: Use guantes protectores.<ol><li>Prepare nueve frascos de Coplin y coloque las secciones en una serie de agentes de limpieza (I., II., III.) durante 5 minutos cada uno.</li>
		<li>Poner en 2-propanol, etanol 96% (I., II.), alcohol 90% y 80%, y agua destilada durante 3 min cada uno.</li>
	</ol></li>
	<li>Teñido con hematoxilina y eosina NOTA: Use guantes protectores.<ol><li>Prepara seis frascos de Coplin.</li>
		<li>Para la tinción de hematoxilina y eosina (H&amp;E), coloque las secciones desparafinadas y rehidratadas en hematoxilina durante 5 minutos, luego colóquelas cuidadosamente debajo del agua corriente del grifo durante 2 minutos. Luego póngalos en agua destilada durante 1 minuto y eosina durante 4 minutos (para la eosina, el frasco de Coplin no es necesario).</li>
		<li>Coloque los portaobjetos en etanol al 96% durante 1 minuto, luego 2-propanol durante 2 minutos y finalmente en el agente de limpieza durante 2 minutos.</li>
		<li>Agregue el medio de montaje y un vidrio de cubierta y déjelos secar. Observe bajo un microscopio de luz.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig01.jpg"> Figura 1: Vista dorsal del cuerpo de la abeja. Tergitas A1-A7. Las instrucciones detalladas sobre la disección de abejas melíferas se pueden encontrar en Carreck et al.24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64141/64141fig02v2.jpg"> Figura 2: Vista dorsal de HPG, partes de ojos compuestos unidos al cerebro (no visibles). Una abeja obrera joven de 5 a 6 días tiene HPG blancos regordetes y cremosos. Los acinos se encuentran en el cerebro y llenan el área de la cabeza con ramas que llegan a la parte posterior del cerebro. En las abejas forrajeras, estas glándulas se encogen mucho y dejan solo restos delgados en forma de hilo. Por esta razón, es mejor extirpar las glándulas junto con el cerebro para facilitar los procedimientos adicionales para evitar perder el tejido. Barra de escala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64141/64141fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
2. Detección de muerte celular en secciones de tejido
<ol><li>Kit de detección de apoptosis (Ensayo A) NOTA: Siga el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).<ol><li>Prepare los frascos de Coplin.</li>
		<li>Después de desparafinar y rehidratar (ver paso 1.3), sumergir los portaobjetos en una solución de NaCl al 0,85% y, a continuación, en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (5 min).</li>
		<li>Poner los portaobjetos en paraformaldehído al 4% 2 x 15 min.</li>
		<li>Coloque los portaobjetos planos en el recipiente y agregue 100 μL de una solución de proteinasa K (20 μg / ml), luego déjelos durante 10-30 minutos.</li>
		<li>Coloque las diapositivas en PBS (5 min).</li>
		<li>Coloque los portaobjetos en paraformaldehído al 4% en PBS (5 min).</li>
		<li>Sumergir las diapositivas en PBS (2 x 5 min).</li>
		<li>Coloque los portaobjetos planos en el recipiente, agregue 100 μL de tampón de equilibrio y déjelos durante 5-10 minutos.</li>
		<li>Añadir 100 μL de mezcla de reacción TdT. Coloque toallas de papel dentro del recipiente, alrededor de los toboganes, humedezca las toallas con agua y luego cúbralas con una envoltura de plástico. Incubar los portaobjetos durante 60 min a 37 °C.</li>
		<li>Vuelva a colocar los portaobjetos en la rejilla de tinción y sumérjalos en 2x citrato de sodio salino (SSC) durante 15 min.</li>
		<li>Sumerja las diapositivas 3 x 5 min en PBS, luego en peróxido de hidrógeno al 0,3% durante 3-5 min, y luego en PBS nuevamente, 3 x 5 min.</li>
		<li>Nuevamente, coloque los portaobjetos planos en el recipiente, agregue 100 μL de Streptavidin HRP (peroxidasa de rábano picante) y déjelos actuar durante 30 minutos (cubra con una envoltura de plástico).</li>
		<li>Sumerge las diapositivas 3 x 5 min en PBS.</li>
		<li>Colocar los portaobjetos planos en el recipiente y añadir 100 μL de solución de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Busca un fondo marrón claro.</li>
		<li>Devuelva los portaobjetos a la rejilla y lávelos varias veces en agua (doble destilación).</li>
		<li>Monte las guías bajo cubreobjetos de vidrio en medio de montaje y déjelas secar.</li>
		<li>Observe bajo un microscopio de luz.</li>
	</ol></li>
	<li>Kit de detección de apoptosis (Ensayo B) NOTA: Siga el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).<ol><li>Prepare frascos de Coplin.</li>
		<li>Preparar proteinasa K (20 μg/ml diluidos en PBS).</li>
		<li>Después de desparafinar y rehidratar las secciones (paso 1.3), coloque los portaobjetos en PBS durante 5 min.</li>
		<li>Coloque los portaobjetos planos en el recipiente y agregue proteinasa K (20 μg/ml, 60 μl por muestra de 5 cm²).</li>
		<li>Lave los toboganes 2 x 2 min en agua destilada.</li>
		<li>Enfriamiento en peroxidasa endógena (en peroxidasa de hidrógeno al 3%) a temperatura ambiente.</li>
		<li>Enjuague los toboganes 2 x 5 min con PBS o agua.</li>
		<li>Coloque los portaobjetos planos en el recipiente y aplique un tampón de equilibrio (75 μL/5 cm2) durante 10 s a temperatura ambiente.</li>
		<li>Limpie cuidadosamente alrededor del pañuelo.</li>
		<li>Añadir la enzima TdT (desoxinucleotidiltransferasa terminal) a cada sección e incubar en una cámara humidificada durante 1 h a 37 °C. Coloque toallas de papel dentro de la bandeja, alrededor de los toboganes, humedezca las toallas con agua y cúbralas con una envoltura de plástico.</li>
		<li>Después de la incubación, coloque las muestras en la rejilla y déjelas en un tampón de parada / lavado (10 min).</li>
		<li>Caliente el conjugado antidigoxigenina a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lave las diapositivas en PBS (3 x 1 min).</li>
		<li>Limpie cuidadosamente alrededor del pañuelo.</li>
		<li>Añadir dos gotas de antidigoxigenina-peroxidasa conjugada (65 μL/5 cm²) a las secciones e incubar durante 30 min en un recipiente humidificado.</li>
		<li>Después de lavar en PBS 4 x 2 min, prepare el sustrato de peroxidasa de fuerza de trabajo y golpee suavemente el exceso de líquido y aspire alrededor de la sección.</li>
		<li>Cubrir las secciones con sustrato de peroxidasa (75 μL/5 cm²) y teñir durante 5 min. Coloque un portaobjetos bajo el microscopio y determine el tiempo óptimo de tinción.</li>
		<li>Lave los portaobjetos en una rejilla de tinción en agua destilada (3 x 1 min).</li>
		<li>Incubar los toboganes en agua destilada durante 5 min.</li>
		<li>Contrarrestar la tinción con hematoxilina durante 2 min.</li>
		<li>Coloque el tobogán bajo agua corriente del grifo durante 3 minutos.</li>
		<li>Lave el tobogán con agua destilada.</li>
		<li>Monte las guías bajo cubreobjetos de vidrio en medio de montaje y déjelas secar.</li>
		<li>Observe bajo un microscopio de luz.</li>
	</ol></li>
	<li>Kit de detección de apoptosis (Ensayo C) NOTA: Siga el protocolo del fabricante (consulte la Tabla de materiales).<ol><li>Prepare los frascos de Coplin.</li>
		<li>Desparafinar y rehidratar las secciones de tejido (ver paso 1.3).</li>
		<li>Incubar el tejido con proteinasa K (15-30 min a 37 °C).</li>
		<li>Vuelva a colocar las guías en la rejilla y enjuague 2x en PBS.</li>
		<li>Cubrir con 50 μL de «mezcla de reacción TUNEL». Coloque las toallas de papel húmedas dentro del recipiente, cúbralas con una envoltura de plástico y déjelas durante 60 minutos a 37 ° C.</li>
		<li>Enjuague 3x con PBS.</li>
		<li>Coloque los portaobjetos en el recipiente y seque el área alrededor de la muestra de tejido.</li>
		<li>Añadir 50 μL de Converter-AP a la muestra e incubar en un recipiente humidificado durante 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Enjuague 3x en PBS.</li>
		<li>Añadir 50-100 μL de solución de sustrato y dejar actuar durante 10 minutos en la oscuridad. NOTA: Observe la tinción bajo un microscopio óptico.</li>
		<li>Enjuague las diapositivas 3 veces con PBS.</li>
		<li>Contrarresta la tinción transfiriendo secciones a hematoxilina durante 2 minutos y luego enjuague cuidadosamente con agua corriente del grifo durante 5 minutos.</li>
		<li>Monte las guías bajo cubreobjetos de vidrio en un medio de montaje acuoso y déjelas planas para que se sequen.</li>
		<li>Observe bajo un microscopio de luz. Evalúe las células afectadas (positivas) contando de 70 a 100 células en cada muestra del intestino medio o HPG bajo un microscopio óptico.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

El autor no tiene conflictos de intereses.

En los organismos vivos, la muerte celular se define como apoptosis o necrosis25 y puede ir acompañada de autofagia26. La diferencia entre las células apoptóticas y necróticas es que la apoptosis es una forma de muerte celular programada y aparece en células normales, mientras que la necrosis ocurre debido a condiciones letales (por ejemplo, accidente, enfermedad)27,28. La apoptosis se puede detectar utilizando kits...

Las abejas melíferas (Apis mellifera L.) son, entre otros polinizadores silvestres, los polinizadores más importantes de las plantas agrícolas. Durante miles de años, el entorno cambiante ha influido en las abejas para adaptar su morfología, fisiología, comportamiento y tolerancia a varios patógenos y parásitos. Por lo tanto, las abejas han desarrollado una gama muy diversa de especies y subespecies en todo el mundo1. Estos resultados son consistentes con hallazgos previos, que existe variación genética en la estructura del tracto digestivo de la abeja, pero también sugieren que las alteraciones del intestino medio se deben a factores ambientales 2,3.
El tracto digestivo de la abeja melífera tiene tres partes principales: intestino anterior, intestino medio (ventrículo) e intestino posterior4. El ventrículo es un órgano esencial para la digestión del polen y el néctar/miel; En el intestino posterior, el control osmótico tiene lugar a través de la absorción de agua e iones2. Las glándulas hipofaríngeas (HPG) de las obreras de las abejas melíferas se encuentran en la cabeza y sintetizan y secretan componentes de jalea real para alimentar a la cría, la reina y los miembros de la colonia. Su tamaño cambia con la edad y las tareas y depende de una nutrición adecuada (polen de calidad). Las enfermeras trabajadoras de 6 a 18 días realizan la cría de crías, y el tamaño de las HPG aumenta 5,6. En las abejas forrajeras, las HPG degeneran y sólo secretan enzimas que son importantes para convertir los azúcares complejos en simples (α-glucosidasas, leucina arilamidasa, invertasa) en la miel7.
Las abejas están expuestas a varios factores estresantes bióticos y abióticos8, y el tracto digestivo puede verse afectado por varios estimulantes negativos. La primera barrera que protege al organismo de los patógenos es la membrana peritrófica en el intestino medio, que consiste en mucosa intestinal para proteger contra patógenos4. El desarrollo y la función de los HPG dependen de la dieta, la edad y la condición de la colonia9, y se ven afectados por insecticidas, acaricidas 10 y patógenos11,12,13. Los residuos acaricidas en la colmena debido al tratamiento de control de varroa y pesticidas del medio ambiente afectan a las abejas recolectoras y a las abejas nodrizas14,15. La mayor amenaza para las colonias de abejas melíferas es el ácaro Varroa destructor, tanto como vector de virus que contribuyen a la pérdida de colonias16 como consumidor del cuerpo graso del huésped (un órgano vital importante en las abejas), que consecuentemente afecta el cuerpo del individuo y las funciones de la colonia17.
Sin embargo, los hábitats intensivos de tierras de cultivo pueden proporcionar un suministro de alimentos a corto plazo para las abejas. Por lo tanto, los regímenes agroambientales deben mejorar la disponibilidad de flores de miel en los paisajes agrícolas18. Para evaluar la morfología de diferentes subespecies 6,19,20,21 o los efectos subletales de estos factores a nivel celular o tisular, especialmente el intestino medio y las HPG, los métodos histológicos e inmunohistoquímicos son prácticos y suficientemente precisos para ser utilizados en la investigación histológica en abejas.

<table><tbody>Kit de peroxidasa ApopTag <tr><td>2-Propanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(detección de apoptosis in situ de peroxidasa ApopTag)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7100</td><td>Assay B, https://www.sigmaaldrich.com/SI/en/product/mm/s7100?gclid=CjwKCA jw7vuUBhBUEiwAEdu2pPanI9SE j81ZTl-nLHEoxXAv7ViKwPA_QRx H7fciMRNcYwR7lbPQbhoCqcQQA vD_BwE; Controles positivos incluidos en S7101 Cubiertas</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>,<td>DeadEnd, Sistema TUNEL colorimétrico</td>, <td>Promega</td><td>G7360</td><td>, Ensayo A,</td></tr><tr><td>https://worldwide.promega.com/products/cell-health-assays/apoptosis-assays/deadend-colorimetric-tunel-system/?catNum=G7360 Microscopio de disección&nbsp; (para disección de abejas)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td><td></td>destilada</tr><tr><td>Casete</td><td></td><td></td><td></td>de inclusión</tr><tr><td>Sistema EnVision kit de fosfatasa alcalina</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y Solución</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Etanol</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> alcohólico <td>95% (o menos puro), 90%, 80%</td></tr><tr><td>Faramount medio de montaje, acuoso</td><td>Medio</td><td>de montaje</td>Dako <td></td></tr><tr><td>Mesa de aplanamiento</td><td>Leica</td><td>HI1220</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas&nbsp; (para disección de abejas)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11294-00</td><td>Estándar #4</td></tr><tr><td>Formalina 10%</td><td></td><td></td><td>Formaldehído</td></tr><tr><td>Hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente de limpieza HistoChoice Agente</td><td>de limpieza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidasa de hidrógeno 3%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alfileres para insectos&nbsp; (para disección de abejas)</td><td>Entosphinx</td><td>44594</td><td>Alfileres de insectos de acero inoxidable y blanco, tamaño 2</td></tr><tr><td>ISCDDK, AP (Kit de detección de muerte celular in situ, fosfatasa alcalina)</td><td>Roche</td><td></td><td>11684809910 Assay C, https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/362/737/11684809910b ul.pdf</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lab clock</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>óptico Los</td> portaobjetos de microscopio Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> La <td>caja con los portaobjetos debe conservarse en una envoltura de plástico para evitar el polvo</td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica</td> Estación modular de inclusión de tejidos Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído 4%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Pipetas</td> Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>1,5 mL; 3 mL</td>de PBS Placa de Petri&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> (para disección de abejas)</td><td></td><td></td><td>Lleno de silicio de condensación &nbsp; (Xantoprene L azul y Líquido universal más activador)</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Merck</td><td>21627</td><td></td></tr><tr><td>Solución de timbre&nbsp; (para disección de abejas)</td><td></td><td></td><td>7,5 g de NaCL, 2,38 g de Na2HPO4, 2,72 g de KH2PO4, 1 L de agua destilada</td></tr><tr><td>Tijeras&nbsp; (para disección de abejas)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>1406-09, 14061-09</td><td>Recto y curvo, 9 cm</td></tr><tr><td>Activador universal de líquido plus&nbsp; (para disección de abejas)</td><td>Relojero Kulzer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>' pinzas s (para disección de abejas)</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>Pincel de</td> acuarela Leica <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2x</td>Xantoprene L azul&nbsp;<td></td><td></td></tr><tr><td> (para disección de abejas)</td><td>Kulzer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

conceptos básicos de histología y detección de muerte celular en tejido de abeja melífera

Histology Basics and Cell Death Detection in Honeybee Tissue

Las abejas melíferas (Apis mellifera L.) dentro de la colmena (obreras nodrizas y otras abejas de la colmena) y fuera de la colmena (recolectoras) están expuestas a cambios climáticos y climáticos, diversos pesticidas, patógenos y desnutrición, que ingresan principalmente por la boca y afectan principalmente el tracto digestivo de las abejas adultas. Para comprender y prevenir los efectos de tales factores estresantes externos e internos en las abejas, un método de investigación útil es el método inmunohistoquímico. Se describe un protocolo básico para preparar el intestino medio (ventrículo) y las glándulas hipofaríngeas (HPG) de las abejas adultas para el análisis histológico. Se describe una metodología detallada para evaluar el nivel de daño celular y distinguir la necrosis de la muerte celular programada (apoptosis) como un proceso natural de regeneración tisular. Se presentan los resultados del tratamiento de abejas adultas con ácido oxálico y pesticidas (insecticida y acaricida) y la determinación de la muerte celular en el ventrículo y HPG. También se discuten los pros y los contras de la metodología.

Detección de muerte celular en el intestino medio Las abejas obreras recién emergidas (Apis mellifera carnica) del colmenar experimental en el Instituto Agrícola de Eslovenia en Liubliana fueron tratadas individualmente con ácido oxálico (OA) al 3%23. OA se utiliza con frecuencia en la apicultura para el control del destructor Varroa . Después del tratamiento, las abejas obreras (tres de cada grupo) fueron inmovilizadas en hielo. Se diseccionó el intestino med...

Los métodos inmunohistoquímicos son útiles en la investigación de abejas melíferas para detectar y evaluar el nivel de apoptosis y necrosis en el intestino medio y las glándulas hipofaríngeas de las abejas adultas.

Conceptos básicos de histología y detección de muerte celular en tejido de abeja melífera

Honeybees (Apis mellifera L.) inside the hive (nurse workers and other hive bees) and outside the hive (foragers) are exposed to climate and weather ...

Este protocolo es útil en muchos estudios biológicos y toxicológicos de abejas tratadas con pesticidas. Ayuda a detectar las respuestas celulares del tejido de las abejas melíferas de los acaricidas que se utilizan en las colonias de abejas para el tratamiento contra los ácaros Varroa. Es una herramienta poderosa para la detección de efectos inferiores a los pequeños en el tejido en combinación con el comportamiento de las abejas u otros insectos beneficiosos.Para comenzar, tome con cuidado una abeja obrera con fórceps y póngala en hielo o congelador a menos 20 grados centígrados durante dos minutos para inmovilizarla. Fije la abeja en la placa de Petri diagonalmente a través de la parte posterior superior del tórax dos veces de izquierda a derecha y de derecha a izquierda. Pobre solución salina de insectos para cubrir el cuerpo.Coloque la placa de Petri bajo el microscopio estereoscópico, enfoque y ajuste. Para diseccionar el intestino medio, comience con el abdomen insertando un punto de las tijeras debajo de la tergita A5 en el centro del lado derecho del cuerpo de la abeja. Corte a la tergita A2. Mantenga la hoja interna de las tijeras paralela al costado del cuerpo para evitar dañar los órganos internos.Gire las tijeras hacia la izquierda y corte. Abra suavemente la parte izquierda del abdomen y fíjelo. Usando fórceps con una mano, tire suavemente del estómago de la abeja hacia arriba, y con tijeras en la otra mano, corte al final del esófago.Tire del estómago y el intestino medio lejos del abdomen y corte en el recto. Use una pipeta con solución salina de insectos y retire cualquier heces o partes del tejido. Para la disección de las glándulas hipofaríngeas, inmovilice una abeja obrera en hielo como se describió anteriormente.Corte la cabeza y colóquela en una placa más pequeña con la antena hacia arriba. Asegure la cabeza con dos clavos, uno a través del ojo compuesto izquierdo y el segundo a través del ojo compuesto derecho. Haga un corte a través del primer ojo compuesto en el lado interno de los alfileres, continúe hasta el labrum y luego haga otro corte en el otro lado a través del segundo ojo compuesto.Corte las antenas. Quítese la máscara y córtela donde aún esté sujeta. Tome los fórceps y retire cuidadosamente las glándulas junto con el cerebro y parte de los ojos compuestos.Para la tinción de hematoxilina y eosina, coloque las secciones desparafinadas y rehidratadas en hematoxilina durante cinco minutos. Luego, colóquelos con cuidado bajo agua corriente del grifo durante dos minutos. Luego, póngalos en agua destilada durante un minuto y eosina durante cuatro minutos.Coloque los portaobjetos 96% etanol durante un minuto, luego 2-propanol durante dos minutos, y finalmente en el agente de limpieza durante dos minutos. Agregue el medio de montaje y un vidrio de cubierta y déjelos secar. Observe bajo un microscopio de luz.Prepare frascos de Coplin. Preparar proteinasa-K. Después de desparafinar y rehidratar las secciones, coloque las diapositivas en PBS durante cinco minutos.Coloque los portaobjetos planos en el recipiente y agregue proteinasa-K. Lave los toboganes con agua destilada. Enfriar en peroxidasa endógena a temperatura ambiente.Enjuague los portaobjetos con PBS o agua. Coloque las guías planas en el recipiente y aplique el tampón de equilibrio durante 10 segundos a temperatura ambiente. Después de limpiar alrededor del tejido, agregue la enzima desoxinucleotidiltransferasa terminal a cada sección e incube en una cámara humidificada durante una hora a 37 grados centígrados.Antes de la incubación, coloque toallas de papel humedecidas dentro de la bandeja alrededor de los portaobjetos y cúbralas con una envoltura de plástico. Después de la incubación, coloque las muestras en la rejilla y déjelas en un tampón de parada-lavado. Después de lavar los portaobjetos en PBS y limpiar alrededor de los pañuelos desechables, agregue dos gotas de conjugado anti-digoxigenina peroxidasa tibia a las secciones e incube durante 30 minutos en un recipiente humidificado.Después del lavado en PBS, prepare el sustrato de peroxidasa de fuerza de trabajo, cubra las secciones con sustrato de peroxidasa y tiñe durante cinco minutos. Coloque el portaobjetos bajo el microscopio y determine el tiempo óptimo de tinción. Después de lavar los portaobjetos en una rejilla para manchas y agua destilada, incubar los portaobjetos en agua destilada durante cinco minutos.Contra-tinción usando hematoxilina durante dos minutos. Lave los toboganes colocándolos bajo agua corriente del grifo durante tres minutos y luego en agua destilada. Monte las guías debajo de los cubreobjetos de vidrio y el medio de montaje y déjelas secar planas.Observe bajo un microscopio de luz. El porcentaje de células afectadas se calculó utilizando un microscopio óptico. Los resultados indicaron que el tratamiento con ácido oxálico afectó significativamente a las células del intestino medio.La inmunotinción mostró productos de reacción rojos o marrones positivos en los núcleos apoptóticos de las glándulas hipofaríngeas. El producto de reacción positiva después del tratamiento con imidacloprid o cumaphis se determinó en la mayoría de las células glandulares. Al levantar la máscara de la cabeza de abeja, tenga cuidado de no dañar o arrancar las partes de las glándulas hipofaríngeas.Esta técnica detecta cambios subclínicos en las abejas y también es adecuada para la detección de otros efectos ambientales en las abejas y algunos otros organismos vivos.

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Investigación

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Biology

Biología

Las abejas pueden ser acondicionadas en una paradigma de aprendizaje olfativo apetito (PER acondicionado). Utilizando los olores como estímulo, hemos establecido un método en el que el comportamiento se registra al mismo tiempo imágenes de calcio se utiliza para medir la actividad de olor evoca en las neuronas del cuerpo de...

En vivo Ca 2 + - Imágenes de las neuronas del cuerpo de hongos durante el aprendizaje olfativo en la abeja de la miel

Se presenta un protocolo simple de visualizar regiones de la muerte celular programada (PCD) en embriones de ratón y diferenciadores madre embrionarias (ES) de cultivos de células utilizando un colorante altamente soluble llamada LysoTracker.

El uso de LysoTracker para detectar la muerte celular programada en embriones y la diferenciación de células madre embrionarias

En los trabajadores de abejas, el envejecimiento depende de los comportamientos sociales, más que en la edad cronológica. Aquí se muestra cómo se pueden obtener y se analizó la senescencia celular trabajadores-con tipos muy diferentes patrones de envejecimiento.

La obtención de especímenes con desacelerado, acelerado y Invertida Envejecimiento en la abeja de la miel Modelo

Micropartículas membrana arrojar celulares (MPs) son vesículas biológicas activas que pueden ser aislados y sus efectos fisiopatológicos investigados en varios modelos. Aquí se describe un método para generar MPs derivadas de los linfocitos T (LMP) y para demostrar su efecto proapoptótico en células epiteliales de las vías respiratorias.

Generación de linfocítica micropartículas y detección de su efecto proapoptótico sobre las células epiteliales de la vía aérea

El tejido adiposo (AT) puede influir en la homeostasis de todo el cuerpo, por lo tanto, es importante comprender los mecanismos moleculares de la diferenciación y función de los adipocitos. Proporcionamos un protocolo para obtener nuevos conocimientos sobre estos procesos mediante el análisis de la homeostasis, la diferenciación y la exposición a la hipoxia de los adipocitos como modelo para la apoptosis inducida de los adipocitos.

Mecanismo de regulación de los números de adipocitos en los organismos adultos a través de diferenciación y apoptosis La homeostasis

Drosophila se utiliza ampliamente como un sistema modelo para estudiar la neurodegeneración. Este protocolo describe un método por el cual la degeneración, como se determina por la formación de vacuolas en el cerebro, se puede cuantificar. También minimiza los efectos debido al procedimiento experimental por el procesamiento y control de seccionamiento y moscas experimentales como una muestra.

La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; Drosophila</em

El vaso dorsal abdominal de la abeja melífera y otros insectos sirve como el equivalente funcional del corazón de los mamíferos y desempeña un papel importante en el transporte de nutrientes, la eliminación de desechos, la función inmune y más. Aquí describimos un protocolo para la visualización y manipulación farmacológica de la frecuencia cardíaca de las abejas.

La disección y la observación de la abeja de la miel dorsal del recipiente de Estudios de la función cardiaca

Para probar los efectos inhibitorios de agentes farmacológicos en la fosfolipasa C (PLC) en las diferentes regiones del cerebro de la abeja, presentamos un ensayo bioquímico para medir la actividad de la PLC en esas regiones. Este análisis podrían ser útil para comparar la actividad de la PLC entre los tejidos, así como entre las abejas exhibe diferentes comportamientos.

Detección de actividad de fosfolipasa C en el homogeneizado de cerebro de la abeja

Tamaño de acino de glándula hipofaríngea es una medida robusta de enfermera nutrición de abejas de miel. Presentamos un protocolo detallado para disección, tinción, proyección de imagen y medición acinos de la glándula de enfermera abeja hipofaríngeo.

Medición de hipofaringe tamaño de acino de glándula en trabajadores de la abeja (Apis mellifera)

Aquí se presenta un protocolo para utilizar el sistema CRISPR-Cas9 para reducir la producción de una proteína en el cerebro adulto de abeja sellos para probar la especificidad de anticuerpos.

Pruebas de anticuerpos anti-RDL y anti-mGlutR1 en secciones de cerebro de abeja con CRISPR-Cas9

Aprende técnicas de inmunohistoquímica para detectar apoptosis y necrosis en tejidos de abeja melífera. Este método permite evaluar los efectos celulares de pesticidas en el intestino medio y glándulas hipofaríngeas.

Conceptos básicos de histología y detección de muerte celular en tejido de abeja melífera

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