Microdisección láser industrializada guiada por inteligencia artificial para el análisis proteómico a microescala del microambiente tumoral

Este protocolo integra el análisis de imágenes impulsado por IA para la segmentación de tejidos. Con histología la cosecha selectiva por microdisección láser y nos acerca a la realidad de la Patomía. La predefinición del ROI de los tejidos mediante IA, limita el tiempo de permanencia de los portaobjetos de tejidos a temperatura ambiente, reduce el esfuerzo de mano de obra para realizar estas cosechas y disminuye la variabilidad del operador.

Esta técnica es ampliamente aplicable a cualquier enfermedad o investigación basada en patologías que implique la recolección o el enriquecimiento de poblaciones celulares específicas a partir de muestras de tejido. Este método es sencillo para usuarios con conocimientos básicos de histopatología y experiencia en LMD. La clave es asegurarse de cortar el calibrador limpio para las celdas y entrenar bien el clasificador.

Para empezar, asegúrese de que la corredera esté completamente seca antes de cortar los fiduciales de calibración de referencia. Abra el software Laser Microdissection y abra el archivo sld de puntos de calibración predeterminado en la opción importar formas. Cargue la corredera con el pañuelo hacia abajo y el lado de la etiqueta más cerca del operador.

En el soporte deslizante de la etapa de microdisección láser, seleccione la opción de enfoque automático antes del corte. Usando el microscopio láser y el archivo de trineo de puntos de calibración predeterminado, corte los fiduciales de calibración en la membrana PEN. Solo para colecciones enriquecidas con microdisección láser, abra el software de análisis de imágenes.

Seleccione las imágenes abiertas y, en la ventana emergente, seleccione el archivo de imagen dot svs generado al escanear la diapositiva. Desplácese hasta la pestaña anotaciones, seleccione y utilice la herramienta de anotación de rectángulo para dibujar un cuadro alrededor del tejido. Seleccione la anotación del cuadro y haga clic derecho en la imagen.

Seleccione el menú desplegable avanzado y, a continuación, haga clic en la opción de partición. Establezca el tamaño y el espacio del mosaico entre 500 y 40 respectivamente, y seleccione Aceptar para generar los mosaicos. Seleccione y elimine la anotación del cuadro perimetral utilizada para generar los iconos.

Seleccione el menú desplegable Acciones de capa y, a continuación, haga clic en exportar para guardar las anotaciones en mosaico como un archivo de anotación de puntos. Coloque una copia guardada del algoritmo dapa de Python, desarrollado para fusionar las capas de anotación clasificadas de IA en la misma carpeta que el archivo de anotaciones en mosaico. Copie el nombre del archivo de anotación en mosaico.

Abra el programa Python utilizando el entorno de desarrollo integrado inactivo y pegue el nombre del archivo de anotación en mosaico entre las citas en la parte inferior del programa. Seleccione el menú desplegable Ejecutar y, a continuación, haga clic en Ejecutar módulo. Espere a que se generen algunos archivos que tendrán todas las anotaciones en mosaico fusionadas en una sola capa.

Abra el software de análisis de imágenes y navegue hasta la pestaña de anotaciones. Seleccione el menú desplegable Acciones de capa y, a continuación, haga clic en eliminar todas las capas para eliminar todas las anotaciones de la imagen. Seleccione el menú desplegable Acciones de capa y, a continuación, haga clic en Importar archivo de anotación local.

En la ventana emergente, seleccione el archivo de anotación de puntos combinado generado por el script. Asegúrese de que todos los iconos importados estén bajo la misma capa de anotación. Desde la pestaña clasificador, siga las instrucciones del fabricante para resaltar las áreas representativas del tumor, el estroma y los ROI de fondo de la diapositiva de vidrio en blanco.

Antes de ejecutar el clasificador, haga clic en opciones avanzadas del clasificador, seleccione la capa de anotación deseada marcando la casilla ROI o las casillas de la ficha anotaciones. Utilice la opción de capa de anotación del menú acciones del clasificador para ejecutar el clasificador. Una vez finalizado el análisis del clasificador, vaya a la pestaña anotaciones y seleccione la capa de anotación generada a partir del análisis.

Seleccione el menú desplegable Acciones de capa y, a continuación, haga clic en Eliminar todas las capas excepto las actuales para eliminar todas las demás capas de anotación de la imagen. A continuación, seleccione el menú desplegable acciones de capa y, a continuación, haga clic en exportar para guardar las anotaciones como un archivo de anotación de puntos. Cree una carpeta para la sesión o el proyecto y guarde el archivo de anotación de puntos dentro de una subcarpeta.

Etiquetado con el identificador único de la diapositiva. Desplácese hasta la pestaña De anotaciones, seleccione el menú desplegable Acciones de capa y, a continuación, haga clic en Eliminar todas las capas para eliminar todas las anotaciones de la imagen. Seleccione la herramienta de lápiz y dibuje una línea corta de cada fiducial de calibración.

Dibuje líneas de las marcas en el orden siguiente. Arriba a la izquierda, arriba a la derecha, abajo a la derecha. Seleccione el menú desplegable acciones de capa y, a continuación, haga clic en exportar para guardar las anotaciones en mosaico como un archivo de anotación de do.

Agregue calib de subrayado al nombre de archivo y coloque el archivo en la subcarpeta que contiene las coordenadas de las formas en mosaico. Copie la dirección del proyecto principal. Abra el malliador de script generador de importación XML utilizando el entorno de desarrollo integrado inactivo y luego pegue la dirección de la carpeta del proyecto entre las comillas en la parte inferior del script.

Seleccione el menú desplegable Ejecutar y, a continuación, haga clic en Ejecutar módulo para ejecutar el script. Cargue el portaobjetos de membrana marcado con el tejido hacia abajo y el lado de la etiqueta más cerca del operador en el soporte de la diapositiva en la etapa del microscopio láser. Seleccione importar formas en el menú desplegable archivo.

Seleccione el archivo de importación XML, LMD de puntos generado para la diapositiva. Seleccione no en la ventana emergente para evitar cargar puntos de referencia desde el archivo, y no en la segunda ventana emergente para evitar el uso de puntos de referencia almacenados previamente para la calibración. Siga las indicaciones de la aplicación de microdisección láser y alinee la cruz de calibración con cada uno de los tres fiduciales de calibración en la diapositiva.

Busque los fiduciales de calibración que aparecen en la parte superior izquierda, superior derecha e inferior derecha de la imagen de la diapositiva. En el software de análisis de imágenes que corresponderá a los puntos de referencia de la diapositiva de microdisección láser invertida en la etapa del microscopio. Cambie entre el uso de la lente subjetiva 5x para localizar y la lente subjetiva 63x para alinear cada fiducial de calibración.

Seleccione no en la ventana emergente para evitar guardar los puntos de referencia en el archivo, y está bien en la segunda ventana emergente para confirmar que la diapositiva está insertada. Mueva la lente subjetiva 5x a su posición y seleccione sí en la ventana emergente para usar la ampliación real. Una vez que aparezcan las formas importadas, enfoca la cámara en el tejido.

Resalte y seleccione todas las formas en la ventana de lista de formas. Arrástrelos en su lugar utilizando una o dos anotaciones dentro del campo de visión como referencias y alinee el eje z vertical para cortar con el láser. Cargue los tubos en un soporte de tubo universal diseñado para microtubos PCT.

Revise las formas importadas y asígnelas a la posición de tubo adecuada para la recolección. Presione start cut para iniciar el láser. Descargue y cierre el tubo de muestra con tejidos LMD y colóquelo en hielo seco.

Después del termociclado y el centrifugado, el LMD recolectó muestras de tejido, eliminó y desecha las microcaps de los microtubos PCT. Agregue tripsina, agregue una proporción de un microgramo por cada 30 milímetros de tejido cuadrado. E inserte un micro mortero en el micro tubo usando la herramienta microcap.

Transfiera los microtubos a un cartucho de ciclo de barril y ensamble el cartucho completo. Coloque el cartucho en la cámara de presión del ciclo del cañón y asegure la tapa. Ciclo del barril a 45, 000 PSI durante 50 segundos y presión atmosférica durante 10 segundos a 50 grados Celsius durante 60 ciclos.

Para el análisis LC-MS MS, cargue los viales del muestreador automático en las posiciones apropiadas en el muestreador automático de cromatografía líquida. Cierre el muestreador automático y analice las fracciones individuales con un método apropiado de gradiente y espectrometría de masas. Agrupación jerárquica no supervisada utilizando las 100 proteínas más variables.

Resultó en la segregación de los tipos de cáncer de ovario seroso de alto grado y carcinoma de células claras de ovario de las muestras tumorales completas y enriquecidas con microdisección con láser. Por el contrario, la microdisección con láser enriqueció muestras de estroma tanto del cáncer de ovario seroso de alto grado como del carcinoma de células claras de ovario. Agrupados e independientemente del tumor enriquecido con microdisección láser y muestras tumorales completas.

Entre las 5,971 proteínas cuantificadas, 215 se alteraron significativamente entre colecciones completas de tumores de cáncer de ovario seroso de alto grado y muestras de carcinoma de células claras de ovario. De las 76 proteínas de firma cuantificadas por Hughes en absoluto, 57 fueron cocuantificadas en este conjunto de datos y estaban altamente correlacionadas El entrenamiento del clasificador es la parte más desafiante. Siguiendo las instrucciones del software Indica Lab y refinando el clasificador reproducimos los resultados más precisos.

Todo lo demás está estandarizado. El tejido cosechado utilizando este flujo de trabajo de LMD impulsado por IA es compatible con una variedad de aplicaciones analíticas posteriores, incluidas las proteómicas basadas en espectrometría de masas descritas aquí o análisis genomi, transcriptómicos u otros análisis ómicos.