Transformación inducida por mediadores fosfolípidos en cultivos tridimensionales

Nuestros cultivos de ensayo 3D modificados se pueden utilizar para investigar el papel de varios componentes en un microambiente de cáncer, lo que lleva a la identificación de nuevos biomarcadores y objetivos farmacológicos. Este método permite estudiar los cambios en el fenotipo celular y la señalización molecular que se asemejan mucho al sistema inmune. También se puede modificar para cumplir con los requisitos específicos de un estudio.

Este método puede ayudar a identificar nuevos biomarcadores que pueden ayudar en la detección temprana del cáncer de mama. Además, los conocimientos moleculares se pueden utilizar para identificar nuevos objetivos farmacológicos. Este método se puede utilizar para estudiar tanto la tumorigénesis como la morfogénesis después de la perturbación del gen o genes que pueden proporcionar información sobre el papel desempeñado por el gen o los genes.

Para comenzar, tripsinizar las células aspirando el medio y lavando con 2 mililitros de PBS. Agregue 900 microlitros de 0.05% de tripsina-EDTA e incube a 37 grados centígrados durante unos 15 minutos o hasta que las células estén completamente tripsinizadas. Prepare un lecho de lrECM en ocho pocillos de un portaobjetos de vidrio de cubierta con cámara cubriendo cada pocillo con 60 microlitros de lrECM.

Colóquelo en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados centígrados durante un máximo de 15 minutos. Para preparar la suspensión celular, agregue 5 mililitros de medio de resuspensión para apagar la actividad de tripsina y gire las células a 112 veces g durante 10 minutos a 25 grados centígrados. Aspirar el medio gastado y volver a suspender las células en 2 mililitros de medio de ensayo.

Mezcle bien la suspensión para asegurar la formación de una suspensión de una sola célula. Cuente las células usando un hemocitómetro y calcule el volumen de suspensión celular necesario para sembrar 6, 000 células en cada pocillo. De acuerdo con el número de pocillos requeridos, diluya la suspensión celular en el medio de superposición.

Agregue 400 microlitros de la suspensión de celda diluida a las camas lrECM preparadas, asegurándose cuidadosamente de no perturbar la cama lrECM. Incubar a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5%. Después de 3 horas, agregue 200 nanomoles de PAF a cada pozo.

Agregue la misma concentración de PAF durante cada cambio de medio y reponga las células con medio fresco cada 4 días. Después de 20 días de cultivo, pipetear cuidadosamente el medio de cada pocillo y lavar los pocillos con 400 microlitros de PBS precalentado. Fijar las estructuras acinares añadiendo 400 microlitros de paraformaldehído al 4% recién preparado e incubando durante 20 min a temperatura ambiente.

Enjuague los pozos una vez con PBS helado y permeabilice con PBS que contiene 0.5% Triton X-100 durante 10 minutos a 4 grados centígrados. Después de 10 minutos, pipetear la solución Triton X-100 con cuidado y enjuagar con 400 microlitros de glicina PBS recién preparada. Añadir 400 microlitros de la solución bloqueante primaria que comprende 10% de suero de cabra en tampón de inmunofluorescencia e incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos.

Retire la solución de bloqueo primaria, agregue 200 microlitros de anticuerpo de bloqueo secundario al 2% preparado en la solución de bloqueo primario y déjelo a temperatura ambiente durante 45 a 60 minutos. Preparar el anticuerpo primario en solución de anticuerpos bloqueadores secundarios al 2% en una dilución 1:100. Retire la solución de bloqueo secundaria, agregue el anticuerpo recién preparado e incube durante la noche a 4 grados centígrados.

Pipetear cuidadosamente la solución de anticuerpos primarios y lavarla tres veces con 400 microlitros de tampón de inmunofluorescencia. A continuación, prepare una dilución 1:200 del anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos en la solución de bloqueo primario e incube los portaobjetos en la solución de anticuerpos secundarios durante 40 a 60 minutos a temperatura ambiente. Enjuague los portaobjetos con 400 microlitros de tampón de inmunofluorescencia durante 20 minutos, seguido de dos lavados con PBS durante 10 minutos cada uno.

Contra-teñir los núcleos con PBS que contienen 0,5 nanogramos por mililitro de tinción nuclear durante 5 a 6 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos tres veces con 400 microlitros de PBS para eliminar el exceso de manchas. Pipetear cuidadosamente todo el PBS y asegurar la eliminación de la solución residual.

Luego agregue una gota de reactivo de montaje en cada pocillo y déjelo reposar a temperatura ambiente durante la noche. Finalmente, tome imágenes de las diapositivas con un aumento de 40x o 63x en un microscopio confocal, tomando secciones Z ópticas de 0.6 milímetros de tamaño de paso. Las imágenes representan los núcleos de células en acinos teñidos con una tinción nuclear.

Aquí se muestra la construcción 3D de los acinos y la imagen de contraste de fase de los acinos MCF10A cultivados en lrECM durante 20 días. La sección central muestra la presencia de un lumen hueco. PAF interrumpe la polaridad e induce cambios similares a EMT en los acinos mamarios MCF10A.

Las células MCF10A se cultivaron como 3D en cultivos superiores en lrECM. Los cultivos fueron tratados con PAF los días 0, 4, 8, 12 y 16. Los cultivos se mantuvieron durante 20 días y luego se inmunotiñeron para alfa6-integrina y tinción nuclear, GM130, un marcador de polaridad apical, y Vimentina, un marcador EMT.

La pila central de los acinos respectivos se ha mostrado aquí. Los datos representativos son para 40-50 acinos de tres experimentos biológicamente independientes. La cama lrECM debe hacerse con cuidado de modo que se distribuya uniformemente sin burbujas de aire.

Además, la suspensión celular debe mezclarse uniformemente y agregarse lentamente para evitar la formación de grumos. Se puede obtener proteínas y ARN de los cultivos 3D que luego se pueden utilizar para investigar las diferentes vías moleculares.