Name: Técnica de inyección de embriones para la edición de genes en la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprende la técnica de inyección de embriones en garrapatas Ixodes scapularis para edición de genes. Este método permite estudiar la función génica y las interacciones con patógenos, facilitando el desarrollo de vacunas contra enfermedades como la de Lyme.

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Los autores agradecen a Channa Aluvihare y Yonus Gebermicale, ITF, UMD, por su conocimiento y apoyo durante la fase inicial del desarrollo del protocolo. Las agujas de tungsteno fueron un generoso regalo de David O'Brochta, ITF, UMD. Estamos agradecidos al Dr. Ladislav Simo por probar este protocolo en I. ricinus y por las discusiones perspicaces. Este proyecto fue financiado por NIH-NIAID R21AI128393 y Plymouth Hill Foundation, NY a MG-N, fondos iniciales de la Universidad de Nevada a AN, la Subvención No. 2019609 de la Fundación Nacional de Ciencias a MG-N y AN, y una subvención Peer-to-Peer de IGTRCN a AS.

Los adultos de Ixodes scapularis fueron comprados en la Universidad Estatal de Oklahoma (OSU) o criados en la Universidad de Nevada, Reno (UNR) (protocolo IACUC # 21-001-1118).
1. Preparación de garrapatas hembras para la recolección de embriones
NOTA: Para recolectar huevos de edad apropiada, es importante sincronizar la puesta de huevos. Aunque las señales de puesta de huevos en las garrapatas siguen sin estar claras, bajo las condiciones insectarias estándar (temperatura de 27 ° C y >90% de humedad relativa (HR)), las hembras de I. scapularis comienzan a poner huevos aproximadamente 8 días después del desprendimiento del huésped. Esta línea de tiempo se puede alargar almacenando hembras repletas a 4 ° C. Hemos almacenado hembras alimentadas con sangre a 4 °C hasta 8 semanas sin ningún efecto negativo en la puesta de huevos. Es posible que sea necesario modificar estas condiciones para cada insectario.
<ol><li>Almacene todas las hembras repletas a 4 °C con >90% HR en una caja de plástico de 6 cuartos forrada con papel de filtro húmedo hasta que se use para microinyecciones.</li>
	<li>Una semana antes de las inyecciones, transfiera las hembras de 4 °C a una incubadora a 27 °C para el inicio de la puesta de huevos.</li>
	<li>Cuando las hembras comiencen a poner huevos (3-4 días después de moverlos a 27 °C), retire los huevos con un pincel de punta fina y prepare a las hembras para la ablación de órganos (glándula de cera) de Gené. NOTA: El órgano de Gené se extiende desde el área entre el escuto y el capítulo (base dorsal de las piezas bucales), las piezas bucales se doblan sobre la superficie ventral del cuerpo (paralelas a la superficie) y el órgano extendido del gen recubre los huevos tan pronto como se ponen los huevos (Figura 1). Los huevos puestos antes de la extracción de órganos del Gené o el vaciado de cera tendrán un recubrimiento de cera y no son adecuados para inyecciones y deben desecharse.</li>
	<li>Para extraer o vaciar el órgano del Gené, use arcilla para colocar a la hembra hinchada en un portaobjetos de vidrio bajo un microscopio orientado de modo que las piezas bucales sean visibles tanto en el lado ventral como en el dorsal (Figura 1B, C).<ol><li>Empuje cuidadosamente el área exactamente entre el escuto y las piezas bucales usando pinzas finas y agujas de tungsteno hechas en el laboratorio con alambre de tungsteno siguiendo un protocolo16 previamente publicado (las agujas también se pueden comprar comercialmente y adjuntar a una sonda de micro disección, consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Trabajando el camino hacia adentro con la aguja de tungsteno, tire de la glándula de cera hacia afuera (Figura 1D, E). Puede tomar varios minutos para extirpar la glándula. Limpie cualquier secreción de cera líquida con toallitas de laboratorio. NOTA: La glándula también se puede extirpar del lado ventral justo debajo de las piezas bucales; Alcanzando la espalda hacia Scutum con una aguja y fórceps. La aplicación de pegamento de silicona alrededor de las piezas bucales también bloquea la eversión de órganos de Gene y se puede usar en lugar de eliminar o vaciar la cera (comunicación personal con el Dr. Ladislav Simo, INRAE, Francia). Las garrapatas hinchadas no permanecerán en la cinta de doble cara. Usar arcilla para "envolver" la garrapata ayuda a mantenerla en su lugar durante la manipulación. Use fórceps para sostener la garrapata y la aguja de tungsteno para la disección. La parte ventral es más fácil de perforar con una aguja y preferida por los autores.</li>
	</ol></li>
	<li>Para vaciar la glándula, coloque la garrapata grávida como se menciona en el paso 1.4. Perfore cuidadosamente el área detrás de las piezas bucales en el lado dorsal y aplique presión en el lado ventral con fórceps. NOTA: Alternativamente, no es necesario extirpar la glándula de cera; Vaciar la glándula de cera durará varios días. Las hembras ponedoras de huevos tienen un área blanca alrededor de las partes de la boca que indica la ubicación de la glándula de cera y se puede usar como referencia.<ol><li>Coloque el borde de una toallita de laboratorio sin pelusa y retire la cera líquida que sale del sitio de punción. Asegúrese de evitar la secreción de hemolinfa, que es un líquido transparente en comparación con la cera viscosa ligeramente amarillenta. Puede tomar de 5 a 10 minutos hasta que se elimine la mayor parte de la cera.</li>
	</ol></li>
	<li>Después de la manipulación, coloque a las hembras en una incubadora a 27 ° C (>90% HR) y déjelas recuperarse durante 1-2 días. NOTA: Las hembras tratadas generalmente tardan 1-2 días en recuperarse y comenzar a poner huevos nuevamente.</li>
	<li>Cuando las hembras comiencen a poner huevos nuevamente, use un pincel fino para recolectar los huevos recién depositados (0-18 h después de la puesta de huevos) y colóquelos en un tubo de microcentrífuga de 1.5 ml. NOTA: Si se usan huevos de la misma hembra a lo largo del tiempo, este procedimiento debe repetirse después de 4-5 días de puesta de huevos si no se extirparon las glándulas.</li>
</ol>2. Tratamiento embrionario para microinyecciones
<ol><li>Agregue ~ 200 μL (o volumen suficiente para cubrir los huevos, dependiendo del número de huevos) de cloruro de benzalconio al 5% (peso / volumen) / agua (consulte la Tabla de materiales) en el tubo que contiene huevos de 0 a 18 h de edad. Agite suavemente los huevos con el pincel durante 5 minutos para evitar que los huevos se depositen en el fondo del tubo (para más detalles, consulte Sharma et al.4). Retire el sobrenadante con una micropipeta, dejando los huevos en tubo. PRECAUCIÓN: El cloruro de benzalconio es corrosivo para la piel y los ojos, use guantes y protección para los ojos.</li>
	<li>Agregue ~ 200 μL de agua destilada (DI) al tubo que contiene huevos, agite con un pincel y retire el agua del tubo de microcentrífuga con una micropipeta. Repita el lavado con agua DI una vez más.</li>
	<li>Después de lavar con agua DI, agregue ~ 200 μL de cloruro de sodio (NaCl) al 5% (p/v) y agite suavemente con un pincel durante 5 minutos. Retire la solución del tubo después de 5 minutos y lave los huevos dos veces con agua DI.</li>
	<li>Añadir ~100 μL de solución de NaCl al 1% (p/v) en el tubo de microcentrífuga que contiene los huevos. Mantenga los huevos en solución de NaCl al 1% (p/v) hasta que se usen para inyecciones.</li>
	<li>Comience las microinyecciones después de aproximadamente una hora. Esta línea de tiempo ayuda en la desecación adecuada de los huevos y evita que estallen. NOTA: Los huevos se pueden mantener en solución de NaCl al 1% (p/v) durante 7-8 h sin afectar significativamente la supervivencia. Si los óvulos son difíciles de inyectar o reventar, entonces los huevos no se desecan lo suficiente y pueden tratarse con NaCl al 5% (p/v) durante 5 minutos adicionales.</li>
</ol>3. Preparación de agujas de inyección
<ol><li>Inserte un vidrio capilar de aluminosilicato (con filamento, consulte la Tabla de materiales) en el extractor de agujas siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Ajuste el extractor de agujas a los siguientes ajustes: calor: 575, tracción: 20, velocidad: 50, tiempo: 200 y presión: 700.</li>
	<li>Active la función de tracción del extractor de agujas y repita el proceso para agujas adicionales.</li>
	<li>Guarde las agujas tiradas clavándolas en líneas de arcilla de modelador en una placa de Petri limpia.</li>
	<li>Cargue la aguja con la mezcla de inyección utilizando una punta de microcargador (consulte la Tabla de materiales). NOTA: La comparación de las agujas utilizadas para la inyección de embriones de garrapatas y mosquitos se muestra en la Figura 2.</li>
</ol>4. Configuración de diapositivas para las microinyecciones
<ol><li>Usando cinta adhesiva de doble cara, adhiera dos portaobjetos de microscopio de vidrio juntos, dejando un espacio de aproximadamente 0,5 cm para apoyar la alineación de los huevos y evitar que se volteen durante las inyecciones (Figura 3A).</li>
	<li>Aplique un trozo de apósito de película transparente (consulte la Tabla de materiales) sobre la cinta de doble cara en el espacio entre las diapositivas. Asegúrese de alinear el aderezo de la película perfectamente con el espacio.</li>
</ol>5. Microinyecciones embrionarias
<ol><li>Alinee 8-10 huevos a la vez en la configuración de la diapositiva (arriba) con un pincel de un solo pelo. NOTA: Los huevos alineados con el eje más largo perpendicular (Figura 3B) al borde deslizante son más fáciles de inyectar que los huevos cuyo eje longitudinal está alineado paralelo al borde (Figura 3C). Los huevos en la orientación perpendicular (Figura 3B) pueden soportar mejor la inyección, lo que resulta en una mayor supervivencia.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos con huevos alineados en el escenario de un microscopio compuesto. Use un trozo de toallita sin pelusa para eliminar la solución de NaCl al 1% en la que se almacenan.</li>
	<li>Conecte la aguja de inyección llena a un microinyector conectado a un micromanipulador (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Abra la aguja frotándola suavemente contra la superficie del huevo utilizando un ajuste de alta presión en el microinyector (>5,000 hPa).</li>
	<li>Después de abrir la aguja, reduzca la presión (1,000-2,500 hPa) del microinyector dependiendo de la abertura de la aguja. NOTA: Una abertura pequeña requerirá una presión comparativamente más alta, mientras que una abertura más grande requerirá una presión más baja. Esto es para controlar el volumen de la construcción inyectada. Dependiendo del tamaño de la abertura de la aguja, el volumen de inyección variará de 1 a 5 pL.</li>
	<li>Inyecte todos los huevos en el portaobjetos en un ángulo de 10°-15° lo más rápido posible e inmediatamente mueva el portaobjetos a condiciones de alta humedad en una placa de Petri forrada con papel húmedo. Tan pronto como se inyectan los huevos, comienzan a desecarse. NOTA: La inyección de una pequeña cantidad de óvulos a la vez aumenta el éxito de la inyección y la probabilidad de supervivencia. Las agujas se obstruyen por el reflujo embrionario. Si la punta aún está afilada, para despejar las agujas obstruidas, mueva la aguja en una pequeña gota de NaCl al 1% agregada al borde del portaobjetos. La acción capilar desalojará la pequeña obstrucción. Si la aguja ya está roma, cámbiela.</li>
</ol>6. Cuidados post-inyección de embriones
<ol><li>Coloque el portaobjetos que contiene embriones inyectados en una placa de Petri grande forrada con papel de filtro húmedo. NOTA: Es fundamental no molestar los huevos durante al menos 5-6 h. Esto permite que la herida de inyección se selle correctamente. La herida de la inyección puede abrirse cuando se agita, y el citoplasma puede comenzar a supurar, lo que resulta en la mortalidad del huevo.</li>
	<li>Después de 5-6 h, agregue una pequeña gota de agua DI al apósito de película transparente con embriones inyectados adjuntos. Con un pincel, desplaza suavemente los huevos. Transfiera los huevos a una pequeña placa de Petri (10 cm) y sumérjalos en agua DI. NOTA: El apósito de película permite una fácil extracción de los huevos después de las inyecciones. En el momento en que se agrega una gota de agua al aderezo de la película, los huevos comenzarán a moverse junto con el agua.</li>
	<li>Mantenga los huevos sumergidos en agua y coloque la placa de Petri en una caja de plástico de 6 cuartos en una incubadora a 27 °C y >90% HR.</li>
	<li>Revise los huevos regularmente, diariamente durante los primeros días, y luego cada 3-4 días hasta que las larvas comiencen a eclosionar. NOTA: Si se daña una gran cantidad de huevos durante las microinyecciones, drenar suavemente el agua DI después de una semana evitará el crecimiento de hongos en los huevos muertos.</li>
	<li>Cuando las larvas comiencen a eclosionar de los embriones inyectados (21-25 días después de la inyección para la configuración actual del laboratorio), verifíquelos diariamente y transfiera las larvas eclosionadas a viales de vidrio con una pantalla en la parte superior. Las larvas pueden eclosionar bajo el agua y sobrevivir durante ~ 1-2 semanas.</li>
	<li>Examinar las larvas4 si los huevos fueron inyectados con una construcción que puede resultar en un fenotipo visible.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hinckley, A. F. et al. Lyme disease testing by large commercial laboratories in the United States. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (5), 676-681 (2014).</li>
	<li>Jongejan, F., Uilenberg, G. The global importance of ticks. Parasitology. 129 Suppl, S3-14 (2004).</li>
	<li>Eisen, R. J., Eisen, L. The blacklegged tick, Ixodes scapularis: An increasing public health concern. Trends in Parasitology. 34 (4), 295-309 (2018).</li>
	<li>Sharma, A. et al. Cas9-mediated gene editing in the black-legged tick, Ixodes scapularis, by embryo injection and ReMOT Control. iScience. 25 (3), 103781 (2022).</li>
	<li>Nuss, A., Sharma, A., Gulia-Nuss, M. Genetic manipulation of ticks: A paradigm shift in tick and tick-borne diseases research. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 678037 (2021).</li>
	<li>Heinze, S. D. et al. CRISPR-Cas9 targeted disruption of the yellow ortholog in the housefly identifies the brown body locus. Scientific Reports. 7 (1), 4582 (2017).</li>
	<li>Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).</li>
	<li>Criscione, F., O&#39;Brochta, D. A., Reid, W. Genetic technologies for disease vectors. Current Opinion in Insect Science. 10, 90-97 (2015).</li>
	<li>Jasinskiene, N. et al. Stable transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti, with the Hermes element from the housefly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 3743-3747 (1998).</li>
	<li>Dermauw, W. et al. Targeted mutagenesis using CRISPR-Cas9 in the chelicerate herbivore Tetranychus urticae. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 120, 103347 (2020).</li>
	<li>Santos, V. T. et al. The embryogenesis of the tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus: the establishment of a new chelicerate model system. Genesis (New York, N.Y. 2000). 51 (12), 803-818 (2013).</li>
	<li>Ginsberg, H. S., Lee, C., Volson, B., Dyer, M. C., Lebrun, R. A. Relationships between maternal engorgement weight and the number, size, and fat content of larval Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae). Journal of Medical Entomology. 54 (2), 275-280 (2017).</li>
	<li>Feldman-Muhsam, B., Havivi, Y. Accessory glands of Gene&#39;s organ in ticks. Nature. 187 (4741), 964 (1960).</li>
	<li>Kakuda, H., Koga, T., Mori, T., Shiraishi, S. Ultrastructure of the tubular accessory gland in Haemaphysalis longicornis (Acari: Ixodidae). Journal of Morphology. 221 (1), 65-74 (1994).</li>
	<li>Booth, T. F. Wax lipid secretion and ultrastructural development in the egg-waxing (Gen&#233;&#39;s) organ in ixodid ticks. Tissue &#38; Cell. 21 (1), 113-122 (1989).</li>
	<li>Arrieta, M. C., Leskiw, B. K., Kaufman, W. R. Antimicrobial activity in the egg wax of the African cattle tick Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae). Experimental &#38; Applied Acarology. 39 (3-4), 297-313 (2006).</li>
	<li>Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este es el primer protocolo desarrollado para inyectar embriones tempranos de garrapatas con éxito. Se ha logrado una tasa de supervivencia de ~4%-8%, que es comparable a la inyección de embriones en otros modelos de insectos bien establecidos5.
Como este es el protocolo inicial, se anticipa que este protocolo se perfeccionará y especializará aún más para las especies individuales de garrapatas. En particular, el momento de la inyección variará de una especie a otra, de...

Las garrapatas son vectores de importancia médica y veterinaria, capaces de transmitir una variedad de patógenos virales, bacterianos, protozoarios y nematodos 1,2. En el este de los Estados Unidos, la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis, es un vector importante del patógeno de la enfermedad de Lyme (LD), la espiroqueta Borrelia burgdorferi. Más de 400,000 casos de LD se reportan cada año en los Estados Unidos, lo que la convierte en la principal enfermedad infecciosa transmitida por vectores en los Estados Unidos1. Además de B. burgdorferi, otros seis microorganismos son transmitidos por I. scapularis, incluidas cuatro bacterias (Anaplasma phagocytophilum, B. mayonii, B. miyamoto y Ehrlichia muris eauclarensis), un parásito protozoario (Babesia microti) y un virus (virus Powassan), lo que hace que esta especie de garrapata sea un importante problema de salud pública3 . Mientras que las enfermedades transmitidas por garrapatas se han vuelto más prevalentes en los últimos años, la investigación sobre garrapatas se ha quedado atrás de otros artrópodos vectores, como los mosquitos, debido a la biología única de las garrapatas y los desafíos asociados con la aplicación de herramientas genómicas genéticas y funcionales 4,5.
Las técnicas de edición de genes, particularmente CRISPR / Cas9, ahora han hecho factibles los estudios de genómica funcional en organismos no modelo. Para crear mutaciones hereditarias en un organismo, la inyección de embriones sigue siendo el método preferido para entregar constructos para alterar la línea germinal 6,7,8,9. Sin embargo, hasta hace poco4, los huevos de garrapatas se consideraban demasiado difíciles o incluso imposibles de inyectar sin matar el embrión10,11. Una gruesa capa de cera en los huevos, corion duro y alta presión intraovalada fueron algunos de los principales obstáculos que impidieron la inyección de embriones en garrapatas. I. scapularis adulto, alimentado con sangre, deposita una sola nidada de hasta 2.000 huevos12 durante 3-4 semanas (aproximadamente 100 huevos/día). Los huevos se ponen individualmente, y cada huevo está cubierto con cera que es secretada por protuberancias o "cuernos" del órgano glandular de Gené13,14,15 de la madre. Esta cera protege los huevos de la desecación y contiene compuestos antimicrobianos15. Para inyectar con éxito los huevos de garrapata, es importante quitar la capa de cera, ablandar el corion y desecar los huevos para disminuir la presión intraovalada para que la inyección no dañe irreversiblemente el huevo. Entendiendo la importancia crítica de las inyecciones de embriones para una transformación exitosa de la línea germinal, se desarrolla un protocolo para I. scapularis, que se puede utilizar para administrar una construcción CRISPR / Cas9 y generar mutaciones estables de la línea germinal4. Además de su contribución a la investigación de I. scapularis, este protocolo también podría optimizarse para otras especies de garrapatas.

<table><tbody><tr><td>Capilares de silicato de aluminio, con filamento</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>AF100-64-10</td><td>Inyección de embriones</td></tr><tr><td>Cloruro de benzalconio 50% en agua, 25 g</td><td>TCI-America</td><td>B0414</td><td>Tratamiento con embriones, 25 g son aproximadamente 25 mL</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>1001-090</td><td>Cuidados post-inyección</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Thomas Scientific</td><td>300-101</td><td>Órgano del gen manipulación</td></tr><tr><td>Toallitas de laboratorio</td><td>Genesee Scientific</td><td>88-115</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Carga de las agujas extraídas</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>ROE-200 Inyección de</td><td>embriones</td></tr><tr><td>Portaobjetos microscópicos: bordes lisos y rectificados</td><td>Genesee Scientific</td><td>29-100 Alineación del</td><td>embrión, se prefieren los bordes rectificados, los bordes biselados podrían oscurecer los huevos de la vista</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td>Tratamiento de embriones</td></tr><tr><td>Tirador de agujas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Permanente Cinta adhesiva de doble cara</td><td>Scotch</td><td>34-8716-3417-5 Placas de</td> Petri de <td>alineación de embriones</td></tr><tr><td></td><td>Genesee Scientific</td><td>32-107G</td><td>Cuidados post-inyección</td></tr><tr><td>Tegaderm/ Transparente apósito de película</td><td>3M Healthcare</td><td>1628</td><td>Alineación de embriones</td></tr><tr><td>Agujas de tungsteno</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>Manipulación de órganos de</td></tr><tr><td>genes Alambre de tungsteno Amazon</td><td></td><td>B08DNT7ZK3</td><td>Manipulación de órganos de genes</td></tr><tr><td>Microinyector digital XenoWorks</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>MPC-200</td><td>Inyección de embriones</td></tr></tbody></table>

técnica de inyección de embriones para la edición de genes en la garrapata de patas negras, ixodes scapularis

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Las garrapatas pueden transmitir varios patógenos virales, bacterianos y protozoarios y, por lo tanto, se consideran vectores de importancia médica y veterinaria. A pesar de la creciente carga de enfermedades transmitidas por garrapatas, la investigación sobre garrapatas se ha quedado atrás de los vectores de enfermedades de insectos debido a los desafíos en la aplicación de herramientas de transformación genética para estudios funcionales a la biología única de las garrapatas. Las intervenciones genéticas han ido ganando atención para reducir las enfermedades transmitidas por mosquitos. Sin embargo, el desarrollo de tales intervenciones requiere una transformación estable de la línea germinal mediante la inyección de embriones. Tal técnica de inyección de embriones es deficiente para los quelicerados, incluidas las garrapatas. Varios factores, como una capa externa de cera gruesa en embriones de garrapatas, corion duro y alta presión intraovalada, son algunos obstáculos que anteriormente impedían el desarrollo del protocolo de inyección de embriones en garrapatas. El presente trabajo ha superado estos obstáculos, y aquí se describe una técnica de inyección de embriones para la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis . Esta técnica se puede utilizar para administrar componentes, como CRISPR / Cas9, para transformaciones estables de la línea germinal.

En este artículo se describe un protocolo exitoso de inyección de embriones para I. scapularis. Las hembras ponedoras de huevos se mantuvieron a alta humedad para evitar la desecación de los huevos parcialmente encerados. La capa de cera se eliminó para inyectar embriones de garrapatas mediante la ablación del órgano del gen (glándula de cera) de la hembra grávida (Figura 1A-E). Se utilizaron agujas de vidrio de aluminosilicato con un cuello más cor...

El presente protocolo describe un método para inyectar embriones de garrapata. La inyección de embriones es la técnica preferida para la manipulación genética para generar líneas transgénicas.

Técnica de inyección de embriones para la edición de genes en la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Este es el primer protocolo de inyección de embriones para una especie de Chelicerata. La capacidad de inyectar embriones de garrapatas abrirá muchas líneas de investigación, en particular, estudios sobre la función del gen de la garrapata y las interacciones de patógenos de garrapatas. Esta técnica permite el trabajo futuro en estudios funcionales de genes de garrapatas y proporciona una base para el control de la población de garrapatas mediante el uso de sistemas de impulsores genéticos.Este método facilitará la comprensión de la interacción entre las garrapatas y los patógenos que albergan a nivel molecular. Esto nos permitirá identificar proteínas que pueden usarse para el desarrollo de vacunas para la enfermedad de Lyme y otros patógenos. Mientras que varias áreas de investigación, como las interacciones de patógenos de garrapatas y la transmisión de patógenos a los huéspedes por garrapata durante la alimentación, se beneficiarán de este trabajo.Preguntas más fundamentales, como cómo evaden las garrapatas la respuesta inmune del huésped, y las diferencias en los mecanismos de reparación del ADN también se pueden entender ahora. Hay algunos aspectos de la biología de las garrapatas que deben entenderse antes de llevar a cabo este procedimiento. La alta presión interna del embrión conduce a estallar cuando se toca con una aguja.Es muy importante preparar los embriones para la inyección. Para comenzar, transfiera a las hembras de cuatro grados centígrados a una incubadora de 27 grados centígrados para el inicio de la puesta de huevos una semana antes de las inyecciones. Después de tres o cuatro días, cuando las hembras comiencen a poner huevos, retire los huevos con un pincel de punta fina mientras prepara a las hembras para la ablación de órganos de Gene.Para vaciar la glándula, coloque la garrapata grávida en un portaobjetos de vidrio bajo un microscopio de manera que las partes de la boca sean visibles tanto en el lado ventral como en el dorsal. Luego perfore cuidadosamente el área detrás de las partes de la boca en el lado dorsal y aplique presión en el lado ventral con fórceps. Coloque el borde de una toallita sin pelusa y retire la cera líquida que sale del sitio de punción.Alternativamente, en lugar de vaciar la glándula por disección, se pueden usar pegamentos como adhesivo tisular alrededor de las partes de la boca de la garrapata. Cuando las hembras comiencen a poner huevos nuevamente, use un pincel fino para recolectar los huevos recién depositados y colóquelos en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros. Agregue aproximadamente 200 microlitros de agua de cloruro de benzalconio al 5% en el tubo que contiene huevos de cero a 18 horas de edad.Agite suavemente los huevos con el pincel durante cinco minutos para evitar que los huevos se depositen en el fondo del tubo, y retire el sobrenadante con una micropipeta, dejando los huevos en el tubo. Agregue aproximadamente 200 microlitros de agua destilada al tubo que contiene huevos. Revuelva con un pincel y retire el agua del tubo de microcentrífuga con una micropipeta.Después de lavar con agua destilada, agregue aproximadamente 200 microlitros de cloruro de sodio al 5% y agite suavemente con un pincel durante cinco minutos. Luego, retire la solución del tubo después de cinco minutos y lave los huevos dos veces con agua destilada. A continuación, agregue aproximadamente 100 microlitros de solución de cloruro de sodio al 1% en el tubo de microcentrífuga que contiene huevos.Primero, adhiera dos portaobjetos de microscopio de vidrio juntos, dejando un espacio de aproximadamente 0,5 centímetros para apoyar la alineación de los huevos con una cinta de doble cara, y aplique un trozo de apósito de película transparente en la cinta de doble cara en el espacio entre los portaobjetos. Luego alinee de ocho a 10 huevos a la vez en la configuración de la diapositiva con un pincel. Luego coloque el portaobjetos con huevos alineados en el escenario de un microscopio compuesto y retire la solución de cloruro de sodio al 1% con un trozo de toallita sin pelusa en la que se almacenan.Conecte la aguja de inyección llena a un microinyector conectado a un micromanipulador. A continuación, abra la aguja frotándola suavemente contra la superficie del huevo utilizando un ajuste de alta presión en el microinyector. Después de abrir la aguja, reduzca la presión del microinyector dependiendo de la abertura de la aguja.Luego inyecte todos los huevos en el portaobjetos en un ángulo de 10 a 15 grados lo más rápido posible, presione rápidamente el pedal e inmediatamente mueva el tobogán a condiciones de alta humedad en una placa de Petri con una toalla de papel húmeda. Después de cinco a seis horas de colocar el portaobjetos que contiene embriones inyectados en una placa de Petri grande forrada con papel de filtro húmedo, agregue una pequeña gota de agua destilada al aderezo de película transparente con embriones inyectados adheridos. Luego, desplaza suavemente los huevos con un pincel.A continuación, transfiera los huevos a una pequeña placa de Petri y sumérjalos en agua destilada. Mantenga los huevos sumergidos en agua, coloque la placa de Petri en una caja de plástico de seis cuartos en una incubadora a 27 grados centígrados a más del 90% de humedad relativa. Cuando la larva comience a eclosionar de los embriones inyectados de 21 a 25 días después de la inyección, verifíquelos diariamente y transfiera las larvas eclosionadas a viales de vidrio con una pantalla en la parte superior.Los resultados demostraron que inyectar los óvulos temprano en la embriogénesis de 12 a 18 horas de edad, y alinear el eje más largo del huevo perpendicular al borde de la diapositiva da como resultado una mayor tasa de supervivencia de los óvulos inyectados. De todos los huevos inyectados, hasta el 8,5% sobrevivieron y la larva eclosionó. Antes de comenzar este procedimiento, es importante recordar los pasos 2.4, eliminación de la cera de la garrapata madre, y los pasos 3.1 a 3.4, ablandamiento del corion del embrión con cloruro de benzalconio y desecación del embrión con soluciones de cloruro de sodio para permitir una inyección exitosa del embrión.Este método fue desarrollado principalmente para la edición de genes de garrapatas, y esto nos permitirá hacer knockouts y knock-ins que nos ayudarán a comprender la función del gen de la garrapata. Esta técnica permitirá el uso de herramientas de edición de genes disponibles para muchos otros organismos que se aplicarán a la investigación de garrapatas. Y esto acelerará la investigación de la biología molecular de las garrapatas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este video, Nijole Jasinskiene demuestra la metodología utilizada para generar transgénicos mosquito Aedes aegypti, que son vectores de la fiebre del dengue. Las técnicas para la correcta preparación de las agujas de microinyección, desecación embriones, y la realización de la microinyección se demuestran.

Microinyección de A. aegypti embriones para obtener los mosquitos transgénicos

En este video, demostramos la entrega de una construcción de impulsor genético en el embrión del mosquito Anopheles gambiae a través de la técnica de microinyección de embriones. Este procedimiento permite la integración de la construcción de ADN entregada, a través de la recombinación homóloga, en las células de la línea germinal para generar una población de mosquitos transformada.

Microinyección de embriones de mosquitos: una técnica para introducir ADN exógeno en la yema del embrión de Anopheles gambiae para generar mutaciones de la línea germinal

La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

La producción de garrapatas sanos criados en el laboratorio es esencial para los estudios sobre la biología de la señal, y de la señal de patógenos interacciones. Aquí se demuestra un protocolo sencillo para la alimentación de la garrapata inmadura que es rentable y menos estresante para ratones.

La cría<em&gt; Ixodes scapularis,</em&gt; La garrapata de patas Negro: La alimentación de los estados inmaduros de ratones

Microinyección de embriones de Nasonia vitripennis es un método esencial para la generación de modificaciones heredables del genoma. Se describe aquí es un procedimiento detallado para la microinyección y el trasplante de embriones de Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente la manipulación del genoma futuro en este organismo.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

Aquí presentamos un protocolo para inyectar huevos de cricket, una técnica que sirve como método fundamental en muchos experimentos en el cricket, incluyendo, pero no limitado a, interferencia de ARN y manipulación genómica.

Inyección de huevos de Gryllus bimaculatus

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

Muchas características de la eusocialidad de los insectos se basan en la comunicación dentro de la colonia y la división del trabajo. La manipulación genética de genes reguladores clave en embriones de hormigas a través de microinyección y mutagénesis mediada por CRISPR proporciona información sobre la naturaleza del comportamiento altruista en insectos eusociales.

Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

El objetivo general de este artículo es describir cómo realizar la inyección intracelular ovo de materiales exógenos en embriones de pollo. Este enfoque es muy útil para estudiar la biología del desarrollo de los embriones de pollo.

En Ovo Inyección intravascular en embriones de pollo

Aprende la técnica de inyección de embriones en garrapatas Ixodes scapularis para edición de genes. Este método permite estudiar la función génica y las interacciones con patógenos, facilitando el desarrollo de vacunas contra enfermedades como la de Lyme.

Técnica de inyección de embriones para la edición de genes en la garrapata de patas negras, Ixodes scapularis

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