Evaluación y manipulación de la actividad neuronal mediante microscopía holográfica de dos fotones

Este protocolo proporciona información espacial temporal precisa sobre la neuroactividad. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de manipular y evaluar la neuroactividad con alta resolución temporal espacial. Puede ser útil para ilustrar los patógenos de los trastornos neuropsiquiátricos que conducen a anomalías en la actividad neuronal.

Este método se puede aplicar al estudio de las neuronas, así como la salud en los otros órganos. Demostrando el procedimiento estará Zhongtian Guo, estudiante graduado de doctorado de nuestro laboratorio. Un día después de la implantación de la placa de la cabeza administrar 1,32 miligramos por kilogramo de fosfato de sodio dexametasona por vía intraperitoneal una hora antes de la cirugía para evitar el edema cerebral.

Bajo un estereoscopio, realice una craneotomía circular de aproximadamente dos milímetros de diámetro utilizando un taladro dental. Para reducir el daño cerebral, opere el taladro dental cuidadosamente con un ligero movimiento constante y una ligera presión hacia abajo. Retire los fragmentos óseos varias veces utilizando un sistema de succión.

Después de extraer el fragmento de hueso, use un líquido cefalorraquídeo artificial o una solución ACSF para eliminar y lavar cualquier residuo que quede en la superficie del cerebro. Repita este procedimiento de limpieza varias veces para suprimir las reacciones inflamatorias. Usando un sistema de inyección de presión, establezca la presión adecuada para inyectar 500 nanolitros de solución AAV a través de un capilar de vidrio con un diámetro de punta de 10 a 20 micrómetros durante 10 minutos.

Si el nivel de la solución de AAV en el capilar de vidrio disminuye gradualmente, la solución de AAV se está administrando al cerebro. Deje el capilar de vidrio en su lugar durante 10 minutos adicionales para evitar el reflujo. Repita esto tres veces para administrar un total de 1,5 microlitros de solución AAV en el cerebro.

Aplique agarosa de bajo punto de fusión al 2% en la superficie cerebral de S1 usando una micropipeta, y luego coloque una ventana de vidrio sobre la craneotomía con dos vasos de cobertura. Presione el vidrio de la cubierta contra la agarosa mientras aún está líquida. Esto evita la formación de burbujas de aire en la agarosa.

Selle los bordes de la ventana craneal con cemento de resina adhesiva dental. Para calibrar el sistema de estimulación holográfica, coloque la superficie de un portaobjetos fluorescente rojo en el plano de muestra y coloque el microscopio en modo de imagen en vivo con una luz de excitación débil. Ejecute la GUI de calibración.

mfile, compruebe el panel de parámetros y haga clic en el botón Guardar. Haga clic en el botón Z Scan en el panel del paso uno si generará automáticamente tres puntos aleatorios en 21 planos axiales diferentes separados por dos micrómetros de cada plano. Mueva la barra deslizante y compruebe la imagen en vivo.

Encuentre el plano perfecto donde las manchas aparezcan más pequeñas y brillantes, y luego haga clic en el botón Guardar. Esto generará automáticamente un frente de onda esférico desplazado para el holograma digital. Haga clic en el botón Ir en el panel del paso dos y, a continuación, haga clic en seis puntos en el cuadrado izquierdo.

Comprueba la imagen en vivo. Si hay seis puntos fluorescentes distinguibles, escriba sus ejes x e Y en los cuadros de edición y haga clic en el botón Guardar. Esto generará automáticamente un coeficiente de transformación fina para coordinar la calibración entre la estimulación holográfica y el sistema de imágenes.

Luego, haga clic en el botón Escanear en el panel del paso tres. Generará 441 hologramas digitales para realizar un escaneo de un solo punto en todo el campo de visión en 21 por 21 pasos. Compruebe las imágenes mientras cambia los patrones en el cuadro de lista.

Ajuste la potencia del láser para obtener imágenes puntuales dentro del rango dinámico del dispositivo de imágenes. Ponga el dispositivo de imagen en modo de grabación y haga clic en el botón Reproducir. Una vez finalizada la reproducción, haga clic en Generar mapa de peso en el panel del paso cuatro y elija una imagen apilada.

A continuación, cierre la ventana GUI de calibración. Generará automáticamente un mapa de peso para compensar la intensidad desequilibrada en cada punto. Coloque el ratón inyectado con AAV con una placa de cabeza debajo del microscopio y realice imágenes de dos fotones utilizando un microscopio holográfico y un láser de zafiro de titanio bloqueado en modo sintonizado a 920 nanómetros con un objetivo de 25x.

Abra el software de imágenes comercial en el modo de imágenes en vivo. Ajuste el voltaje del detector de imágenes y la potencia del láser de imágenes para optimizar el brillo de las neuronas que expresan GCaMP8f. Captura imágenes de las neuronas que expresan esta proteína.

Para iluminar las neuronas específicas con iluminación holográfica, ejecute el SLMcontrol. m archivo de script. Haga clic en la imagen de referencia y elija la imagen adquirida.

Luego, haga clic en el botón Spot para elegir píxeles específicos en las neuronas de la imagen y presione el botón Enter en el teclado para finalizarlo. Para detectar actividad neuronal con alta resolución temporal utilizando un sensor de imagen, establezca el tiempo de exposición, el área de imagen y la agrupación, luego realice la adquisición de imágenes. Después de colocar el mouse bajo el microscopio y realizar imágenes de dos fotones, abra el software de imágenes comercial.

En el modo de imagen en vivo, ajuste el voltaje del detector de imágenes y la potencia del láser de imágenes para optimizar el brillo de las neuronas que expresan GCaMP-6m-p2A-ChRmine. Capture imágenes de las neuronas que expresan estas proteínas y luego ilumine las neuronas específicas siguiendo el procedimiento mostrado anteriormente. Para investigar la conectividad funcional dentro de las neuronas de la capa dos y tres, use un modulador de luz espacial para generar patrones holográficos de estimulación optogenética y combínelo con imágenes de calcio de dos fotones.

Ajuste la intensidad del láser de imágenes a 920 nanómetros a 10 a 20 milivatios y el campo de visión a 256 micrómetros por 256 micrómetros medidos a una profundidad de 100 a 150 micrómetros de la superficie cortical. Establezca el tiempo de permanencia de píxeles en 1,5 microsegundos para dos hercios o 100 nanosegundos para 30 hercios. Use dos hercios y 30 hercios como la velocidad de fotogramas de imagen para ver si un solo estímulo holográfico causó una respuesta de calcio en las neuronas.

Ajuste la intensidad del láser de estimulación holográfica que estimula una sola neurona a 10 milivatios, lo que es suficiente para inducir la actividad neuronal. Simultáneamente, obtenga una imagen de la respuesta de calcio hierro a 920 nanómetros con 10 estímulos holográficos a intervalos de 1040 nanómetros y ocho segundos durante una duración de 50 milisegundos después de un período de referencia de 10 segundos. Después de eso, devuelva el ratón a su jaula doméstica.

Aquí se muestra la imagen representativa y los rastros de neuronas que expresan GCaMP8f en imágenes de 100 hercios con estimulación holográfica y un sensor de imagen. Este gráfico muestra la respuesta neuronal a la estimulación holográfica en cada potencia láser. Aquí se presentan las trazas representativas de calcio 2 + durante la estimulación holográfica de 10 neuronas diferentes a velocidades de fotogramas de imágenes de dos hercios y 30 hercios.

El mismo color indica la misma neurona. Aquí se representa un diagrama esquemático que evalúa las conexiones funcionales entre las neuronas. Cuando se estimula la neurona naranja, las neuronas rojas responden al mismo tiempo indicando que existe conectividad funcional entre estas neuronas.

Aquí se muestra una imagen típica de las neuronas primarias de la corteza somatosensorial que expresan GCaMP6m en tipo salvaje. Estas imágenes gráficas representan las trazas típicas de calcio 2+ durante la estimulación holográfica a velocidades de fotogramas de imágenes de dos hercios y 30 hercios. La capacidad de respuesta neurológica a la estimulación holográfica se puede detectar a velocidades de imagen de dos hercios y 30 hercios.

Estos pasos son importantes para reducir el movimiento cerebral y dos, obtener resultados estables. Creemos que este microscopio puede inducir el comportamiento en la escritura de neuronas con patrones específicos. Con esta técnica, ahora podemos evaluar y manipular la actividad de las neuronas individuales y caracterizar la neuropsiquiatría en detalle.