Name: Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Aprende métodos in ovo y ex ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar usando embriones de pollo. Estas técnicas permiten analizar la regeneración de células ciliadas y evaluar efectos ototóxicos de fármacos.

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Agradecemos el apoyo de NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB y el Royal National Institute for the Deaf. Nos gustaría agradecer a la Organización Central de Desarrollo Avícola y al Instituto de Capacitación, Hesaraghatta, Bangalore. Estamos agradecidos con el apoyo de laboratorio y las instalaciones de CIFF y EM en NCBS. Agradecemos a Yoshiko Takahashi y Koichi Kawakami por las construcciones Tol2-eGFP y T2TP, y a Guy Richardson por HCA y el anticuerpo G19 Pcdh15. Agradecemos a los miembros de Earlab por su apoyo constante y valiosos comentarios sobre el protocolo.

Los protocolos relacionados con la obtención, el cultivo y el uso de huevos de gallina fertilizados y embriones no eclosionados fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética Animal del Centro Nacional de Ciencias Biológicas, Bangalore, Karnataka.
1. Electroporación in ovo de precursores auditivos de pollitos
<ol><li>Diseño y clonación de sgRNA para la eliminación del gen CRISPR/Cas9<ol><li>Para crear knockouts genéticos, diseñe ARN guía para interrumpir las regiones de exón del gen, preferiblemente más cerca del extremo 5' de la región codificante.</li>
		<li>Seleccione los posibles ARN guía utilizando una herramienta web CRISPOR23. Establezca los datos del navegador en Gallus gallus y la secuencia de motivos adyacentes del protoespaciador (PAM) en 5'- NGG -3'. El programa determina los ARN guía de la secuencia de entrada y asigna diferentes puntuaciones basadas en la actividad objetivo y fuera del objetivo. Seleccione las cuatro mejores guías para estudios adicionales.</li>
		<li>Para el diseño de oligos específicos de plantilla para la producción de (g)ARN guía, elimine la secuencia PAM (5′- NGG -3′) de la salida de la herramienta de diseño de ARNg. Esto no es necesario para la focalización, pero contiene la secuencia de reconocimiento de escisión Cas9. Sintetizar dos oligos complementarios purificados por HPLC con sitio de restricción de BsmBI en ambos extremos, para cada gRNA potencial.</li>
		<li>Clone la secuencia guía en el marco con un andamio de tracrRNA de un vector de elección (aquí, pcU6_1sgRNA vector se usó24).</li>
		<li>Disuelva los oligonucleótidos de ARNg a una concentración de 100 μM en agua libre de DNasa/RNasa. Realizar recocido de las dos guías oligo sentido y antisentido utilizando un termociclador con los siguientes parámetros: 95 °C durante 3 min, luego 37 °C durante 15 min, y luego disminuir a 4 °C.</li>
		<li>Utilizando técnicas estándar de biología molecular como se describe en25, configuró la digestión de restricción de los oligos recocidos y pcU6_1sgRNA vector de clonación con la enzima BsmBI durante la noche. Configuración de la ligadura con el vector pcU6_1sgRNA lineal gesto-gélido por BsmBI y oligos sgRNA digeridos. Transformarse en una célula competente DH5-alfa y confirmar la secuencia del clon obtenido.</li>
	</ol></li>
	<li>Manipulación de huevos y ventanas<ol><li>Obtenga huevos recién puestos y límpielos limpiándolos con etanol al 70% para evitar la contaminación. Incubar a 37-38 °C, con 45% de humedad durante 3,5-4 días.</li>
		<li>Después de la incubación, coloque el huevo de lado durante al menos 5 minutos antes de abrirlo. Esto permite que el embrión se reposicione en la parte superior de la yema. Use fórceps para hacer pequeños agujeros en la parte superior y en el extremo romo del huevo, de modo que pueda pasar una aguja 21G.</li>
		<li>Para evitar daños durante la ventana, retire la albúmina para bajar el embrión lejos de la cáscara. Para hacer esto, use una jeringa de 5 ml y una aguja de 21G para extraer cuidadosamente 2 ml de albúmina de un orificio en el extremo romo del huevo. Use cinta adhesiva transparente para cubrir el agujero en el extremo romo.</li>
		<li>Para hacer la ventana del huevo, coloque cinta adhesiva transparente en la parte superior de la cáscara del huevo. Abra una ventana, de unos 2 cm de largo y 1,5 cm de ancho, con tijeras de arco de resorte y exponga el embrión. Use fórceps para abrir las membranas coriónicas que recubren el embrión, permitiendo el acceso al embrión.</li>
	</ol></li>
	<li>Plásmidos de microinyección<ol><li>Para el experimento de eliminación de genes, prepare dos soluciones: la mezcla de knock-down que contiene la proteína SpCas9 y el plásmido guía - pcU6_1sgRNA, y la mezcla de plásmido trazador de T2K-eGFP (este es un promotor de Ο-actina de pollo que impulsa el casete GFP rodeado por los sitios de transposón de Tol2) junto con el T2TP (la transposasa Tol2 clonada en la construcciónTol2 26,27). El trazador se utiliza para rastrear la eficiencia de la electroporación.</li>
		<li>Al electroporar plásmidos múltiples, asegúrese de que la concentración final de ADN sea de al menos 4 μg / μL. Mezcle los tres constructos, plásmido guía: pcU6_1sgRNA, T2K-eGFP y T2TP, en una proporción de 1: 1: 1 con 1 μg de proteína SpCas9, 30% de sacarosa y 0.1% de colorante verde rápido en un volumen final de 10 μL.</li>
		<li>Extraiga agujas para microinyección de capilares de vidrio estándar (longitud 3 pulgadas, OD 1,0 mm) utilizando un extractor de pipeta vertical. Use pinzas finas para romper la punta capilar después de tirar para obtener un diámetro de punta de aproximadamente 50 μm con un extremo cónico.</li>
		<li>Coloque los embriones en E3.5 en su lado izquierdo con la cabeza hacia la derecha. De esta manera, solo la vesícula ótica derecha es accesible para la microinyección. Microinyecte la mezcla de derribo en la vesícula ótica. Inyecte alrededor de un volumen de 200 nL de mezcla de solución de ADN para llenar la vesícula ótica.</li>
		<li>Determinar la eficiencia de la guía utilizando un ensayo de endonucleasa T728.</li>
	</ol></li>
	<li>Electroporación<ol><li>Agregue unas gotas de solución salina al 0,719% sobre el embrión antes de la electroporación para reducir la resistencia eléctrica y evitar el sobrecalentamiento del embrión.</li>
		<li>Coloque el electrodo positivo a través del orificio hecho en el lado romo del huevo cuando se extrajo la albúmina. Maniobra el electrodo para que quede debajo de la yema. Coloque el electrodo negativo sobre el otocisto lleno.</li>
		<li>Utilice la electroporación para transfectar plásmidos en las células del embrión. Utilice un generador de pulsos cuadrados y aplique cinco pulsos de 25 V y 100 ms de duración cada uno, separados por 50 ms. Determinar las condiciones empíricamente basándose en una configuración de electroporación individual.</li>
		<li>Hidratar el embrión después de la electroporación añadiendo unas gotas de solución salina al 0,719%. Para limpiar la albúmina desnaturalizada de la superficie de los electrodos, enjuáguela bien con agua destilada. Vuelva a sellar el huevo con cinta adhesiva transparente y vuelva a la incubadora humidificada a 37-38 °C para su posterior incubación. NOTA: Los embriones se pueden cultivar hasta la eclosión después de la electroporación, sin embargo, hay una fuerte reducción en la viabilidad.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Disección de papila basilar
<ol><li>Use etanol al 70% para desinfectar la mesa quirúrgica, la etapa del microscopio y el área circundante. El calor o el alcohol esterilizan el equipo de microdisección que incluye tijeras de arco de resorte mínimo, microcureta y dos pares de pinzas finas.</li>
	<li>Prepare las siguientes placas de disección: una placa de Petri de vidrio con una base de silicio negro, una placa de Petri de plástico de 90 mm y una placa de Petri de 60 mm. Enfríe la solución salina tamponada con fosfato (PBS) o la solución salina balanceada de Hanks (HBSS) para las disecciones.</li>
	<li>Rompe suavemente el huevo en la placa de Petri de 90 mm. Identifica la oreja externa del pollito. Decapitar el embrión cortando el cuello justo por debajo del nivel de la mandíbula inferior con unas tijeras. Transfiera el cabezal a una placa de Petri de 60 mm llena de PBS helado.</li>
	<li>Oriente el embrión con la parte superior del pico mirando hacia el experimentador y sostenga el pico usando uno de los pinzas # 5. Saque los ojos con el segundo pinza #5. Pasando de rostral a caudal, corta el cráneo a lo largo de su línea media. Saca el cerebro.</li>
	<li>Agregue más PBS o HBSS helado y ubique las dos estructuras brillantes, cerca del nivel del pabellón auricular. Estos son los otolitos de la lagena al final del conducto coclear y se encuentran cerca de la línea media.</li>
	<li>Corte aproximadamente entre las dos lagenas, y muy por encima y por debajo de esta región para aislar dos oídos internos. Bajo iluminación oblicua, visualice el contorno del oído interno. Retire el tejido extraño y el vestíbulo.</li>
	<li>Transfiera la cóclea aislada a una placa base de silicona negra con PBS helado. Usando fórceps #5, retire la cápsula coclear cartilaginosa para obtener el conducto coclear. Localice la capa ondulada (tegmento) del conducto coclear y retire usando pinzas #55 para exponer la PA. Usando pinzas #55, retire la membrana tectorial para exponer HC y SC.</li>
</ol>3. Cultivo de explantes de papila basilar
<ol><li>Cultivo de membrana de la PA<ol><li>Tome una placa de cultivo de tejido de seis pocillos y coloque un inserto de membrana de cultivo por pocillo.</li>
		<li>Recoger la papila basilar disecada (explante) en una pipeta de 200 μL con 1x tampón HBSS y transferirla a una membrana. Para evitar que el tejido se pegue a la pared de la pipeta, extraiga algunos medios antes de aspirar el tejido.</li>
		<li>Oriente el explante de tal manera que la papila basilar quede hacia arriba, de modo que el pelo y las células de soporte sean visibles desde la parte superior29. Una vez posicionado el explante, aspire lentamente el tampón HBSS desde la superficie de la membrana de cultivo. En este proceso, el explante se unirá a la membrana de cultivo.</li>
		<li>Agregue 1.2 ml de medio de cultivo Eagle (DMEM) modificado de Dulbecco entre el inserto de membrana y la pared del pozo para llenar los pozos de la placa de seis pocillos. Se pueden cultivar hasta seis explantes en una sola membrana de cultivo de 30 mm.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivo de colágeno del conducto coclear<ol><li>Prepare la mezcla de colágeno agregando 400 μL de 3 mg/ml de colágeno de cola de rata, 50 μL de 10x DMEM, 30 μL de NaHCO3 al 7,5% y 5 μL de HEPES en una campana de cultivo de tejidos.</li>
		<li>Tome un plato de cuatro pocillos y agregue tres gotas de mezcla de colágeno en cada pocillo. Transfiera el conducto coclear disecado a cada gota de colágeno. Incubar la placa durante 10 min a 37 °C, 5% deCO2 para curar la matriz de colágeno.</li>
	</ol></li>
	<li>Tratamiento de cultivos con moléculas pequeñas<ol><li>Preparar medios de cultivo (DMEM, suplemento N-2, penicilina) con el modulador farmacológico o su disolvente solo (para su uso como control). Reemplace los medios de cultivo con 700 μL de medios suplementados con el inhibidor. Cultivar los explantes en una incubadora a 37 °C, 5%CO2.</li>
		<li>Reemplace el 50% de los medios de cultivo todos los días. Después del tiempo de incubación adecuado, retire los medios de cultivo y utilice los explantes para ensayos posteriores.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Imágenes y análisis
<ol><li>Análisis inmunofluorescente<ol><li>Retire los medios de cultivo de los pozos y lave los explantes dos veces con 1x HBSS. Con una pipeta, añadir 1 ml de paraformaldehído (PFA) al 4% al pocillo e incubar durante 20 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire el PFA y lave los explantes tres veces con 1x PBS a temperatura ambiente. Para recoger los explantes de la membrana de cultivo, haga un pequeño corte alrededor de la membrana que contiene la pieza del tejido con tijeras de arco de resorte pequeñas y transfiera el tejido junto con la membrana a una placa de cultivo de 48 pocillos usando fórceps. NOTA: Si los tejidos están flotando después de la fijación, aspire con una pipeta de 200 μL y transfiérala a placas de 48 pocillos para su posterior procesamiento. Evite el desprendimiento forzado del tejido de la membrana.</li>
		<li>Para el cultivo de gotitas de colágeno, use fórceps para transferir toda la gota de colágeno a una placa de silicio. Agregue 200 μL de 1x PBS y elimine el colágeno con la ayuda de fórceps, y luego transfiera el tejido a una placa de cultivo de 48 pocillos.</li>
		<li>Permeabilizar los explantes con 1 mL de 1x PBS suplementado con 0,3% de Tween-20 (PBST) durante 30 min a temperatura ambiente. Incubar los explantes con 200 μL de tampón de bloqueo (10% de suero de cabra + 1% de albúmina sérica bovina en PBST) durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Incubar los explantes con 200 μL de solución de anticuerpos primarios (1:300, en tampón de bloqueo) durante la noche a 4 °C. Retire la solución de anticuerpos primarios y lave bien los explantes 5 x 20 min con PBST.</li>
		<li>Incubar los explantes con 200 μL de faloidina y solución de anticuerpos secundarios (en tampón de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Retire la solución de faloidina y anticuerpos secundarios y lave bien los explantes 5 x 20 min con PBST. NOTA: La concentración secundaria de anticuerpos y la longitud de lavado deben determinarse para cada aplicación de imagen individual. Para las imágenes utilizando microscopía de súper resolución, normalmente aumentamos la concentración del anticuerpo secundario de 1:500 a 1:200 y aumentamos la concentración de faloidina de 1:400 a 1:200.</li>
		<li>Incubar los explantes con una solución de DAPI (1:1000 en PBST) durante 15 min a temperatura ambiente. Retire la solución DAPI y lave los explantes 3 x 5 min con PBST.</li>
		<li>Utilice el medio de montaje para montar explantes en una guía con la presión arterial hacia arriba (contra el cubreobjetos). Para imágenes confocales, utilice medios de montaje antidecoloración. Deje que el medio de montaje se seque durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Imagine directamente o guarde las diapositivas a 4 °C hasta que se le dé la imagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Fijación OTOTO para análisis SEM<ol><li>Prepare todas las soluciones frescas y manipule de acuerdo con las pautas de seguridad locales. Fijar explantes cultivados por membrana (a partir del paso 4.1.4) en glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato sódico 0,1 M (pH 7,3) con 3 mM CaCl2. Realizar la fijación a 4 °C durante 24 a 72 h con un cambio de fijador cada 24 h.</li>
		<li>Retire el fijador y lave el pañuelo con cacodilato de sodio 0,1 M 3 x 5 min a temperatura ambiente. Fijación secundaria con OsO 4 al 1% (diluido a partir de una cepa de OsO 4 al4% utilizando tampón de cacodilato de sodio 0,1 M) durante 1 h a temperatura ambiente. Realice esto y los pasos posteriores hasta la deshidratación en una campana extractora.</li>
		<li>Enjuagar con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M 3 x 5 min a temperatura ambiente. Luego enjuague con agua doble destilada o ultrapura 3 x 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Prepare una solución al 0,5% de tiocarbohidrazida (TCH) en agua ultrapura. Revuelva a 75 °C durante 10 min y filtre la solución cuando se haya enfriado a temperatura ambiente. NOTA: TCH es extremadamente peligroso. El uso debe ser aprobado por el comité de seguridad local, y se debe tener cuidado al manipularlo.</li>
		<li>Retire el agua ultrapura de la muestra y agregue 0.5% de TCH gota a gota. Si la solución se vuelve marrón, deténgase y enjuague la muestra con agua ultrapura, antes de agregar cuidadosamente la solución de TCH al 0,5%. Una vez que la solución esté clara, reemplácela con 0.5% TCH. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min30,31.</li>
		<li>Enjuague la muestra con agua ultrapura 3 x 5 min a temperatura ambiente. Repita los pasos 4.2.2, 4.2.3 y 4.2.5 dos veces más terminando con la incubación de OsO4 seguida de enjuague.</li>
		<li>Deshidratar las muestras en una serie de etanol a etanol 100% anhidro (EtOH). Incubar primero en 25% ETOH durante 10 min, luego 50% ETOH durante 10 min, 75% EtOH durante 10 min, 95% ETOH durante 10 min, antes de incubar por un total de 3x durante 10 min cada uno en 100% ETOH.</li>
		<li>Realizar el secado del punto crítico utilizandoCO2 líquido. Monte inmediatamente las muestras en un talón SEM con cinta adhesiva de carbono de doble cara. Proceda a pulverizar la capa para proporcionar 5-10 nm de recubrimiento. Si no se obtienen imágenes inmediatamente, almacene las muestras en un desecador al vacío.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

El pollito es una adición rentable y conveniente a los organismos modelo que un laboratorio puede usar para investigar el oído interno. Los métodos descritos aquí se utilizan rutinariamente en nuestro laboratorio y complementan la investigación en curso en el oído interno de los mamíferos. La electroporación in ovo se utiliza para introducir manipulaciones genéticas en el genoma del pollo. La electroporación también puede ser utilizada para introducir constructos que codifican proteínas fluorescentes dirigidas a...

El oído interno de todos los vertebrados se deriva de un epitelio simple conocido como el placode ótico 1,2. Esto dará lugar a todos los elementos estructurales y los tipos de células necesarios para transducir la información mecanosensorial asociada con la audición y la percepción del equilibrio. Las células ciliadas (HC), el sensor ciliado del oído interno, están rodeadas por células de soporte (SC). Los HC transmiten información al cerebro posterior auditivo a través de las neuronas del octavo nervio craneal. Estos también se generan a partir del placa ótica3. La transducción primaria del sonido se logra en la superficie apical de la HC auditiva, a través de un haz de cabello mecánicamente sensible4. Esto está mediado a través de protuberancias modificadas basadas en actina llamadas estereocilios, que están dispuestas en un patrón de escalera gradual5. Además, un cilio primario modificado, llamado kinocilium, organiza la formación del haz capilar y es adyacente a la fila más alta de estereocilios 6,7,8. La arquitectura de los estereocilios es crítica para este papel en la conversión de estímulos mecánicos derivados de la energía acústica en señales neuronales eléctricas9. El daño a la HC auditiva por envejecimiento, infección, trauma otoacústico o shock ototóxico puede resultar en pérdida parcial o completa de la audición que, en los mamíferos, es irreversible10.
Se han propuesto terapias de reemplazo celular que podrían reparar ese daño11,12. El enfoque de esta investigación ha sido comprender el desarrollo normal de las células ciliadas de mamíferos y preguntar si los programas de desarrollo pueden reiniciarse en células progenitoras que pueden existir dentro del oído interno13. Un segundo enfoque ha sido mirar fuera de los mamíferos, a vertebrados no mamíferos en los que se produce una regeneración robusta de las células ciliadas auditivas, como las aves14,15. En las aves, la regeneración de las células ciliadas ocurre predominantemente a través de la desdiferenciación de una célula de soporte a un estado similar al progenitor, seguida de una división mitótica asimétrica para generar una célula ciliada y una célula de soporte16. Además, también se ha observado diferenciación directa de una célula de soporte para generar una célula ciliada17.
Si bien los mecanismos del desarrollo auditivo aviar muestran similitudes significativas con los de los mamíferos, existen diferencias18. La diferenciación de HC y SC en la PA del pollo es evidente desde el día embrionario (E) 7, volviéndose más clara con el tiempo. Para E12, se puede visualizar una papila basilar (PA) bien modelada y bien polarizada, y para E17 se pueden ver células ciliadas bien desarrolladas19. Estos puntos de tiempo proporcionan ventanas a los mecanismos de diferenciación, patrones y polaridad, así como a la maduración de las células ciliadas. Comprender si tales mecanismos se conservan o divergen es importante, ya que proporcionan información sobre la profunda homología de los orígenes de las células ciliadas mecanosensoriales.
Aquí, demostramos una serie de técnicas realizadas en etapas embrionarias tempranas y tardías para estudiar procesos celulares como la proliferación, la especificación del destino, la diferenciación, el patrón y el mantenimiento a lo largo del desarrollo del órgano del oído interno. Esto complementa otros protocolos para comprender el desarrollo del oído interno en el cultivo de explantes20,21,22. Primero discutimos la introducción de ADN o ARN exógeno en precursores de PA dentro del otocisto E3.5 utilizando electroporación in ovo. Aunque las manipulaciones genéticas pueden proporcionar información valiosa, los fenotipos así generados pueden ser pleiotrópicos y, en consecuencia, confusos. Esto es particularmente cierto durante el desarrollo posterior del oído interno, donde los procesos fundamentales como la remodelación citoesquelética desempeñan múltiples funciones en la división celular, la morfogénesis tisular y la especialización celular. Presentamos protocolos de inhibición farmacológica en explantes cultivados, que ofrecen ventajas en el control de la dosis y el tiempo y duración del tratamiento, ofreciendo una manipulación espaciotemporal precisa de los mecanismos de desarrollo.
Se pueden utilizar diferentes métodos de cultivo de órganos dependiendo de la duración del tratamiento de los inhibidores pequeños. Aquí demostramos dos métodos de cultivo de órganos que permiten comprender la morfogénesis epitelial y la especialización celular. Un método para el cultivo 3D utilizando colágeno como matriz para cultivar el conducto coclear permite un cultivo robusto y una visualización en vivo de la PA en desarrollo. Para comprender la formación de estereocilios, presentamos un método de cultivo de membrana tal que el tejido epitelial se cultiva en una matriz rígida que permite que las protuberancias de actina crezcan libremente. Ambos métodos permiten el procesamiento posterior, como imágenes de células vivas, inmunohistoquímica, microscopía electrónica de barrido (SEM), registro celular, etc. Estas técnicas proporcionan una hoja de ruta para el uso efectivo del pollito como un sistema modelo para comprender y manipular el desarrollo, la maduración y la regeneración del epitelio auditivo aviar.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 Faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasa V3</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>1081061</td><td>Proteína Cas9 de alta fidelidad</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td>Conejo policlonal a GFP</td></tr><tr><td>Suero bovino Albúmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q12135</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno I, cola de rata</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Secador de puntos críticos Leica EM CPD300</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CUY-21 Electroporador</td><td>Nepageno</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DM5000B Microscopio de campo amplio</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alto contenido de glucosa, suplemento GlutaMAX, piruvato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumont #5 Herramientas</td><td>de ciencia fina</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Pinzas</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>FLUOVIEW 3000 Microscopio de barrido láser</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehído (25 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG Secundario Anticuerpo, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón IgG Secundaria Anticuerpo, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-Conejo IgG Anticuerpo secundario, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra Estéril filtrado</td><td>HiMedia</td><td>RM10701</td><td>Inactivado por calor</td></tr><tr><td>Solución salina equilibrada de Hanks (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>LSM980 Airyscan Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millicell Cell Cell Cultiv, 30 mm, PTFE hidrófilo, 0,4 y micro; m</td><td></td> Microscopio estereoscópico <td>Sigma-Aldrich</td> PICM03050 <td></td></tr><tr><td>MVX10</td><td>Anticuerpo Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MYO7A</td><td>DSHB</td><td>138-1</td><td>Monoclonal de ratón a miosina-VIIa no convencional</td></tr><tr><td>MZ16 Microscopio de disección</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100X)</td><td>Tijeras Thermo Fisher Scientific</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Noyes, 14 cm (5,5' ')</td><td>World Precision Instruments</td><td>501237</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio (4%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PC-10 Puller</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcU6_1sgRNA</td><td>Addgene</td><td>92395</td><td>Mini vector con pollo modificado Promotor U6</td></tr><tr><td>Penicilina G sal</td> <td>sódicaSigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antidecoloración</td><td>Mountant Thermo Fisher Scientific</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>SMZ1500 Microscopio de disección</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampón de cacodilato de sodio, 0,2 m</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>11652</td><td></td></tr><tr><td>Sodio cloruro</td><td>HiMedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>Sputtre Coater K550X</td><td>Emitech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio estándar 3 pulgadas, diámetro exterior 1,0 mm, sin filamento</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>The MERLIN Compact</td><td>VP Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiocarbohydrazide</td><td>Alfa Aesar</td><td>L01205</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

métodos in ovo y ex ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

El oído interno percibe el sonido y mantiene el equilibrio utilizando la cóclea y el vestíbulo. Lo hace mediante el uso de un tipo de célula mecanosensorial dedicada conocida como la célula ciliada. La investigación básica en el oído interno ha llevado a una comprensión profunda de cómo funciona la célula ciliada y cómo la desregulación puede conducir a la pérdida de audición y vértigo. Para esta investigación, el ratón ha sido el sistema modelo preeminente. Sin embargo, los ratones, como todos los mamíferos, han perdido la capacidad de reemplazar las células ciliadas. Por lo tanto, al tratar de comprender las terapias celulares para restaurar la función del oído interno, los estudios complementarios en otras especies de vertebrados podrían proporcionar más información. El epitelio auditivo de las aves, la papila basilar (PA), es una lámina de epitelio compuesta de células ciliadas mecanosensoriales (HC) intercaladas por células de soporte (SC). Aunque la arquitectura anatómica de la papila basilar y la cóclea de mamíferos difieren, los mecanismos moleculares del desarrollo del oído interno y la audición son similares. Esto hace que la papila basilar sea un sistema útil no solo para estudios comparativos sino también para comprender la regeneración. Aquí, describimos técnicas de disección y manipulación para el oído interno del pollo. La técnica muestra métodos genéticos y de inhibición de moléculas pequeñas, que ofrecen una potente herramienta para estudiar los mecanismos moleculares del desarrollo del oído interno. En este artículo, discutimos técnicas de electroporación in ovo para perturbar genéticamente la papila basilar utilizando deleciones CRIPSR-Cas9, seguidas de la disección de la papila basilar. También demostramos el cultivo de órganos de PA y el uso óptimo de matrices de cultivo, para observar el desarrollo del epitelio y las células ciliadas.

En la configuración de electroporación, el posicionamiento del electrodo puede desempeñar un papel en el dominio de la transfección. El electrodo positivo se coloca debajo de la yema, y el negativo sobre el embrión (Figura 1A). Esto da como resultado una mayor expresión de GFP en gran parte del oído interno y ambos órganos vestibulares (Figura 1B) y papila basilar auditiva (Figura 1C, D), lo que confirma la transfec...

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

La edad, la infección y los medicamentos ototóxicos pueden causar la degeneración de las células ciliadas del oído interno, lo que en nosotros conduce a la pérdida de audición. En vertebrados no mamíferos, como el pollo, las células ciliadas pueden regenerarse. Las técnicas descritas aquí hacen uso de la rentabilidad de trabajar en embriones de pollo, la facilidad de obtención de embriones y el buen desarrollo exo de los explantes de tejidos.Comprender el desarrollo y la regeneración de los pelos del oído interno aviar puede proporcionar información importante sobre la pérdida auditiva y las posibles terapias, y el cultivo de explantes puede ser importante para evaluar los efectos ototóxicos de varios medicamentos. Antes de comenzar el experimento, obtenga huevos recién puestos y límpielos con etanol al 70% para evitar la contaminación. Incubar los huevos durante 3,5 a 4 días, a 37 a 38 grados centígrados con 45% de humedad.Después de la incubación, vuelva a colocar el embrión en la parte superior de la yema, colocando un huevo de lado durante cinco minutos. Luego, use fórceps para hacer un pequeño orificio en la parte superior y el extremo romo del huevo para que pase una aguja de calibre 21. Con una jeringa de cinco mililitros y una aguja de calibre 21, retire dos mililitros de albúmina de un orificio en el extremo romo del huevo.Cubra el orificio en el extremo romo con cinta transparente. Para hacer que la ventana del huevo fije la cinta transparente a la parte superior de la cáscara del huevo. Sostenga las agujas de la microinyección de capilares de vidrio estándar utilizando un extractor de pipeta vertical.Después de tirar, rompa la punta capilar con pinzas finas para obtener un diámetro de punta de aproximadamente 50 micrómetros con un extremo cónico. Para el experimento de eliminación de genes, mezcle las tres construcciones, a saber, el plásmido guía, pcU6.1sgRNA, T2KeGFP, T2TP en una proporción de uno a uno a uno con un microgramo de proteína SP Cas9, 30% de sacarosa y 0.1% de colorante verde rápido, y un volumen final de 10 microlitros. Al electroporar múltiples plásmidos, asegúrese de que la concentración final de ADN sea de al menos cuatro microgramos por microlitro.Con la ayuda de tijeras de arco de resorte, abra alrededor de una ventana de dos centímetros de largo y 1,5 centímetros de ancho, y exponga el embrión. Luego use fórceps para abrir las membranas coriónicas que recubren el embrión, permitiendo el acceso al embrión. Inyecte alrededor de 200 nanolitros de volumen de mezcla de solución de ADN para llenar la vesícula ótica.Para determinar la eficiencia del ARN guía realice un ensayo de endonucleasa T7. Agregue gotas salinas al embrión al 0,719% para reducir la resistencia eléctrica y evitar el sobrecalentamiento. A continuación, coloque el electrodo positivo a través del orificio hecho en el lado romo del huevo y maniobra el electrodo para que quede debajo de la yema.Coloque el electrodo negativo sobre el otocisto lleno. Para transfectar el plásmido en la vesícula ótica con electroporación, use un generador de pulsos cuadrados y aplique cinco pulsos de 25 voltios durante 100 milisegundos cada uno, con 50 milisegundos de diferencia. Determinar las condiciones empíricamente basándose en una configuración de electroporación individual.Después de la electroporación, hidratar el embrión añadiendo unas gotas de solución salina al 0,719%. Vuelva a sellar el huevo con cinta transparente y regrese a la incubadora humidificada a 37 a 38 grados centígrados para su posterior incubación. Desinfecte la mesa quirúrgica, la etapa del microscopio y el área circundante con etanol y calor al 70%, o esterilice con alcohol el equipo de microdisección, incluidas las tijeras mínimamente de resorte, el microcuret y dos pares de pinzas finas.Prepare las placas de disección, incluida una placa de Petri de vidrio con una base de silicona negra, una placa de Petri de plástico de 90 milímetros y una placa de Petri de 60 milímetros. Mantenga PBS refrigerado o la solución salina balanceada de Hanks, también conocida como HBSS, lista para las disecciones. Rompe suavemente el huevo en la placa de Petri de 90 milímetros.Luego identifique la oreja externa del pollito y transfiera la cabeza a una placa de Petri de 60 milímetros llena de PBS helado. A continuación, oriente el embrión con la parte superior del pico mirando hacia adentro, y sostenga el pico con uno de los pinzas número cinco. Saque los ojos con el segundo número cinco fórceps.Luego, de rostral a caudal, corte a lo largo del cráneo a lo largo de su línea media y saque el cerebro. Agregue más PBS helado, o HBSS, y ubique los dos otolitos de la lagena como estructuras brillantes al final del conducto coclear y cerca de la línea media. Para aislar dos oídos internos, corte entre las dos lagenas, y muy por encima y por debajo de la región.Luego, bajo iluminación oblicua, visualice el contorno del oído interno y elimine el tejido extraño y el vestíbulo. Transfiera la cóclea aislada a una placa base de silicona negra con PBS helado. Despegue la cápsula coclear cartilaginosa usando pinzas número cinco para obtener el conducto coclear.Luego localice la capa ondulada o tegmento del conducto coclear, y retírela usando pinzas número 55 para exponer la papila basilar o PA. A continuación, retire la membrana tectorial para exponer las células ciliadas y las células de soporte utilizando fórceps número 55. Para el cultivo por membrana de la papila basilar, tome una placa de cultivo de tejido de seis pocillos y organice un inserto de membrana de cultivo por pocillo. Extraiga algunos medios en una pipeta de 200 microlitros y luego aspire el explante de papila basilar disecado con un tampón X HBSS.Transfiera el explante a una membrana y oriente de modo que la papila basilar mire hacia arriba, y el cabello y las células de soporte sean visibles desde la parte superior. Una vez colocado el explante, aspire el tampón HBSS lentamente desde la superficie de la membrana de cultivo. En este proceso, el explante se unirá a la membrana de cultivo.Llene el pozo de la placa de seis pozos agregando 1.2 mililitros del medio de águila modificado de dulbecco, o medio de cultivo DMEM, entre el inserto de la membrana y la pared del pozo. Para preparar el cultivo de colágeno del conducto coclear, agregue tres gotas de mezcla de colágeno recién preparada en cada pocillo de una placa de cuatro pocillos y transfiera el conducto coclear disecado a cada gota de colágeno. Incubar la placa durante 10 minutos a 37 grados centígrados, y 5% de dióxido de carbono para curar la matriz de colágeno.Para un tratamiento de moléculas pequeñas de los cultivos, reemplazar los medios de cultivo con 700 microlitros de medios suplementados con el modulador farmacológico, como la penicilina, e incubar las placas como se demostró anteriormente. Reemplace el 50% de los medios de cultivo todos los días. Después del tiempo de incubación adecuado, retire los medios de cultivo y utilice los explantes para los ensayos posteriores.En la configuración de electroporación, el posicionamiento correcto del electrodo resultó en una mayor expresión de GFP en el oído interno en ambos órganos vestibulares y en la papila basilar auditiva que confirma la transfección. CRISPR Cas9 medió la eliminación del gen Atoh1 en el oído interno, lo que resultó en la pérdida de células ciliadas. La eliminación del gen Atoh1 a través de una ovo-electroporación seguida de incubación hasta E10 mostró un desarrollo reducido de células ciliadas en comparación con el control de plásmidos vacíos.Aunque la electroporación es mosaico, las células electroporadas de control fueron capaces de formar células ciliadas. En muestras electroporadas de ARNg de Atoh1, las células positivas de proteína fluorescente verde nunca mostraron los marcadores de desarrollo de células ciliadas. El cultivo de órganos de la papila basilar en una matriz 3D, como colágeno y tinción con anticuerpos contra el antígeno de las células ciliadas, proporcionó la excelente preservación de la morfología del tejido durante un máximo de cinco días.La organización de las células ciliadas y las células de soporte se mantuvieron en estas condiciones de cultivo. Los cultivos de órganos en una membrana se pueden mantener hasta por cinco días mientras se mantiene la integridad del haz capilar. Esto se puede ver en la imagen representativa por la localización de la proteína de enlace de punta, protocadherina 15.Para investigar el desarrollo del haz capilar, las imágenes de mayor resolución, como la microscopía de súper resolución o la microscopía electrónica de barrido, pueden proporcionar más información. Las condiciones estériles deben mantenerse durante todo el procedimiento. Mientras electropo, asegúrese de que los embriones no se sequen.Al valorar los inhibidores farmacológicos, se puede reducir la concentración para superar cualquier letalidad. Tanto los embriones como los explantes se pueden tomar para experimentos de imágenes. Ya sea realizando microscopía de video en tiempo real o microscopía electrónica confocal de luz estática, como se muestra en el protocolo.Dada la facilidad y accesibilidad del uso de explantes de oído interno de pollo, podemos usar el medio a través de la detección de prueba para identificar nuevas moléculas esenciales para la regeneración de las células ciliadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

En este artículo se presenta una metodología sencilla para que a largo...

Un Ex-ovo</emPollo> Embrión de cultivo apropiado para aplicaciones de imagen y sistema de Microcirugía

Para evaluar la función y la regulación de los genes durante el desarrollo de las neuronas del cerebro medio dopaminérgico, se describe un método que consiste...

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

La expresión ectópica es una técnica para dilucidar el papel microRNAs en el desarrollo del cerebro. Sin embargo, la focalización en áreas específicas mediante electroporación in ovo es un reto. Aquí, se muestra una forma eficiente a las regiones del cerebro medio ventral y dorsal selectiva electroporar.

En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Aquí describimos una técnica de microdisección seguida de la inyección de tinte fluorescente en el ganglio de la acústica de los primeros embriones de pollo para el seguimiento selectivo de las fibras auditivas axones en el nervio y cerebro posterior.

Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

Ver y acceder al embrión de pollo durante el desarrollo puede ser un desafío. Hemos desarrollado un método ex ovo que es simple, rentable y se puede usar fácilmente en un aula o en un entorno de investigación. Este método proporciona acceso al embrión en etapas tardías del desarrollo embrionario (HH 40).

Optimizado Ex-ovo El cultivo de embriones del polluelo a etapas avanzadas de desarrollo

El órgano auditivo media la audición. En este trabajo presentamos un método modificado de microelectroporación in ovo optimizado para el estudio de la proliferación y diferenciación de células progenitoras auditivas en el órgano auditivo de pollo en desarrollo.

La transferencia de genes en el pollo auditiva de órgano de<em&gt; En Ovo</em&gt; Micro-electroporación

Las neuronas auditivas del tronco encefálico de aves y mamíferos están especializadas en la codificación neural rápida, un proceso fundamental para las funciones auditivas normales. Estas neuronas surgen de precursores distintos de embriones hindbrain. Presentamos técnicas que utilizan electroporación para expresar genes en el cerebro posterior de embriones de pollo para estudiar la función génica durante el desarrollo auditivo.

En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Aquí, presentamos un organotypic cultivo protocolo para crecer órganos embrionarios de pollo en vitro. Usando este método, el desarrollo de tejidos de embrión de pollo puede ser estudiado, manteniendo un alto grado de control sobre el ambiente de cultivo.

Cultura Organotypic método para estudiar el desarrollo de tejidos de embrión de pollo

Aquí presentamos un protocolo para obtener cortes auditivos no coronales del tronco encefálico del embrión de pollo para la investigación de propiedades tonotópicas y trayectorias de desarrollo dentro de un corte del tronco encefálico. Estos cortes incluyen secciones sagitales, horizontales y horizontales / transversales que abarcan regiones tonotópicas más grandes dentro de un plano de corte individual que las secciones coronales tradicionales.

Cortar el tronco cerebral auditivo embrionario del pollo para evaluar gradientes tonotópicos y microcircuitos

Hemos utilizado técnicas estándar de respuesta auditiva del tronco encefálico (ABR) y las hemos aplicado a pollos lactantes, un modelo aviar precoz para la función auditiva. El protocolo describe en detalle las técnicas de preparación animal y adquisición de ABR, con pasos que podrían traducirse a otros modelos de aves o roedores.

Evaluación de la respuesta auditiva del tronco encefálico en crías de pollo

Este protocolo, destinado a usuarios novatos de tejido del oído interno de ratón, detalla exhaustivamente los pasos para procesar los oídos internos de ratón en diferentes etapas de desarrollo para la inmunotinción de secciones.

Criosección e inmunotinción de tejido del oído interno de ratón: desde la etapa embrionaria hasta la adulta

Aprende métodos in ovo y ex ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar usando embriones de pollo. Estas técnicas permiten analizar la regeneración de células ciliadas y evaluar efectos ototóxicos de fármacos.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

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