Name: Un método visual sensible para la detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: Aprende un método visual sensible para detectar bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno mediante precipitación de sulfuro de bismuto modificado en placas de microtitulación. Esta técnica accesible permite identificar cepas como Fusobacterium nucleatum y Proteus vulgaris sin equipos especializados.

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Este estudio fue apoyado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD) y el Proyecto de Investigación de Reforma Docente de la Universidad Farmacéutica de China (2019XJYB18).

1. Cepas bacterianas
NOTA: Para este experimento, se utilizaron nueve cepas estándar, incluyendo Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1, Proteus vuigis y Klebsiella pneumoniae (Tabla 1). Salmonella paratyphi A, Fusobacterium nucleatum, Pseudomonas aeruginosa y Proteus vuigaris pueden producirH2S, como se describe en la literatura previa1.
<ol><li>Preparación de cultivo bacteriano<ol><li>Transferir una colonia bacteriana de Salmonella paratyphi A, Salmonella paratyphi B, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa PAO1, Aeromonas hydrophila YJ-1 y Klebsiella pneumoniae de una placa de agar Luria-Bertani (LB) a 100 ml de medio LB y cultivar a 37 °C durante 12-16 h hasta que la concentración bacteriana sea de aproximadamente 1 x 109 células/ml (como lo indica el OD600 = 1). </li>
		<li>Transfiera una colonia bacteriana de Fusobacterium nucleatum y Proteus vuigaris de las placas de agar caldo de soja tripticasa (TSB) a 100 ml de medio TSB y cultive anaeróbicamente a 37 °C durante 24 h hasta que la concentración bacteriana sea de aproximadamente 1 x 109 células/ml (como lo indica el OD600 = 1).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Ensayo de detección deH2S
<ol><li>Prueba de producción de sulfuro de hidrógeno<ol><li>Mezclar 100 μL de cultivo bacteriano con 100 μL de solución de bismuto recién preparada (pH 8,0; cloruro de bismuto (III) de 10 mM, trietanolamina-HCl 0,4 M, piridoxal 5-fosfato monohidrato de 20 mM, EDTA de 20 mM y L-cisteína de 40 mM) en las placas de microtitulación de 96 pocillos y cultivar durante 20 min a 37 °C. Para cada cepa bacteriana, realizar el análisis por triplicado.</li>
		<li>Después de 20 minutos, compruebe si hay cambio de color. Si el color de la solución cambia de amarillo claro a negro, esto indica que la bacteria es capaz de producirH2S. Repita esta medición 3x.</li>
	</ol></li>
	<li>Sensibilidad del método<ol><li>Determinar la sensibilidad del método utilizando diferentes concentraciones de hidrosulfuro de sodio (NaHS): 2 mM, 1 mM, 0,8 mM, 0,6 mM, 0,4 mM, 0,2 mM, 0,1 mM y 0 mM, mezclado con solución BS 14.</li>
		<li>Determinar la presencia de HS−/S2− observando la formación de un precipitado negro de BS. Puntúe el color de los pozos utilizando una escala visual desde ninguna producción de color (-) hasta la producción de color negro más oscuro (++++++).</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Ono, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cysteine+hydropersulfide+inactivates+%CE%B2-lactam+antibiotics+with+formation+of+ring-opened+carbothioic+s-acids+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cysteine hydropersulfide inactivates β-lactam antibiotics with formation of ring-opened carbothioic s-acids in bacteria.</a> ACS Chemical Biology. 16 (4), 731-739 (2021).</li>
<li>Mironov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+H2S-mediated+protection+against+oxidative+stress+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanism of H2S-mediated protection against oxidative stress in Escherichia coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (23), 6022-6027 (2017).</li>
<li>Shen, Y., Shen, Z., Luo, S., Guo, W., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardioprotective+effects+of+hydrogen+sulfide+in+heart+diseases%3A+From+molecular+mechanisms+to+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">The cardioprotective effects of hydrogen sulfide in heart diseases: From molecular mechanisms to therapeutic potential.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2015, 925167(2015).</li>
<li>Salloum, F. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+and+cardioprotection-mechanistic+insights+and+clinical+translatability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide and cardioprotection-mechanistic insights and clinical translatability.</a> Pharmacology & Therapeutics. 152, 11-17 (2015).</li>
<li>Wallace, J. L., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide-based+therapeutics%3A+Exploiting+a+unique+but+ubiquitous+gasotransmitter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide-based therapeutics: Exploiting a unique but ubiquitous gasotransmitter.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 14 (5), 329-345 (2015).</li>
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<li>Truong, D. H., Eghbal, M. A., Hindmarsh, W., Roth, S. H., O'Brien, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+hydrogen+sulfide+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+Reviews%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of hydrogen sulfide toxicity.</a> Drug Metabolism Reviews. 38 (4), 733-744 (2006).</li>
<li>Shatalin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+bacterial+H2S+biogenesis+targeting+antibiotic+resistance+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of bacterial H2S biogenesis targeting antibiotic resistance and tolerance.</a> Science. 372 (6547), 1169-1175 (2021).</li>
<li>Frávega, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+Typhimurium+exhibits+fluoroquinolone+resistance+mediated+by+the+accumulation+of+the+antioxidant+molecule+H2S+in+a+CysK-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Salmonella Typhimurium exhibits fluoroquinolone resistance mediated by the accumulation of the antioxidant molecule H2S in a CysK-dependent manner.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (12), 3409-3415 (2016).</li>
<li>Luhachack, L., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+gasotransmitters%3A+An+innate+defense+against+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial gasotransmitters: An innate defense against antibiotics.</a> Current Opinion in Microbiology. 21, 13-17 (2014).</li>
<li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+production+from+cysteine+and+homocysteine+by+periodontal+and+oral+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontology%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide production from cysteine and homocysteine by periodontal and oral bacteria.</a> Journal of Periodontology. 80 (11), 1845-1851 (2009).</li>
<li>Basic, A., Blomqvist, S., Carlén, A., Dahlén, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+bacterial+hydrogen+sulfide+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Estimation of bacterial hydrogen sulfide production in vitro.</a> Journal of Oral Microbiology. 7, 28166(2015).</li>
<li>Rosolina, S. M., Carpenter, T. S., Xue, Z. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bismuth-based%2C+disposable+sensor+for+the+detection+of+hydrogen+sulfide+gas%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bismuth-based, disposable sensor for the detection of hydrogen sulfide gas.</a> Analytical Chemistry. 88 (3), 1553-1558 (2016).</li>
<li>Barton, L. L., Fauque, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%2C+physiology+and+biotechnology+of+sulfate-reducing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biochemistry, physiology and biotechnology of sulfate-reducing bacteria.</a> Advances in Applied Microbiology. 68, 41-98 (2009).</li>
<li>Shatalin, K., Shatalina, E., Mironov, A., Nudler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2S%3A+A+universal+defense+against+antibiotics+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">H2S: A universal defense against antibiotics in bacteria.</a> Science. 334 (6058), 986-990 (2011).</li>
<li>Schnabel, B., Caplin, J. L., Cooper, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+H2S+test+to+screen+for+the+detection+of+sulphur-+and+sulphate-reducing+bacteria+of+faecal+origin+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Supply%22%5BJournal%5D)">Modification of the H2S test to screen for the detection of sulphur- and sulphate-reducing bacteria of faecal origin in water.</a> Water Supply. 21 (1), 59-79 (2021).</li>
<li>Netzer, R., Ribičić, D., Aas, M., Cavé, L., Dhawan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+of+priority+bacteria+in+aquaculture+using+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR.</a> Journal of Microbiological Methods. 183, 106171(2021).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

La prueba de producción de sulfuro de hidrógeno es una de las pruebas fenotípicas convencionales para la identificación y diferenciación de cepas bacterianas. Muchas especies bacterianas pueden producir sulfuro de hidrógeno en su entorno natural, como el agua acuática. Estas especies bacterianas incluyen Salmonella sp., Citrobacter sp., Proteus sp., Pseudomonas sp., algunas cepas de Klebsiella sp., Escherichia coli, y algunas especies de Clostridia15...

Las bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno pueden utilizar aminoácidos y proteínas que contienen azufre para producir sulfuro de hidrógeno (H2S). La producción deH2Socurre generalmente en bacterias gramnegativas de la familia Enterobacteriaceae y también en miembros de Citrobacter spp., Proteus spp., Edwardsiella spp. y Shewanella spp.1. Estas bacterias tienen la capacidad de reducir el sulfato en sulfuro de hidrógeno (H2S) para obtener energía. El sulfuro de hidrógeno ha sido implicado en el desarrollo de resistencia bacteriana a los medicamentos. H2Sprotege a las bacterias de la toxicidad de las especies reactivas de oxígeno (ROS), antagonizando así el efecto antibacteriano de los antibióticos 2,3. H2Stambién tiene un efecto fisiológico importante en el mantenimiento de la homeostasis. A niveles suprafisiológicos, se ha demostrado que elH2Ses profundamente tóxico para el cuerpo. En el cuerpo humano,H2Stiene otro papel como molécula de señalización de gas que está involucrada en una variedad de procesos fisiológicos y patológicos. H2Spuede regular la función sistólica del corazón y desempeña un papel fisiológico importante en la relajación de los vasos sanguíneos, la inhibición de la remodelación vascular y la protección del miocardio 4,5. ElH2Stambién juega un papel importante en la regulación del sistema nervioso y del tracto digestivo 6,7. Se ha encontrado que, cuando se exponen a antibióticos bactericidas, las bacterias producen especies letales reactivas de oxígeno (ROS) que conducen a la muerte celular 8,9,10,11.
Como una prueba bioquímica común en cursos de laboratorio microbiológico, la prueba de sulfuro de hidrógeno es un experimento importante en la identificación de bacterias, especialmente bacterias de la familia Enterobacteriaceae. En la actualidad, la prueba de sulfuro de hidrógeno generalmente se realiza en una gran cantidad de aminoácidos que contienen azufre y medio de acetato de plomo inoculados con las bacterias a probar. Después de un período de incubación (2-3 días), los resultados se juzgan observando si el medio de cultivo o la tira de papel de acetato de plomo se ennegrece debido a la producción de acetato de plomo11. Sin embargo, estos métodos tradicionales no solo son tediosos y lentos, sino que también son propensos a la inhibición del crecimiento bacteriano debido al efecto tóxico de las sales de metales pesados en el medio que contiene azufre, lo que a menudo conduce a resultados negativos. Se ha establecido un método basado en bismuto para la detección de H2S12,13. H2Spuede reaccionar con el bismuto, formando precipitación de sulfuro de bismuto negro. Para llevar a cabo una reforma para esta prueba bioquímica, se debe establecer un método simple y rápido sin efectos secundarios sobre el crecimiento bacteriano. Aquí, establecimos un método simple para la detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno cultivadas en un ambiente in vitro utilizando sulfuro de bismuto como sustrato en un formato de placa de microtitulación de 96 pocillos.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de bismuto (III)</td><td>Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd</td><td>7787-60-2</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>Enterococcus faecalis&nbsp; </td><td>ATCC&nbsp;</td><td>19433</td><td></td></tr><tr><td>Fusobacterium&nbsp; nucleatum&nbsp; </td><td>ATCC&nbsp;</td><td>25586</td><td></td></tr><tr><td>Klebsiella pneumoniae&nbsp; </td><td>ATCC&nbsp;</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>L-cisteína</td><td>Amresco</td><td>52-90-4</td><td></td></tr><tr><td>Proteus&nbsp; vuigaris&nbsp; </td><td>CMCC&nbsp;</td><td>49027</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella paratyphi A</td><td>CMCC</td><td>50001</td><td></td></tr><tr><td>Salmonella paratyphi B</td><td>CMCC</td><td>50094</td><td></td></tr><tr><td>Staphylococcus&nbsp; aureus&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>25923</td><td></td></tr><tr><td>Trietanolamina-HCl</td><td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>637-39-8</td><td></td></tr></tbody></table>

un método visual sensible para la detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno

A Sensitive Visual Method for the Detection of Hydrogen Sulfide Producing Bacteria

El sulfuro de hidrógeno (H2S) es un gas tóxico producido por bacterias en la proteólisis de aminoácidos y proteínas que contienen azufre que desempeña un papel importante en la salud humana. La prueba de producción deH2Ses una de las pruebas de identificación bioquímica bacteriana importantes. Los métodos tradicionales no solo son tediosos y lentos, sino que también son propensos a la inhibición del crecimiento bacteriano debido al efecto tóxico de las sales de metales pesados en el medio que contiene azufre, lo que a menudo conduce a resultados negativos. Aquí, establecimos un método simple y sensible para detectarH2Sen bacterias. Este método es una versión modificada de la precipitación de sulfuro de bismuto (BS) que utiliza placas de microtitulación transparentes de 96 pocillos. El cultivo bacteriano se combinó con una solución de bismuto que contenía L-cisteína y se cultivó durante 20 min, al final de los cuales se observó un precipitado negro. El límite de detección visual paraH2Sfue de 0,2 mM. Sobre la base del cambio de color visual, se puede lograr la detección simple, de alto rendimiento y rápida de las bacterias productoras deH2S. En resumen, este método se puede utilizar para identificar la producción deH2Sen bacterias.

Detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno La realización de la pruebaH2Sse investigó utilizando cultivos puros de cepas bacterianas seleccionadas, como se indica en la Tabla 1. Los resultados indicaron que Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa y Proteus vuigaris pueden producirH2Scon precipitado negro de BS, mientras que Salmonella paratyphi A, Staphy...

Aquí, presentamos un protocolo para detectar bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno con un protocolo modificado utilizado para la precipitación de sulfuro de bismuto (BS). Las ventajas clave de este método son que es fácil de evaluar y no requiere equipo especializado.

Un método visual sensible para la detección de bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno

Hydrogen sulfide (H2S) is a toxic gas produced by bacteria in the proteolysis of sulfur-containing amino acids and proteins that plays an important role ...

Las bacterias productoras de sulfuro de hidrógeno pueden utilizar aminoácidos y proteínas que contienen azufre para producir sulfuro de hidrógeno. Aquí, establecimos un método sensible y simple para detectar el sulfuro de hidrógeno en bacterias. Este método es una versión modificada de la precipitación de sulfuro de bismuto que utilizó placas de microtitulación transparentes de 96 pocillos.El cultivo de bacterias se combinó con una solución de bismuto que contenía L-cisteína y se cultivó durante 20 minutos, al final de los cuales se observó un precipitado negro. Demostrando los procedimientos estará Wei Zhu, un asistente de investigación de nuestro laboratorio. Comience transfiriendo las colonias bacterianas de una placa de agar Luria-Bertani o LB a 100 mililitros de medio LB, y cultive a 37 grados centígrados durante 12 a 16 horas hasta que la concentración bacteriana sea de aproximadamente mil millones de células por mililitro.Transfiera una colonia bacteriana de Fusobacterium nucleatum y Proteus vulgaris del caldo de soja tripticasa o las placas de agar TSB a 100 mililitros de medio TSB, y cultive anaeróbicamente a 37 grados centígrados durante 24 horas hasta que la concentración bacteriana sea de aproximadamente 1 mil millones de células por mililitro. Mezcle 100 microlitros de cultivo bacteriano con 100 microlitros de solución de bismuto recién preparada en las placas de microtitulación de 96 pocillos y cultive durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Para cada cepa bacteriana, realizar el análisis por triplicado.Después de 20 minutos, compruebe si hay cambio de color. Si el color de la solución cambia de amarillo claro a negro, esto indica que la bacteria es capaz de producir sulfuro de hidrógeno o H2S. Repita esta medición tres veces.Determinar la sensibilidad del método utilizando diferentes concentraciones de hidrosulfuro de sodio mezclado con solución de sulfuro de bismuto. Finalmente, determine la presencia de iones bisulfuro y sulfuro observando la formación de un precipitado de sulfuro de bismuto negro. Puntúe el color de los pozos utilizando una escala visual desde ninguna producción de color hasta la producción de color negro más oscuro.La realización de la prueba de sulfuro de hidrógeno se investigó utilizando cultivos puros de cepas bacterianas seleccionadas. Los resultados indicaron que Salmonella paratyphi B, Fusobacterium nucleatum, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa y Proteus vulgaris pueden producir sulfuro de hidrógeno con precipitado de sulfuro de bismuto negro. Mientras que Salmonella paratyphi A, Staphylococcus aureus, Aeromonas hydrophila y Klebsiella pneumoniae no mostraron ningún precipitado negro.La ventaja clave de este método es que es fácil de replicar y no requiere equipo especializado.

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