Name: Identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza A (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Aprende a identificar caspasas y sus sitios de escisión en proteínas durante la infección por virus de la influenza A. Este método utiliza células MDCK y A549 para estudiar la patogénesis viral y desarrollar posibles dianas terapéuticas.

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El autor reconoce a Jennifer Tipper, Bilan Li, Jesse vanWestrienen, Kevin Harrod, Da-Yuan Chen, Farjana Ahmed, Sonya Mros, Kenneth Yamada, Richard Webby, BEI Resources (NIAID), el Health Research Council of New Zealand, el Maurice and Phyllis Paykel Trust (Nueva Zelanda), el H.S. and J.C. Anderson Trust (Dunedin), y el Departamento de Microbiología e Inmunología y la Facultad de Ciencias Biomédicas (Universidad de Otago).

Se obtuvieron aprobaciones regulatorias del Comité Institucional de Seguridad Biológica de la Universidad de Otago para trabajar con el IAV y las células de mamíferos. Para el presente estudio se utilizó el riñón canino Madin-Darby (MDCK) o células epiteliales a549 alveolares de pulmón humano y subtipos IAV H1N1. El IAV se cultivó en huevos de gallina, como se describe en otra parte17. Se utilizaron condiciones estériles y asépticas para trabajar con células de mamíferos, y se utilizaron una instalación de Bioseguridad Nivel 2 (o Contención Física 2) y un gabinete de bioseguridad Clase II para trabajar con subtipos de IAV.
1. Evaluación de la escisión o degradación de proteínas en células infectadas por IAV por caspasas
<ol><li>Semilla 3 x 105 células MDCK o A549 por pocillo en una placa de cultivo celular de 12 pocillos. NOTA: Si utiliza células MDCK, asegúrese de que el anticuerpo contra la proteína de interés reconozca su especie canina.</li>
	<li>Sembrar los pocillos en pares, es decir, un par de control, un pozo para la muestra simulada no infectada y otro para la muestra simulada infectada, y un par de pruebas, un pocillo para la muestra A del inhibidor A no infectado y otro para la muestra del inhibidor A infectado. Aumentar el número de pares con cada inhibidor adicional (ver referencias 7,8).</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera deCO2 al 5% durante la noche.</li>
	<li>Al día siguiente, infecte las células con IAV (un subtipo H1N1 u otro subtipo).<ol><li>Para ello, preparar el inóculo del virus diluyendo las existencias de virus en 400 μL de medio esencial mínimo (MEM) libre de suero (véase la Tabla de materiales) a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,5-3,0 unidades formadoras de placa (ufp)/célula 7,11 (un factor de duplicación del número de células al calcular el MOI). NOTA: Para infectar células MDCK, complementar el inóculo del virus con tosilfenilanil clorometilcetona (TPCK)-tripsina a una concentración final de 1 μg/ml.</li>
	</ol></li>
	<li>Retirar el medio de cultivo antiguo de las células (paso 1.3) y lavar las células con 1 ml/pocillo de MEM 2x sin suero.</li>
	<li>Añadir 400 μL de inóculo vírico (paso 1.4.1) a las células e incubarlas durante 1 h a 35 °C en una atmósfera deCO2 al 5%.</li>
	<li>Mientras tanto, diluya un inhibidor de caspasa (por ejemplo, Z-DEVD-FMK), un inhibidor de lisosoma (por ejemplo, NH4Cl) o un inhibidor del proteasoma (por ejemplo, MG132) (consulte la Tabla de materiales) a una concentración final de 40 μM, 20 mM o 10 μM, respectivamente, en MEM7 sin suero (consulte la Tabla de materiales). Los dos últimos inhibidores sirven como control. Diluir un volumen igual del disolvente (si no es agua) utilizado para reconstituir uno de los inhibidores en medio libre de suero como simulacro.</li>
	<li>Retire el inóculo del virus y lave las células como en el paso 1.5 (1x).</li>
	<li>Agregue la MEM sin suero, 1 ml / pocillo, simulada o suplementada con un inhibidor, a las células e incube las células como en el paso 1.6. Este punto de tiempo se considera como infección de 0 h.</li>
	<li>Después de 24 h, recolecte las células raspándolas con un émbolo de jeringa de 1 ml (lado de goma) y transfiéralas a un tubo de polipropileno de 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante 1-2 min a temperatura ambiente. Recoger el sobrenadante con una pipeta. NOTA: Este sobrenadante podría descartarse o usarse para un ensayo de placa8 para medir el título de la progenie del virus liberado.</li>
	<li>Lavar el pellet celular con 250 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) mediante recentrifugación como en el paso 1.11.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y lisar las células agregando 80-100 μL de tampón de lisis celular (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5% de dodecil sulfato de sodio (SDS), 0.5% de desoxicolato de sodio, 1% Triton X-100 y 1x cóctel de inhibidores de proteasa, ver Tabla de materiales) y vórtice.</li>
	<li>Calentar el tubo a 98 °C durante 10 min para lisar completamente y preparar el lisado celular total. Guarde los lisados a 4 °C para realizar los pasos 1.15-1.17 al día siguiente, pero, para obtener mejores resultados, finalice estos pasos el mismo día.</li>
	<li>Calcule la cantidad de proteína en cada muestra utilizando un kit de ensayo de BCA (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Resolver cantidades iguales de proteína de muestras no infectadas e infectadas mediante electroforesis estándar en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)11 junto con marcadores de peso molecular 11.</li>
	<li>Transfiera la proteína a una membrana de nitrocelulosa o difluoruro de polivinilideno (PVDF) (consulte la Tabla de materiales). NOTA: La membrana de PVDF puede dar un fondo alto en algunas imágenes de Western blot; Compruebe la compatibilidad.</li>
	<li>Realizar Western blot para detectar la proteína de interés utilizando el método descrito en otra parte11.</li>
	<li>Compare los niveles de proteína en los carriles de muestra infectados tratados con simulacros y tratados con inhibidores. NOTA: Si el nivel de proteína se ha recuperado en el carril de muestra infectado tratado con inhibidores de caspasas, entonces la proteína es escindida o degradada por caspasas. De lo contrario, es degradado por lisosoma o proteasoma.</li>
	<li>Cuantificar la recuperación de proteínas midiendo su intensidad de banda en cada carril a partir de al menos tres réplicas del mismo experimento y normalizándola con la banda de control de carga correspondiente.</li>
	<li>Utilice cualquier generador de imágenes contemporáneo y el software asociado (consulte la Tabla de materiales) para obtener imágenes de las manchas occidentales y cuantificar la recuperación de proteínas.</li>
</ol>2. Confirmación de la escisión mediada por caspasa o degradación de proteínas en células infectadas por IAV por interferencia de ARN
<ol><li>Diseñar u obtener un ARN de interferencia pequeña (ARNsi) prediseñado dirigido a la caspasa 3, caspasa 6 y caspasa 7 canina o humana (caspasas de verdugo1) y un ARNip de control no dirigido (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Administrar cada siRNA a células MDCK o A549 por transfección inversa 8,11.</li>
	<li>Para ello, diluir en tubos separados 100 nM de siRNA de control o siRNA de caspasa o un volumen recomendado de reactivo de transfección (ver Tabla de materiales) en 100 μL de medio apropiado (como OptiMEM, ver Tabla de materiales), e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar cada dilución por duplicado. NOTA: Este duplicado incluye una réplica para analizar la eliminación de la expresión de caspasa por RT-qPCR o western blot (si se dispone de anticuerpos contra caspasas) y otra para evaluar la recuperación de la proteína de interés por western blotting.</li>
	<li>Mezclar 100 μL de cada solución de ARNip con 100 μL de solución de reactivo de transfección (paso 2.3) e incubar durante 20-45 min a temperatura ambiente para formar el complejo reactivo siRNA-transfección.</li>
	<li>Mientras tanto, dividir y añadir 1 x 10 5 células MDCK o A549 en 800 μL del medio de crecimiento completo, mezclar con 200 μL de complejo reactivo de transfección de ARNip (paso2.5 ) y añadir 1 ml de la suspensión a un pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos. Esta dilución eleva la concentración final de siRNA de control o siRNA de caspasa a 10 nM.</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera de CO2 al 5% durante72 h.</li>
	<li>Recolectar las células de una réplica como en el paso 1.10, y procesarlas para validar o confirmar la eliminación de la expresión de caspasa 3, caspasa 6 y caspasa 7, ya sea por RT-qPCR o western blotting, respectivamente, utilizando métodos y protocolos estándar 8,11.</li>
	<li>Infectar las células en el otro replicar con IAV como se describe en los pasos 1.4-1.9 (sin inhibidores).</li>
	<li>Después de 24 h, cosechar, procesar y analizar las células mediante Western blot y medir y cuantificar la recuperación de proteínas como se describe en los pasos 1.10-1.20.</li>
</ol>3. Mutagénesis dirigida al sitio para localizar el sitio o sitios de escisión de la caspasa en el polipéptido
<ol><li>Clone la proteína codificante de genes de interés en un plásmido de expresión de mamífero11 u obténgala de un laboratorio de investigación o fuente comercial (ver Tabla de materiales). NOTA: Se prefiere si el gen se clona con una etiqueta de epítopo o como fusión GFP para distinguir el polipéptido expresado ectópicamente del expresado endógenamente durante la transferencia occidental.</li>
	<li>Utilizando bases de datos de sustrato de caspasa 4 o herramientas de alineación de proteínas, localice los motivos de escisión de caspasade consenso, XXXD y DXXD, en el polipéptido. Casi todos los motivos de escisión de caspasa poseen el ácido aspártico en el sitio de escisión (P1)3,4.</li>
	<li>Mutar el ácido aspártico P1 putativo a ácido glutámico o un aminoácido no polar (alanina, valina) mediante mutagénesis dirigida al sitio seguida de secuenciación de ADN11 utilizando métodos y protocolos estándar.</li>
	<li>Entregar el ADN plásmido mutante (WT) y de tipo salvaje a las células MDCK o A549 mediante transfección inversa11.<ol><li>Para ello, diluir 2 μg de ADN plásmido o un volumen recomendado del reactivo de transfección en 100 μL de un medio apropiado (ver paso 2.3 y Tabla de materiales) en tubos separados, e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Mezclar 100 μL de cada solución de ADN plásmido con 100 μL de la solución de reactivo de transfección e incubar durante 20-45 min a temperatura ambiente para formar el complejo de reactivos de transfección de ADN.</li>
	</ol></li>
	<li>Mientras tanto, divida y agregue 3 x 105 células MDCK o A549 a 800 μL del medio de crecimiento completo, mezcle con 200 μL de complejo reactivo de transfección de ADN y agregue la suspensión de 1 ml a un pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos.</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera deCO2 al 5%.</li>
	<li>Después de 48 h, infectar las células con IAV como se describe en los pasos 1.4-1.9 (sin agregar los inhibidores).</li>
	<li>Después de 24 h, cosechar, procesar y analizar las células mediante Western blot (si corresponde, utilizando el anticuerpo contra una etiqueta de epítopo o GFP). Luego, mida y cuantifique la recuperación de proteínas como se describe en los pasos 1.10-1.20.</li>
</ol>

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</ol>

El autor no tiene conflictos de intereses que revelar.

Se establece que los virus adaptan los factores y vías del huésped para su beneficio. A su vez, las células huésped se resisten a eso empleando varias estrategias. Una de esas estrategias es la PANoptosis, que las células huésped utilizan como estrategia antiviral contra las infecciones por virus. Sin embargo, virus como IAV han desarrollado sus propias estrategias para contrarrestar la PANoptosis y explotarla en su beneficio 1,3,6.</...

El virus de la influenza A (IAV) es el miembro prototípico de la familia Orthomyxoviridae y se sabe que causa epidemias globales y pandemias impredecibles. IAV causa enfermedad respiratoria humana, gripe, comúnmente conocida como "gripe". La gripe es una enfermedad aguda que resulta en la inducción de respuestas inmunes innatas pro y antiinflamatorias del huésped y la muerte de las células epiteliales en el tracto respiratorio humano. Ambos procesos están gobernados por un fenómeno llamado muerte celular programada1. La señalización para la muerte celular programada se induce tan pronto como varios receptores de reconocimiento de patógenos detectan las partículas de virus entrantes en las células huésped. Esto conduce a la programación de la muerte de las células infectadas y la señalización a las células sanas vecinas por tres vías interconectadas llamadas piroptosis, apoptosis y necroptosis, recientemente acuñadas como un proceso, PANoptosis1.
La PANoptosis implica el procesamiento proteolítico de muchas proteínas del huésped y virales desde la inducción hasta la ejecución. Tal procesamiento de proteínas está encabezado principalmente por una familia de proteasas de cisteína llamadas caspasas 1,2. Se conocen hasta 18 caspasas (de caspasa 1 a caspasa 18)3. La mayoría de las caspasas se expresan como pro-caspasas y se activan al someterse a su propio procesamiento proteolítico, ya sea por autocatálisis u otras caspasas4 en respuesta a un estímulo como una infección viral. Se pensaba que la PANoptosis de las células infectadas por IAV era un mecanismo de defensa del huésped, pero IAV ha desarrollado formas de evadirlo y explotarlo para facilitar su replicación 1,2,5,6. Uno de ellos es antagonizar los factores del huésped a través de la escisión o degradación mediada por caspasa que son inherentemente antivirales o interfieren con uno de los pasos del ciclo de vida del IAV. Con este fin, se ha descubierto que los factores del huésped, cortactina, HDAC4 y HDAC6 sufren escisión o degradación mediada por caspasa en células epiteliales infectadas por IAV 7,8,9. El HDAC4 y el HDAC6 son factores anti-IAV 8,10, y la cortactina interfiere con la replicación del IAV en una etapa posterior de la infección, potencialmente durante el ensamblaje viral y la gemación11.
Además, también se activan varias caspasas, que, a su vez, escinden múltiples proteínas para activar la respuesta inflamatoria del huésped durante la infección por IAV 1,2. Además, la nucleoproteína (NP), la proteína M2 del canal iónico de IAV 12,13,14 y varias proteínas de otros virus 3,15,16 también sufren escisión mediada por caspasa durante la infección, lo que influye en la patogénesis viral. Por lo tanto, existe una necesidad continua de estudiar la escisión mediada por caspasa o la degradación de las proteínas del huésped y virales durante el IAV y otras infecciones virales para comprender las bases moleculares de la patogénesis viral. En este documento, los métodos se presentan para (1) evaluar la escisión o degradación de dichas proteínas por caspasas, (2) identificar esas caspasas, y (3) localizar los sitios de escisión.

<table><tbody><tr><td>Células A549</td><td>ATCC</td><td>CRM-CCL-185</td><td>Humano, epitelial, pulmonar</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de caspasa 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>264156-M</td><td>También conocido como 'InSolution Inhibidor de caspasa-3 II - Calbiochem'cOmplete</td></tr><tr><td>, Mini Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Roche</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-NP anticuerpo</td><td></td><td></td><td>Regalo de Richard Webby (St Jude Children' s Research Hospital, Memphis, EE. UU.) a MH</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Reactivo de transfección</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Células MDCK ATCC</td><td></td><td>CCL-34</td><td>Perro, epitelial, de riñón</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7449</td><td></td></tr><tr><td>Mínimo esencial Medio (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11095080</td><td>Agregue L-glutamina, antibióticos u otros suplementos según sea necesario</td></tr><tr><td>MISSION siRNA Universal Negative Control #1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIC001</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc imager con software Image Studio Lite 5.2&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td></td><td>Odyssey Fc ha sido reemplazado por Odyssey XF y el software Image Studio Lite ha sido reemplazado por el software Empiria Studio.</td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas BCA Pierce</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Plásmido que expresa la fusión de cortactina-GFP humana&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>50728</td><td>Regalo de Kenneth Yamada a Addgene</td></tr> ARN <tr><td>interferente pequeño (siRNA) prediseñado para caspasa 3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_004346</td><td>siRNA ID: SASI_Hs01_00139105</td></tr> ARN <tr><td>interferente pequeño prediseñado para caspasa 6</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_001226</td><td>siRNA ID: SASI_Hs01_00019062</td></tr><tr><td>ARN interferente pequeño prediseñado para caspasa 7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NM_001227</td><td>ID de siRNA: SASI_Hs01_00128361</td></tr><tr><td>Pares de cebadores SYBR Green RT-qPCR prediseñados ID de pares de</td> cebadores <td>KSPQ12012 Sigma-Aldrich</td><td></td><td>: H_CASP3_1; H_CASP6_1; H_CASP7_1</td></tr><tr><td>Protran Membrana de nitrocelulosa premium</td><td>Cytiva (Fomerly GE Healthcare)</td><td>10600003</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo antiactina</td><td>para conejo Abcam</td><td>ab8227</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-cortactina para conejo</td><td>Cell Signaling</td><td>3502</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-GFP para conejos</td><td>Takara</td><td>632592</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Estándar de proteínas preteñidas ThermoFisher</td><td> Scientific</td><td>LC5625</td><td></td></tr><tr><td>Medio de transfección, Opti-MEM,</td><td>ThermoFisher, Scientific</td><td></td>, 11668019 <td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, NaCl, SDS, desoxicolato de sodio, Triton X-100</td>, <td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, tripsina, Sigma-Aldrich tratado con TPCK,</td><td></td><td>4370285</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza a

Identifying Caspases and their Motifs that Cleave Proteins During Influenza A Virus Infection

Las caspasas, una familia de proteasas de cisteína, orquestan la muerte celular programada en respuesta a diversos estímulos, incluidas las infecciones microbianas. Inicialmente descrito como que ocurre por apoptosis, ahora se sabe que la muerte celular programada abarca tres vías interconectadas: piroptosis, apoptosis y necroptosis, acuñadas juntas como un proceso, PANoptosis. La infección por el virus Influence A (IAV) induce PANoptosis en células de mamíferos al inducir la activación de diferentes caspasas, que, a su vez, escinden varias proteínas del huésped y virales, lo que lleva a procesos como la activación de la respuesta antiviral innata del huésped o la degradación de proteínas antagónicas del huésped. En este sentido, se ha descubierto escisión mediada por caspasa 3 de la cortactina del huésped, la histona desacetilasa 4 (HDAC4) y la histona desacetilasa 6 (HDAC6) en células epiteliales animales y humanas en respuesta a la infección por IAV. Para demostrarlo, se emplearon inhibidores, interferencia de ARN y mutagénesis dirigida al sitio y, posteriormente, se midió la escisión o resistencia a la escisión y la recuperación de los polipéptidos cortactina, HDAC4 y HDAC6 mediante western blotting. Estos métodos, junto con RT-qPCR, forman una estrategia simple pero efectiva para identificar el huésped, así como las proteínas virales que experimentan escisión mediada por caspasa durante una infección de IAV u otros virus humanos y animales. En el presente protocolo se elaboran los resultados representativos de esta estrategia, y también se examinan las formas de hacerla más eficaz.

Tratamiento con inhibidor de caspasa 3 Se ha descubierto que los polipéptidos cortactina del huésped, HDAC4 y HDAC6 sufren degradación en respuesta a la infección por IAV tanto en células caninas (MDCK) como humanas (A549, NHBE) 7,8,9. Mediante el uso de los enfoques anteriores, se descubrió que las caspasas del huésped inducidas por IAV, particularmente la caspasa 3, causan su degrada...

La infección por el virus de la influenza A (IAV) activa las caspasas que escinden las proteínas del huésped y virales, que, a su vez, tienen funciones pro y antivirales. Mediante el empleo de inhibidores, interferencia de ARN, mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de Western blotting y RT-qPCR, se identificaron caspasas en células de mamíferos infectadas que escinden cortactina del huésped e histonas desacetilasas.

Identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza A

Caspases, a family of cysteine proteases, orchestrate programmed cell death in response to various stimuli, including microbial infections. Initially ...

Este método ayudará a determinar y confirmar si una proteína en las células infectadas por el virus de la influenza sufre degradación o escisión por caspasas e identificar los sitios de escisión de caspasas. Este método requiere solo entornos básicos de laboratorio de biología molecular y celular y habilidades de investigación y no requiere ningún equipo especializado o capacitación en software. Este método se puede adaptar para lograr objetivos similares que implican la infección con otros virus o microbios animales, y la exposición a estímulos externos, como toxinas y productos químicos.Para comenzar, siembre células MDCK o A549 en una placa de cultivo celular de 12 pocillos. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5%. Al día siguiente, retire el medio de cultivo viejo de las células y lave las células en cada pocillo dos veces con un mililitro de MEM sin suero.Luego, infecte las células agregando 400 microlitros de inóculo del virus de la influenza A y coloque la placa para la incubación durante una hora. Después de la incubación, retire el inóculo del virus y lave las células con MEM. Agregue un mililitro de MEM sin suero a cada pocillo e incube las células como se muestra en el paso anterior.Después de 24 horas, cosecha las células raspándolas con un émbolo de jeringa de un mililitro y transfiérelas a un tubo de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo a 12, 000G durante dos minutos a temperatura ambiente y recoger el sobrenadante. Lave el pellet celular con 250 microlitros de solución salina tamponada con fosfato y centrífuga.Retire el sobrenadante y agregue 100 microlitros de tampón de lisis celular. Mezclar por vórtice. Caliente el tubo a 98 grados centígrados durante 10 minutos para lisar completamente las células.Luego, resuelva cantidades iguales de proteína de muestras no infectadas e infectadas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS estándar. Después de la electroforesis, transfiera el gel de proteína a una membrana de nitrocelulosa o PVDF y realice Western blotting. Compare los niveles de proteína en los carriles de muestra infectados tratados con simulacros y tratados con inhibidores.En 100 microlitros de medio apropiado, como Opti-MEM, diluir 100 nanomolares de control o caspasa siRNA, o volumen apropiado de reactivo de transfección. Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mezclar 100 microlitros de cada solución de ARNip con 100 microlitros de solución de reactivo de transfección e incubar durante 20 a 45 minutos a temperatura ambiente.Divida y agregue 100, 000 células MDCK o A549 en 800 microlitros del medio de crecimiento completo. Agregue 200 microlitros de complejo de reactivos de transfección de ARNip y agregue esta suspensión a una placa de cultivo de 12 pocillos. Incubar las células a 37 grados centígrados bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante 72 horas.Infectar las células con el virus de la influenza A, pero sin inhibidores. Realice Western blot y compare los niveles de proteína como se mostró anteriormente. Localice los motivos de escisión de caspasa XXXD y DXXD en el polipéptido.Mutar el ácido aspártico P1, dos ácidos glutámicos o alanina por mutagénesis dirigida al sitio y confirmar mediante secuenciación de ADN. En 100 microlitros de un medio apropiado, diluir dos microgramos de ADN plasmático de tipo salvaje o mutante o volumen recomendado del reactivo de transfección e incubar los tubos durante cinco minutos a temperatura ambiente. Mezclar 100 microlitros de solución de ADN plasmático con 100 microlitros de la solución de reactivo de transfección e incubar durante 20 a 45 minutos a temperatura ambiente.Mientras tanto, divida y agregue 300, 000 células MDCK o A549 a 800 microlitros de medio de crecimiento completo. Agregue 200 microlitros de complejo de reactivo de transfección de ADN y agregue esta suspensión a una placa de cultivo de 12 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados bajo una atmósfera de dióxido de carbono al 5%.Después de 48 horas, infecte las células con el virus de la influenza A sin inhibidores. Realice Western blot y compare los niveles de proteína como se mostró anteriormente. Usando Western blotting, se evaluó la degradación de la cortactina del huésped por caspasas del huésped inducidas por la influenza.El tratamiento de las células infectadas por el virus de la influenza con un inhibidor de la caspasa-3 resultó en el rescate de la cortactina y la degradación viral de la NP. La cuantificación de la intensidad de las bandas de cortactina y su normalización con la banda de actina correspondiente mostró que el nivel de cortactina en las células infectadas tratadas con inhibidores de caspasa-3 era mayor en comparación con las células infectadas no tratadas. En células agotadas de caspasa-6 o caspasa-7.No se observó una recuperación significativa en los niveles de polipéptido cortactina, mientras que en las células agotadas en caspasa-3, la cortactina se recuperó de la degradación inducida por el virus de la gripe. La cuantificación y comparación de los niveles de polipéptidos mostró que el nivel de polipéptido de cortactina en células infectadas con expresión de caspasa-3 agotada fue mayor que las células con expresión normal de caspasa-3. La mutación del ácido aspártico en la posición 116 a ácido glutámico hizo que el polipéptido cortactina fuera resistente a la degradación inducida por el virus de la gripe.La cuantificación y comparación de los niveles de polipéptidos mostró que el nivel de polipéptido de cortactina mutante en las células infectadas era mayor que el del polipéptido de cortactina de tipo salvaje. Se requiere generar decenas de mutantes y realizar Western blot repetido para identificar el sitio de escisión de la caspasa en el polipéptido. Se podría desarrollar un ensayo bioquímico in vitro que contenga caspasa purificada y polipéptido objetivo para confirmar que la proteína de interés es un sustrato directo a base de gas.Este protocolo ayudará a comprender la importancia, la degradación o la escisión de la proteína diana en el sistema que se está estudiando, como una infección por virus o una enfermedad.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Los virus de influenza replicar su genoma de ARN, en asociación con la cromatina de la célula huésped. A continuación, presentamos un método para purificar intactas ribonucleoprotein complejos virales de la cromatina de las células infectadas. Purificada complejos virales pueden ser analizados por tanto Western blot y extensión del cebador de contenido de proteínas y ARN, respectivamente.

Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Este video muestra la evaluación de múltiples activaciones de caspasas en macrófagos derivados de la médula ósea a través de la estimulación con el virus de la influenza. Tras la lisis de macrófagos, la inactivación térmica del lisado y la centrifugación, se recogen caspasas intracelulares para su posterior análisis inmunológico.

Evaluación de la activación de múltiples caspasas en macrófagos

El video muestra un método para evaluar la escisión de proteínas mediada por caspasas en células infectadas por virus. Después de la infección viral, las caspasas se activan y degradan varias proteínas celulares del huésped y nucleoproteínas virales, mientras que los inhibidores específicos de caspasas evitan esta degradación, como lo confirma el Western blot.

Evaluación de la escisión de proteínas virales y del huésped mediada por caspasas en células infectadas por virus

El desmontaje de los núcleos del virus de la influenza A durante la entrada del virus en las células huésped es un proceso de varios pasos. Describimos un método in vitro para analizar las primeras etapas del desenmascaramiento viral. En este enfoque, la centrifugación en gradiente de velocidad se utiliza para diseccionar bioquímicamente los pasos que inician el desrecubrimiento en condiciones definidas.

In Vitro El desmontaje de virus de influenza A cápsides por centrifugación en gradiente

Este protocolo describe caspasa complementación Bimolecular de la fluorescencia (centro); un método basado en la proyección de imagen que se puede utilizar para visualizar la proximidad inducida de las caspasas de iniciador, que es el primer paso para su activación.

Iluminación de las vías para la activación de caspasas mediante complementación Bimolecular de la fluorescencia

Presentamos un ensayo de clivaje fluorógenos péptido que permite una rápida detección de la actividad proteolítica de las proteasas en péptidos que representan el sitio de clivaje de péptidos de fusión viral. Este método puede utilizarse también en cualquier otro motivo del aminoácido dentro de una secuencia de la proteína para probar la actividad de proteasa.

Un ensayo de escote de péptido fluorógenos para detectar actividad proteolítica: aplicaciones para coronavirus punto de activación de la proteína

Presentamos un protocolo general para identificar tramos cortos de secuencias de proteínas homolopégicos de patógenos de host (SSHHPS) incrustadas en la poliproteína viral. SSHHPS son reconocidos por proteasas virales y dirigen la destrucción dirigida de proteínas huésped específicas por varios virus del Grupo IV.

Análisis de SSHHPS Viral del Grupo IV utilizando métodos In Vitro y In Silico

Este protocolo describe el flujo de trabajo para obtener macrófagos derivados de monocitos (MDM) a partir de muestras de sangre humana, un método simple para introducir eficientemente reporteros de complementación de fluorescencia bimolecular de caspasa inflamatoria (BiFC) en MDM humanos sin comprometer la viabilidad y el comportamiento celular, y un enfoque basado en imágenes para medir la activación de la caspasa inflamatoria en células vivas.

Visualización de la proximidad inducida por caspasas inflamatorias en macrófagos derivados de monocitos humanos

Este protocolo describe un método integral para evaluar la activación de caspasas (caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-11) en respuesta a modelos de infección, insultos estériles y cáncer tanto in vitro como in vivo (en ratones) para determinar el inicio de vías de muerte celular, como piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis.

Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata

Aquí presentamos un protocolo para expresar y purificar las caspasas recombinantes de Drosophila Dronc y Drice, y su uso en ensayos de escisión in vitro .

In vitro Ensayos de escisión utilizando Caspasas de Drosophila recombinantes purificadas para cribado de sustrato

El presente protocolo describe dos métodos para medir la actividad de las caspasas a través de un sustrato fluorogénico utilizando citometría de flujo o un espectrofluorómetro.

Medición de la actividad de las caspasas mediante un ensayo fluorométrico o citometría de flujo

Aprende a identificar caspasas y sus sitios de escisión en proteínas durante la infección por virus de la influenza A. Este método utiliza células MDCK y A549 para estudiar la patogénesis viral y desarrollar posibles dianas terapéuticas.

Identificación de caspasas y sus motivos que escinden proteínas durante la infección por el virus de la influenza A

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