Name: Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprende a preparar y evaluar monocapas epiteliales en dispositivos microfluídicos usando tinción con faloidina y microscopía confocal. Este método permite estudiar respuestas celulares en condiciones fisiológicas dinámicas in vitro.

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Los autores reconocen a Alan Shepardson por diseñar el patrón de corte para el adhesivo 3M y la lámina de mylar utilizados en la construcción del canal microfluídico y por probar la velocidad de flujo de medios de cultivo celular y la programación de la bomba de jeringa. Los fondos fueron proporcionados por NIH R01 HL0142702, NSF CBET 1706801 y Newcomb-Tulane College Dean's Grant.

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El protocolo presentado describe el cultivo, la fijación de reticulación, la tinción, la permeabilización y la visualización microscópica confocal de células epiteliales pulmonares humanas NCI-H441 en el entorno dinámico de una matriz de flujo microfluídico de un solo canal, así como en el entorno estático de un vidrio de cubierta tradicional de ocho pocillos. Con cualquier protocolo de cultivo celular microfluídico, las condiciones de flujo de los medios de cultivo celular son de suma importancia, ya que el flujo de alt...

El síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es una afección aguda que surge del insulto y la propagación de la lesión en el parénquima pulmonar, que resulta en edema pulmonar de los alvéolos, intercambio gaseoso inadecuado e hipoxemia posterior1. Esto inicia un ciclo de liberación de citoquinas proinflamatorias, reclutamiento de neutrófilos, liberación de mediadores tóxicos y daño tisular, que a su vez incurre en una respuesta inflamatoria adicional2. Además, el surfactante pulmonar, que estabiliza las vías respiratorias y previene el daño causado por el reclutamiento/desreclutamiento repetitivo (R/D), puede ser inactivado o disfuncional por los procesos químicos que ocurren durante el SDRA, lo que resulta en más estrés y lesiones en el parénquima circundante3. Si se sufre un daño suficiente, puede ser necesaria la ventilación mecánica para asegurar una oxigenación sistémica adecuada4. Sin embargo, la ventilación mecánica impone sus propios desafíos y traumas, incluyendo la posibilidad de lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI), caracterizada como lesión del parénquima pulmonar causada por las tensiones mecánicas impuestas durante el sobreinflado (volutrauma) y/o la R/D de la interfaz aire-líquido en la vía aérea ocluida por líquido (atelectrauma)5. El gradiente de presión experimentado por las células epiteliales expuestas a una interfaz aire-líquido (como en un bronquiolo ocluido con líquido) en el modelo de atelectrauma puede resultar en una respuesta obstructiva originada por permeabilidad (POOR), lo que lleva a un ciclo virtuoso de lesión POOR-get-POORer 6,7,8.
La experimentación in vitro puede proporcionar información a microescala sobre estos fenómenos, pero los estudios actuales en entornos de canales microfluídicos con dimensiones fisiológicamente relevantes enfrentan varios desafíos9. Por un lado, la optimización de las condiciones de cultivo celular plantea una barrera significativa para la entrada para la investigación de cultivos celulares en entornos microfluídicos, ya que existe una intersección estrecha dentro de la cual los parámetros de flujo del medio, la duración del cultivo y otras condiciones de cultivo permiten la formación óptima de la capa celular. Esto incluye las limitaciones de difusión impuestas por la naturaleza impermeable al oxígeno del recinto del canal de cultivo microfluídico. Esto requiere una cuidadosa consideración de los parámetros de flujo del medio, ya que los bajos caudales pueden privar a las células de oxígeno, especialmente a las más alejadas de la entrada; Por otro lado, los altos caudales pueden empujar a las células fuera del canal de cultivo o dar lugar a un desarrollo inadecuado o desigual de la capa. Las limitaciones de difusión pueden abordarse mediante el uso de materiales permeables al oxígeno como el polidimetilsiloxano (PDMS) en un aparato de cultivo de interfaz aire-líquido (ALI); sin embargo, muchos canales de cultivo microfluídicos convencionales, como los del sistema de detección de impedancia de sustrato de celda eléctrica (ECIS), son inherentemente impermeables al oxígeno, dada la naturaleza del recinto fabricado10. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una técnica para analizar las capas celulares cultivadas en un recinto impermeable al oxígeno.
Al comparar la viabilidad de las condiciones de cultivo, las observaciones de características específicas de la capa, como la presencia de una monocapa, la topología de la superficie, la confluencia y la uniformidad del espesor de la capa, son necesarias para determinar si la capa celular producida por un conjunto particular de condiciones de cultivo cumple con las especificaciones deseadas y son realmente relevantes para el diseño experimental. Se puede realizar una evaluación limitada mediante métodos como ECIS, que utiliza mediciones del potencial eléctrico (voltaje) creado por la resistencia a la corriente alterna de alta frecuencia (CA) (impedancia) impuesta por membranas eléctricamente aislantes de células cultivadas en electrodos de oro dentro de la matriz de flujo. Al modular la frecuencia de CA aplicada a las células, las propiedades celulares específicas dependientes de la frecuencia de las células y las capas celulares, como la fuerza de adherencia superficial, la formación de la unión estrecha y la proliferación o confluencia celular, pueden ser dirigidas y examinadas11. Sin embargo, estas formas indirectas de mediciones son algo difíciles de interpretar al inicio de un experimento, y pueden no cuantificar todos los aspectos relevantes de la capa celular. La simple observación de la capa celular bajo un microscopio de contraste de fase puede revelar la naturaleza de ciertas cualidades como la confluencia; sin embargo, muchas características relevantes, como la presencia de una monocapa y la uniformidad del espesor de la capa, requieren una evaluación tridimensional (3D) que no es posible con imágenes microscópicas fluorescentes, de campo claro, contraste de fase o fluorescentes12.
El objetivo de este estudio fue desarrollar una técnica de tinción de actina filamentosa para permitir la verificación basada en imágenes de una monocapa y la evaluación de la uniformidad de la capa celular utilizando microscopía de barrido láser confocal (CLSM). La actina filamentosa (F-actina) se consideró un objetivo apropiado para el conjugado fluoróforo, debido en parte a la forma en que la actina F sigue estrechamente la membrana celular, permitiendo una aproximación visual de todo el volumen celular13. Otro beneficio importante de dirigirse a la actina F es la manera en que la tinción de la actina F dilucida visualmente las interrupciones o alteraciones citoesqueléticas impuestas por las tensiones y tensiones experimentadas por las células. La fijación de reticulación con formaldehído libre de metanol fue utilizada para preservar la morfología de las células y la capa celular, ya que los fijadores deshidratantes como el metanol tienden a aplanar las células, distorsionando groseramente la capa celular y alterando sus propiedades14,15.
Para determinar la capacidad de la técnica de evaluación de capas para mitigar estos desafíos, las células se cultivaron en cámaras de cultivo tradicionales de ocho pocillos, así como en canales microfluídicos para evaluar las diferencias, si las hubiera, en las capas celulares que se produjeron. Para los pozos de cultivo fijos, se utilizaron unidades de vidrio de cubierta con cámara de ocho pocillos. Para el cultivo microfluídico, las matrices de flujo (longitud del canal 50 mm, ancho 5 mm, profundidad 0,6 mm) fueron optimizadas para cultivar células epiteliales pulmonares humanas inmortalizadas (NCI-H441) en un ambiente con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales presentes en la zona respiratoria del pulmón humano16. Si bien este protocolo se desarrolló teniendo en cuenta el entorno de cultivo de las matrices de flujo ECIS, puede aplicarse a cualquier entorno de cultivo dinámico impermeable al oxígeno para el cual es necesaria la evaluación de las características de la capa celular cultivada o las condiciones de cultivo.

<table><tbody><tr><td>A1R HD25 Sistema de microscopio confocal</td><td>Nikon</td><td>A1R HD25</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/microscopios-confocales/a1hd25-a1rhd25/especificaciones</td></tr><tr><td>ActinGreen 488 ReadyProbes Reactivo (AlexaFluor 488 faloidina)</td><td>Invitrogen</td><td>R37110</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37110</td></tr><tr><td>Cinta de transferencia adhesiva de doble línearojo</td><td>3M</td><td>468MP</td><td>https://gizmodorks.com/3m-468mp-adhesive-transfer-tape-sheet-5-pack/</td></tr> <tr><td>Air-Tite&nbsp; HSW Jeringas Desechables Soft-Ject</td><td>Air-Tite RL5</td><td>14-817-53</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/air-tite-hsw-soft-ject-disposable-syringes-6/1481753#?keyword=syringe%20leur%20locking%205ml BAISDY 4 mil (0,1 mm) Hoja de Mylar de Espesor</td><td>BAISDY</td><td>AS022</td><td>https://www.amazon.ca/Stencil-Perfect-Silhouette-Machines-BAISDY/dp/B07RJJ9BNC</td></tr><tr><td>Branson Ultrasonics&nbsp; Baño de limpieza ultrasónica de la serie M Branson</td><td>Ultrasonics</td><td>15-336-100</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/m-series-ultrasonic-cleaning-bath/15336100</td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Fibronectina,</td><td>Humano Fisher Scientific</td><td>CB-40008</td><td></td></tr><tr><td>https://www.fishersci.com/shop/products/corning-fibronectin-human-3/CB40008?keyword=true DPBS, calcio, magnesio</td><td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133?SID=srch-srp-14040133 ECIS Cultureware Mazas de electrodos desechables 8 x 10 ECIS Flow Array</td><td>BioPhysics Applied BioPhysics</td><td>1F8x10E PC</td><td>https://www.biophysics.com/cultureware.php#1F8x10E</td></tr><tr><td>Gabinete esterilizador UV de Enterprise Technology Solutions, blanco</td><td>Soluciones de tecnología empresarial</td><td>50-211-1163</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/uv-sterilizer-cabinet-white/502111163</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/26140079 Finnpipette F2 Volumen variable Pipetas</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4642090</td></tr><tr><td>Fisherbrand 50mL Easy Reader Tubos de centrífuga de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-21</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-higher-speed-easy-reader-plastic-centrifuge-tubes-8/p-193269</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Cubreobjetos: Rectángulos (#1.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-GP</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/cover-glasses-rectangles-promo-22/12544GP#coverglass</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Jeringas estériles de un solo uso</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955458</td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11875093</td></tr><tr><td>Image-iT Solución fijadora (4% de formaldehído, sin metanol)</td><td>Invitrogen</td><td>FB002</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/FB002</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fiji ImageJ</td><td>ImageJ Fiji https://imagej.net/downloads</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión F 30 cc</td><td>Nikon</td><td>MXA22168</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/productos/accesorios/aceite-de-inmersión/especificaciones</td></tr><tr><td>Alcance de gran capacidad CO2&nbsp; Incubadora, 821 L, acero inoxidable pulido</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/3950</td></tr><tr><td>Laxco LMC-3000 Series Sistema de Microscopio Compuesto de Campo Claro</td><td>Laxco</td><td>LMC3BF1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/lmc-3000-series-brightfield-compound-microscope-system-8/LMC3BF1</td></tr><tr><td>Masterflex Fitting, Nylon, Recto, Macho Luer Lock a Adaptador de Lengüeta de Manguera, 1/16" de diámetro interior; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>ZY-45505-31</td><td>https://www.masterflex.com/i/masterflex-fitting-nylon-straight-male-luer-lock-to-hose-barb-adapters-1-16-id-25-pk/4550531?PubID=ZY&persist=true&ip=no&amp; gclid=Cj0KCQiA3rKQBhCNARIsAC UEW_Zb5yXy1em6bGs0a9KFOk5k pdlkHCvAEslHumdqcnlwSN0MdR0 udmwaAuDHEALw_wcB</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>0016</td><td>https://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=56547</td></tr><tr><td>Jeringas desechables de plástico National Target</td><td>Thermo Scientific</td><td>03-377-24</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/national-target-all-plastic-disposable-syringes/0337724#tab8</td></tr><tr><td>NCI-H441 Colección de</td><td>cultivos de tipo americano (ATCC)</td> <td>HTB-17</td><td>https://www.atcc.org/products/htb-174</td> 4</tr><tr><td>NE-1600 Bomba de jeringa programable de seis canales</td><td>Sistemas de bomba de la nueva era</td><td>NE-1600</td><td>https://www.syringepump.com/NE-16001800.php</td></tr><tr><td>NIS Elements AR</td><td>Nikon</td><td>NIS Elements AR</td><td>https://www.microscope.healthcare.nikon. com/products/software/nis-elements/nis-elements-advanced-research</td></tr><tr><td>Reactivo NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605?SID=srch-srp-R37605</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Cubreobjetos con cámara</td><td>Thermo Scientific</td><td>155411</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/155361</td></tr><tr><td>Parafilm M Película de envoltura</td><td>Fisher Scientific</td><td>S37441</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/S37441</td></tr><tr><td>PendoTech llave de paso de 3 vías, polisulfona, macho/ Entrada Luer Hembra x Rama Luer Hembra</td><td>PendoTech</td><td>ZY-19406-49</td><td>https://www.masterflex.com/i/pendotech-3-way-stopcock-polysulfone-male-female-luer-inlet-x-female-luer-branch/1940649</td></tr><tr><td>Solución tamponada de fosfato (PBS), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023</td></tr><tr><td>Poly-D-Lisine</td><td>Gibco</td><td>A3890401</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A3890401#/A3890401</td></tr><tr><td>Reynolds Papel de aluminio</td><td>Reynolds</td><td>458742928317</td><td></td></tr><tr><td>https://www.amazon.com/Reynolds-Wrap-Aluminum-Foil-Square/dp/B00UNT0Y2M Saponina</td><td>Millipore Sigma (Sigma Aldrich)</td><td>47036</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/47036</td></tr><tr><td>SlowFade Glass Soft-set Antidecoloración Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>S36917-5X2ML</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/S36917-5X2ML</td></tr><tr><td>Thermo Scientific 1300 Series Clase II, Tipo A2 Paquete de cabina de seguridad biológica</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-100-752PM</td><td>Tubo</td></tr> de <tr><td>transferencia https://www.fishersci.com/shop/products/1300-series-class-ii-type-a2-biological-safety-cabinet-package-promo/p-9049003#?keyword=biosafety%20hood Tygon, silicona curada con platino BioPharm, 1/16" ID x 1/8" de diámetro exterior; Cortador</td><td>de cola</td> de 50 pies <td>EW-95702-01</td><td>https://www.coleparmer.com/i/tygon-transfer-tubing-biopharm-platinum-cured-silicone-1-16-id-x-1-8-od-50-ft/9570201?searchterm=95702-01</td></tr></tbody></table>

preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico

Preparation and Structural Evaluation of Epithelial Cell Monolayers in a Physiologically Sized Microfluidic Culture Device

La experimentación microfluídica in vitro tiene un gran potencial para revelar muchos conocimientos sobre los fenómenos microfisiológicos que ocurren en afecciones como el síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) y la lesión pulmonar inducida por el ventilador (VILI). Sin embargo, los estudios en canales microfluídicos con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales del pulmón humano se enfrentan actualmente a varios desafíos, especialmente debido a las dificultades para establecer condiciones apropiadas de cultivo celular, incluidas las tasas de flujo de medios, dentro de un entorno de cultivo dado. El protocolo presentado describe un enfoque basado en imágenes para evaluar la estructura de las células epiteliales pulmonares humanas NCI-H441 cultivadas en un canal microfluídico impermeable al oxígeno con dimensiones fisiológicamente relevantes para los bronquiolos terminales del pulmón humano. Usando tinción de actina filamentosa basada en faloidina, las estructuras citoesqueléticas de las células se revelan mediante microscopía de barrido láser confocal, lo que permite la visualización de células individuales y en capas. La cuantificación posterior determina si las condiciones de cultivo celular empleadas están produciendo monocapas uniformes adecuadas para una mayor experimentación. El protocolo describe el cultivo celular y los métodos de evaluación de capas en canales microfluídicos y entornos tradicionales de pozos fijos. Esto incluye la construcción de canales, el cultivo celular y las condiciones requeridas, la fijación, la permeabilización y la tinción, las imágenes microscópicas confocales, el procesamiento de imágenes y el análisis de datos.

El método presentado permite la visualización de capas celulares epiteliales cultivadas en canales de cultivo microfluídico y utiliza una demostración en entornos tradicionales de cultivo celular de pozo fijo como validación. Las imágenes adquiridas existirán en un espectro de calidad, intensidad de señal y especificidad de objetivo celular. Las imágenes exitosas demostrarán un alto contraste, lo que permitirá el análisis de imágenes y la cuantificación de datos para su posterior evaluación estadística. Las imágenes fall...

El protocolo presentado describe el desarrollo y uso de una técnica de tinción de actina filamentosa basada en faloidina con microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para visualizar la estructura de la capa celular adherente en canales de cultivo dinámico microfluídico y cámaras tradicionales de cultivo estático de pozo fijo. Este enfoque ayuda a evaluar la confluencia de la capa celular, la formación de monocapa y la uniformidad del espesor de la capa.

Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico

In vitro microfluidic experimentation holds great potential to reveal many insights into the microphysiological phenomena occurring in conditions such as ...

Este protocolo sirve para reducir una barrera de entrada para la experimentación de cultivos celulares y permite a los investigadores evaluar y caracterizar monocapas celulares adherentes cultivadas en entornos microfluídicos dinámicos. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación cualitativa y cuantitativa de las características de la monocapa celular para servir como base para una mayor experimentación dependiente de la monocapa. Este método permite la recapitulación de un epitelio alveolar in vitro, lo que permite explorar las respuestas dinámicas durante el síndrome de dificultad respiratoria aguda, SDRA, así como la lesión pulmonar inducida por el ventilador, VILI.Para comenzar, obtenga una matriz de flujo de un solo canal. Limpie la superficie del vidrio de la cubierta en un baño ultrasónico. Sumerja el vidrio de la cubierta en poli-d-lisina a temperatura ambiente durante cinco minutos.Luego séquelo a 60 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, coloque adhesivos de doble cara en espaciadores Mylar. Corte con láser como se describe en el manuscrito al vidrio de la cubierta y asegúrese de que los recortes del canal estén alineados con precisión.Fije un vidrio de cubierta rectangular a la tira adhesiva más inferior. Use los papeles adhesivos pelados para cubrir las porciones de adhesivo aún expuestas. Una vez completado el montaje, aplique una presión firme e igual a la construcción.Con una jeringa llena de agua desionizada, enjuague el canal. Esterilice la carcasa del canal en un esterilizador ultravioleta durante 30 minutos. Usando una técnica estéril, tratar el canal con solución de fibronectina humana preparada en PBS e incubar durante al menos 30 minutos a 37 grados centígrados.En la campana de flujo laminar estéril, prepare la suspensión celular NCI H441 utilizando medio RPMI 1640 con 10% FBS. Use 0.25 mililitros de esta suspensión celular para llenar el canal y una porción de los puertos. Usando microscopía de campo claro, verifique que las células se hayan distribuido uniformemente dentro de los canales.Agregue el depósito de medios y la llave de paso al canal. Comience a cultivar el canal a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. Use una bomba de jeringa programable para extraer los medios gastados del canal y los medios frescos en el canal desde un depósito de medios estériles conectado a la entrada del canal.En una campana extractora de humos químicos, diluya una solución de formaldehído al 4% en DPBS para crear una solución al 1% y guárdela en un tubo debidamente etiquetado. Prepare la solución de formaldehído al 2% de manera similar. Transfiera las soluciones de formaldehído a jeringas de cinco mililitros debidamente etiquetadas.Extraiga 20 mililitros de DPBS en una jeringa separada de 20 mililitros que se utilizará para los pasos de lavado. A continuación, retire el canal microfluídico del aparato de cultivo y asegúrelo en la campana de humos químicos. Para ensamblar el aparato de fijación y tinción, conecte un segmento de tubo de transferencia al puerto lateral de una llave de paso de tres vías a través de un adaptador de púa de manguera de bloqueo Luer macho.A continuación, conecte la llave de paso al puerto de entrada de la matriz de flujo. Conecte otro segmento de tubo de transferencia al puerto de salida de la llave de paso existente utilizando el mismo tipo de adaptador de púa de manguera. Finalmente, asegure los extremos libres de ambos tubos de transferencia ahora designados como líneas de desechos en un contenedor de desechos apropiado para riesgos químicos y biológicos.Asegúrese de que la llave de paso esté bloqueando el puerto de entrada de la matriz de flujo y enjuague la línea de residuos con DPBS. Luego gire la llave de paso para bloquear la línea de desechos y lave lentamente las celdas con dos mililitros de DPBS. Empuje lentamente dos mililitros de fijador al 1% a través del canal.Déjalo reposar durante cinco minutos y repite con un 2% de fijador. Luego lave las células tres veces con DPBS fresco como se demostró anteriormente. Prepare la solución de saponina al 0,1% como se describe en el manuscrito.Extraiga DPBS adicionales en una jeringa de 20 mililitros para usar en los pasos de lavado. Cubra el tubo con papel de aluminio. Agregue el reactivo filamentoso de faloidina para tinción de actina y un reactivo Hoechst para teñir núcleos a la solución de saponina al 0,1%.Luego transfiera la solución a una jeringa cubierta de aluminio. Enjuague la línea de residuos con una pequeña cantidad de solución permeabilizante y de tinción. Luego introduzca dos mililitros de la solución en el canal microfluídico.Cubra el canal con papel de aluminio para bloquear la luz. Después de 30 minutos, enjuague la solución permeabilizante con dos mililitros de DPBS dos veces durante cinco minutos cada una antes de secar suavemente el canal. Usando una micropipeta, introduzca una cantidad mínima de un montante anti-decoloración suave en el canal microfluídico asegurándose de cubrir completamente la superficie inferior.Luego selle el extremo del canal. Usando un microscopio de campo claro, verifique rápidamente la integridad de la capa celular antes de almacenar el canal en un recipiente para protegerlo de la luz. Pruebe las ubicaciones de imágenes tomando escaneos de referencia y pilas z hasta que se hayan cumplido los parámetros y condiciones de imagen deseados.Usando la placa base de la matriz de flujo como referencia, construya pilas z en varias ubicaciones a lo largo de la longitud del canal. Finalmente, analice datos transversales, datos de mapas de profundidad y cualquier otra característica relevante para evaluar las propiedades de la capa celular. El uso exitoso de la técnica se demuestra en el entorno de cultivo dinámico microfluídico a través de la adquisición de imágenes al menos a un centímetro de distancia de la entrada y la salida.En un experimento representativo de duración del cultivo, se observó una producción exitosa de monocapa cuando las células se cultivaron durante 24 horas. Sin embargo, cuando se cultivó durante 48 horas, se observó formación multicapa indeseable. Los datos recopilados de cada una de las cinco ubicaciones de imágenes de canales microfluídicos también revelan la relación entre el aumento de la duración del cultivo y el aumento del área de la sección transversal, lo que sugiere que la formación desigual de capas o el crecimiento excesivo ocurren dentro de las 48 horas posteriores al cultivo.Se obtuvo el mapa de profundidad de una ubicación central dentro del canal microfluídico cultivado durante 24 horas, que es útil para la evaluación cualitativa de las características de la capa. Los tres aspectos más cruciales de este protocolo son la construcción adecuada del canal, las condiciones precisas de cultivo y flujo de medios, y el uso cuidadoso del aparato de fijación y tinción. Después de este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos en paralelo para validar la viabilidad experimental de las monocapas celulares producidas, como la detección de impedancia celular y sustrato eléctrico, ECIS, o la resistencia eléctrica transepitelial, TEER.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Se describe un protocolo para la fabricación de dispositivos de microfluidos que puede permitir la captura de células y la cultura. En este enfoque micro modelado como ranuras dentro de los canales de microfluidos se utilizan para crear las regiones de baja tensión de corte dentro de la celda que se puede acoplar.

Un dispositivo de microfluidos con los patrones de Surco para el estudio del comportamiento celular

Este protocolo describe un co-cultivo de microfluidos modelo de cultivo simultáneo y localizada de células epiteliales y bacterias. Este modelo se puede utilizar para investigar el papel de las diferentes señales moleculares solubles en la patogénesis, así como la pantalla de la supuesta eficacia de cepas de bacterias probióticas.

Microfluidos Co-cultivo de células epiteliales y bacterias para la Investigación de la señal mediada Soluble Interacciones

En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología, y cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en la cultura de dos dimensiones y tres dimensiones paradigmas.

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

Este manuscrito describe una técnica basada en litografía suave para diseñar matrices uniformes de tres dimensiones (3D) los tejidos epiteliales de la geometría definida rodeadas por matriz extracelular. Este método es susceptible de una amplia variedad de tipos de células y contextos experimentales y permite la selección de alto rendimiento de repeticiones idénticas.

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

Los sistemas celulares tridimensionales (3D) son modelos relevantes para investigar la organogénesis. Se propone un método basado en hidrogeles para la producción de quistes biliares y su caracterización. Este protocolo desentraña las barreras de la caracterización 3D, con un método sencillo y confiable para evaluar la eficiencia de la formación de quistes, los tamaños y para probar su funcionalidad.

Generación y caracterización cuantitativa de quistes epiteliales biliares funcionales y polarizados

Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.

Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

El presente protocolo describe las capacidades y las modalidades esenciales de cultivo del Open-Top Organ-Chip para el establecimiento exitoso y la maduración de cultivos de órgano en chip de espesor completo de tejidos primarios (piel, alvéolo, vías respiratorias e intestino), brindando la oportunidad de investigar diferentes aspectos funcionales de la interfaz epitelial/mesenquimal y nicho vascular humana in vitro.

Reconstitución de la citoarquitectura y la función de los tejidos epiteliales humanos en un chip de órgano abierto

Este informe proporciona protocolos para el ensamblaje, el cultivo celular y los ensayos en la plataforma μSiM para la construcción de modelos de barrera hematoencefálica.

Uso de la plataforma de tejido de barrera MicroSiM (μSiM) para modelar la barrera hematoencefálica

Este protocolo describe una plataforma de cultivo celular basada en membranas reconfigurable que integra el formato de pozo abierto con capacidades de flujo de fluidos. Esta plataforma es compatible con los protocolos estándar y permite transiciones reversibles entre los modos de cultivo microfluídico y de pozo abierto, adaptándose a las necesidades de los laboratorios de ingeniería y biociencias.

Transformación de modelos tisulares de barrera estática en sistemas microfisiológicos dinámicos

Aquí, demostramos cómo las células epiteliales cultivadas con fibroblastos en el sistema de dos capas basado en membranas nanofibrosas pueden adherirse y crecer de manera estable en la membrana.

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

Aquí, presentamos un protocolo para fabricar un dispositivo microfluídico único de dos capas para estudiar la regulación electromecánica de la homeostasis del tejido epitelial. El dispositivo aplica corrientes eléctricas fisiológicas estáticas perpendiculares al plano tisular, lo que afecta la adhesión, proliferación y extrusión célula-célula. Las imágenes de células vivas y las mediciones de estrés mecánico revelan mecanismos de estos procesos.

Revelando el control electromecánico de la homeostasis tisular mediante un dispositivo microfluídico de dos capas

Aprende a preparar y evaluar monocapas epiteliales en dispositivos microfluídicos usando tinción con faloidina y microscopía confocal. Este método permite estudiar respuestas celulares en condiciones fisiológicas dinámicas in vitro.

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Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico

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