Protocolos para la mutagénesis CRISPR/Cas9 de la mosca oriental de la fruta Bactrocera dorsalis

La mosca oriental de la fruta es una especie plaga altamente invasiva y adaptativa. Los métodos efectivos para la investigación genética funcional podrían ayudarnos a desarrollar estrategias de manejo de plagas respetuosas con el medio ambiente. Este método es de alta eficiencia y bajo costo.

Nuestro protocolo servirá como una guía útil para generar moscas mutantes para los investigadores de moscas orientales de la fruta. Para empezar, predecir la estructura de los genes diana de interés y determinar los límites entre exones e intrones mediante el análisis bioinformático del genoma de Bactroceras dorsalis. Utilice el kit de síntesis de ARNg disponible comercialmente para generar el ARNg diseñado.

Resuspender el producto de ARNg en agua libre de nucleasas. Cuantifique la concentración utilizando un espectrofotómetro UV-visible y guárdela a 80 grados centígrados antes de su uso. Coloque las pupas de B.dorsalis en una jaula de plástico, con una condición de crianza del 55% de humedad relativa, 26.5 grados centígrados y un ciclo de luz / día de 14:10.

Cuando los adultos cierren, proporcione una mezcla de azúcar y levadura como alimento junto con agua. La mayoría de los adultos alcanzan la madurez sexual 10 días después de la emergencia. Utilice un soporte de luz con una luz de 30 a 50 lux para mejorar la fecundidad de las hembras, por lo tanto, mejorar la eficiencia de la recolección de embriones.

Luego, coloque una gasa de malla 200 en la cámara de oviposición, aproximadamente de 1 a 2 milímetros de distancia de la tapa de la cámara. Coloque una nueva cámara de oviposición en la jaula cuando la configuración de microinyección esté lista. Recoja los embriones cada 10 minutos con un cepillo fino y húmedo y alinearlos en una placa de inyección hecha por él mismo.

Sumerja los embriones en aceite de halocarbono durante la inyección para evitar una mayor desecación. Preparar la solución de trabajo mezclando la proteína Cas9 y el sgRNA correspondiente a una concentración de 300 nanogramos por microlitros de cada uno. Luego, agregue 1 microlitro de rojo fenol a la mezcla para que sirva como una forma conveniente de marcar los embriones inyectados.

Coloque la mezcla preparada en hielo para evitar la degradación del sgRNA. Prepare la aguja de inyección de vidrio con un extractor de micropipetas. Añadir 3 microlitros de la mezcla en la aguja de inyección sin introducir burbujas de aire.

Luego, abra la aguja con un Microgrinder y conéctela al micromanipulador de acuerdo con la guía del usuario. Establezca los parámetros para el inyector como Pi a 500 hectopascales. Ti a 0,5 segundos, y PC a 200 hectopascales.

Coloque el plato con embriones alineados en la mesa objetivo. A continuación, ajuste la posición de la micropipeta bajo un microscopio óptico fino, colocando la micropipeta y el embrión en el mismo plano. Inserte la punta de la aguja en el polo posterior, o vegetal, del embrión.

Luego, presione el pedal del inyector para administrar las mezclas en el embrión. La aparición de un ligero color rojizo se debe a la adición de rojo fenol en la mezcla. Coloque la placa de inyección con los embriones inyectados en una cámara climática artificial.

Después de 36 horas, transfiera las larvas eclosionadas a la dieta larvaria con un cepillo de punta fina. Recoja las larvas tres o cuatro veces al día hasta que no eclosionen más larvas. A continuación, coloque las larvas maduras en la arena húmeda para pupar.

La etapa de pupación dura 10 días. Después de la pupación, mueva las pupas a una jaula de plástico antes de que comience la eclosión. Después de aislar el ADN genómico de un pupario fresco o de una sola pierna media de adultos individuales y diseñar los cebadores específicos para amplificar el área objetivo, realice la reacción en cadena de la polimerasa, o PCR, siguiendo las condiciones de ciclo descritas en el texto manuscrito.

Luego, secuencie los productos de PCR purificados. La detección de múltiples picos superpuestos adyacentes al sitio objetivo sugiere una mutagénesis exitosa. Para la subclonación, mezcle los productos de PCR purificados con un vector romo y ligarlos a 25 grados centígrados durante 15 minutos.

Luego, agregue células trans-T1 y colóquelo en hielo durante 30 minutos. Luego, agregue 500 microlitros de LB medio e incube a 37 grados centígrados durante 1 hora con agitación. Centrifugar y desechar el sobrenadante.

Vuelva a suspender el pellet y extiéndalo en una placa LB. Coloque la placa para la incubación durante la noche a 37 grados centígrados. Luego, seleccione colonias bacterianas individuales para la secuenciación para verificar el genotipo de los mutantes.

En este estudio, el ejemplo del sitio objetivo del gen seleccionado se encuentra en el tercer exón. El sitio objetivo está altamente conservado, y se detectó una sola banda mediante electroforesis en gel para la plantilla de ADN para ARNg sintético y ARNg obtenido en transcripción in vitro. La supervivencia de B.dorsalis y la mutagénesis después de las microinyecciones se muestran aquí.

Después de secuenciar los productos de PCR, el 80% de los individuos G0 son mutantes en mosaico. En la detección de mutantes, el mutante con deleción de 8 pares de bases resultó en la terminación prematura de la traducción de aminoácidos. Insertar la aguja en el área posterior o polo vegetal de un embrión es un paso central porque esto afecta directamente la supervivencia de los óvulos.

Esta tecnología proporciona una referencia para estudiar áreas de funciones génicas en B.Dorsalis que pueden capturar rápidamente los mutantes que desean a través de este método.