Una plataforma de vacuna de nanopartículas "plug-and-display" basada en vesículas de membrana externa que muestran el dominio de unión al receptor SARS-CoV-2

La nanociencia puede mejorar eficazmente la respuesta inmune específica del antígeno después de mostrar antígenos en la superficie de La principal ventaja en esta plataforma de vacuna puede lograr la salida de la placa y la visualización. En otras palabras, la plataforma es capaz de mostrar la variedad de antígenos en Este método también se puede aplicar a otras nanopartículas biológicas para mostrar el motor a portadores de tamaño nanométrico. Para realizar la transformación del catéter espía de citolisina A, comience con la adición de cinco microlitros de solución plasmática a 50 microlitros de cepa competente BL 21.

Sople suavemente y deje enfriar en hielo durante 30 minutos. Coloque la solución durante 90 segundos en el baño de agua a 42 grados centígrados, y luego coloque inmediatamente la solución mezclada en hielo durante tres minutos. Añadir 500 microlitros de luria bertani medio a la suspensión bacteriana y después de mezclar el cultivo a 220 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados durante una hora.

A continuación, coloque toda la placa de agar transformación luria bertani que contiene ampicilina y cultive durante la noche a 37 grados centígrados. Para la producción de spcatcher OMV, comience aislando una sola colonia de la placa a 20 mililitros de medio luria bertani y cultive durante la noche a 220 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados. Incubar la solución bacteriana en un medio de dos litros y cultivar a 220 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados durante cinco horas hasta que se alcance la etapa de crecimiento logarítmico.

Agregue isopropil beta D-IPTG para que la concentración final de la solución bacteriana sea de 0.5 milimolar y luego cultive durante la noche a 220 rotaciones por minuto a 25 grados Celsius. A continuación, realice la purificación del cazador de espías OMV. Comience con centri fusionando la solución bacteriana.

Filtre el sobrenadante con un filtro de membrana de 0,22 micrómetros, luego concéntrelo usando una columna de fibra hueca. Filtrar el concentrado a través de un filtro de membrana de 0,22 micrómetros, luego centri fusionarlo a 150, 000 veces G a cuatro grados Celsius durante dos horas usando un fusible ultra centri y desechar el sobrenadante con una pipeta. Vuelva a suspender la precipitación con PBS y guárdela a menos 80 grados centígrados.

Para realizar la transfección de spytag RBD, comience con la selección de un sistema de expresión eucariota apropiado y cultive las células durante la noche a 130 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados después de la recuperación. Agregue 20 microlitros HEK 293F de solución celular en el contador celular automatizado. Registre el número de células, ajuste la concentración a una vez 10 a seis células por mililitro.

Y luego cultivar las células a 130 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Filtre el plásmido de etiqueta espía RBD a través de un filtro de membrana de 0,22 micrómetros y agregue 300 microgramos de plásmidos en el medio de cultivo celular hasta que el volumen final sea de 10 mililitros. Agitar durante 10 segundos.

Caliente PEI a 65 grados centígrados en el baño de agua. Mezcle 0.7 mililitros de PEI con 9.3 mililitros de medio de cultivo celular y agite intermitentemente durante 10 segundos. Agregue una solución plásmida a la solución PEI.

Agite la mezcla intermitentemente durante 10 segundos e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Agregue la mezcla a 280 mililitros de medio de cultivo celular y cultive a 130 rotaciones por minuto a 37 grados centígrados durante cinco días. A continuación, realice la purificación de spytag RBD.

Comience con centri fusionando las células a 6, 000 veces G a 25 grados Celsius durante 20 minutos, y use una pipeta para recoger el sobrenadante. Llene la columna con dos mililitros de agarosa NTA de níquel y lávela tres veces con PBS. Agregue imidazol en el sobrenadante celular para hacer la concentración final de 20 milimolar, y cargue el sobrenadante celular.

Agregue tres volúmenes de columna de PBS que contengan 20 milimolares de imidazol para lavar y recoja la fracción de lavado. Eluyente de gradiente con tres volúmenes de columna de PBS que contienen concentraciones bajas a altas de eluido de imidazol dos veces por cada concentración. Para determinar la concentración de proteína por el método BCA, diluya en serie la solución estándar de proteína BSA de dos a 0.0625 miligramos por mililitro, diluya el spy catcher OMV purificado y la etiqueta espía RBD 10 veces.

Luego mezcle las soluciones de trabajo BCA A y B en una proporción de 50 a uno. Agregue la solución de proteína diluida y mezcle con la solución de trabajo de BCA. Incubar a 37 grados durante 30 minutos.

Mida la absorbancia a 562 nanómetros de cada pocillo y calcule la concentración de proteína a partir de la curva estándar. Para realizar la bioconjugación de OMV spycatcher y RBD spy tag, mezcle OMV spycatcher y RBD spytag y PBS en una proporción de 40 a uno. Gire verticalmente para mezclar la mezcla durante la noche a 15 rotaciones por minuto a cuatro grados centígrados.

Realice la purificación de OMV RBD utilizando la solución PBS utilizando un procedimiento similar a la purificación del cazador de espías OMV. El esquema de diseño de plasma muestra que el gen spycatcher está conectado con el gen cly A a través de un enlazador flexible, mientras que el spytag se conecta a los cinco terminales principales del gen RBD con un gen hys tag para purificación y verificación. Después de la ultracentrifugación, casi todo el spytag RBD sin reaccionar permaneció en el sobrenadante.

La segunda ultracentrifugación no proporcionó una ventaja significativa adicional sobre la primera vez. El diámetro hidrodinámico promedio z del cazador de espías OMV fue de 133 nanómetros, mientras que fue de 152.6 nanómetros para OMV-RBD. Estas diferencias pueden deberse a que RBD aumenta el tamaño de partícula OMV después de una visualización intensiva.

Los resultados de TEM son consistentes con la distribución del tamaño de partícula obtenida de los resultados de DLS. La rotación para mezclar la mezcla es muy importante. La eficiencia de la reacción puede ser mucho menor sin rotación.