Name: Determinación cuantitativa de la síntesis de ácidos grasos de novo en tejido adiposo marrón mediante óxido de deuterio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T12:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Aprende a cuantificar la síntesis de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón usando óxido de deuterio y cromatografía de gases-espectrometría de masas. Este método no invasivo permite evaluar con precisión el flujo de lipogénesis in vivo.

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Agradecemos a los miembros del laboratorio Sanchez-Gurmaches y Wallace por sus valiosas discusiones. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Asociación Americana del Corazón (18CDA34080527 a JSG y 19POST34380545 a RM), los NIH (R21OD031907 a JSG), un Premio del Consejo de Administración del CCHMC, un Premio del Centro de Genómica Pediátrica del CCHMC y un Premio del Centro de Genómica y Terapéutica Mendeliana del CCHMC. Este trabajo fue financiado en parte por el DK078392 P30 de los NIH del Centro Central de Investigación de Enfermedades Digestivas en Cincinnati. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. RT y MW contaron con el apoyo de una beca UCD Ad Astra.

Los autores no tienen nada que revelar.

Comprender el equilibrio y la interacción entre vías metabólicas complejas es un paso indispensable hacia la comprensión de las bases biológicas de las enfermedades relacionadas con el metabolismo. Aquí, mostramos una metodología no invasiva y económica para determinar los cambios en la síntesis de novo de ácidos grasos. Este método es una adaptación de métodos publicados anteriormente que desarrollaron cálculos para estimar el flujo de síntesis de novo a partir del enriquecimiento de deuterio de ácidos grasos 3...

La obesidad y las enfermedades metabólicas asociadas son una pandemia que pone en peligro a las generaciones presentes y futuras 1,2. Comúnmente simplificada como consecuencia del desequilibrio entre la ingesta y el gasto energético, la desregulación metabólica asociada a la obesidad afecta a un gran número de vías metabólicas controladas por factores ambientales y endógenos3. Sin embargo, solo unas pocas vías se prueban de forma rutinaria en modelos animales de desregulación metabólica.
A modo de ejemplo, la eliminación de glucosa se mide de forma rutinaria mediante pruebas de tolerancia a la glucosa y a la insulina, probablemente debido a la simplicidad del uso de monitores portátiles de glucosa4. Las tasas relativas de glucosa en el cuerpo entero y de oxidación de lípidos también se estiman de forma rutinaria en función de la relación de intercambio respiratorio de los ensayos de calorimetría indirecta 5,6. Sin embargo, la mayoría de todos los demás aspectos del metabolismo no se evalúan funcionalmente de forma rutinaria. Esto conduce a interpretaciones incompletas del estado metabólico y a la pérdida de opciones terapéuticas. Una de las principales vías de este tipo es la lipogénesis de novo.
La lipogénesis de novo (DNL) es el proceso mediante el cual se generan nuevos ácidos grasos a partir de precursores. Se considera que la glucosa es el principal precursor que contribuye a la DNL7 de todo el cuerpo, sin embargo, otros precursores, como el acetato, la fructosa, el lactato y los aminoácidos de cadena ramificada, han demostrado ser fuentes de carbono relevantes de manera espacial y dependiente de la condición 8,9,10,11,12. La DNL es un contribuyente clave a la homeostasis metabólica y es esencial para el desarrollo normal13. Además, las alteraciones en la DNL se han asociado con cáncer 14,15 y metabólico 16,17,18 y enfermedades cardiovasculares 19,20.
La vía DNL está compuesta por los componentes enzimáticos centrales ATP citrato liasa (ACLY), acetil-CoA carboxilasa (ACC1/2) y ácidos grasos sintasa (FAS) que producen principalmente palmitato, un ácido graso saturado de 16 carbonos. Sin embargo, los ácidos grasos de cadena impar y cadena ramificada también se pueden producir a tasas más bajas9. Las elongasas y desaturasas modifican aún más estos ácidos grasos, creando una amplia gama de especies de ácidos grasos útiles para una variedad de funciones (por ejemplo, almacenamiento de energía a largo plazo y manipulación de la fluidez de la membrana).
La expresión de la maquinaria enzimática de DNL está controlada por un número reducido de factores de transcripción. Las más descritas hasta la fecha incluyen la familia de proteínas de unión a elementos reguladores de esteroles (SREBP), la proteína de unión a elementos de respuesta a carbohidratos (ChREBP) y el receptor X hepático (LXR)21,22,23,24,25,26. A pesar de una aparente superposición en sus funciones, se han descrito regulaciones individuales basadas en la dominancia del tipo celular y en condiciones fisiológicas o patológicas21,22,27,28.
Sorprendentemente, una serie de inhibidores para pasos seleccionados de la vía DNL han sido aprobados para uso clínico o se encuentran en las etapas preclínicas o clínicas de desarrollo para una serie de enfermedades, incluida la obesidad, la enfermedad del hígado graso no alcohólico/esteatohepatitis no alcohólica (NAFLD/NASH) y las enfermedades cardiovasculares29. Estos esfuerzos ponen de relieve la importancia de la DNL en la salud y la enfermedad.
En los últimos años, el empleo de métodos para evaluar cuantitativamente la síntesis de novo de ácidos grasos ha aumentado30. El método más común para evaluar esto es el uso de agua marcada pesada (D2O), donde el hidrógeno marcado pesado se incorpora a las cadenas de acilo durante la síntesis, tanto directa como indirectamente, a través del intercambio de deuterio con los hidrógenos de los sustratos DNL NAPDH, acetil-CoA y malonil-CoA. Aunque este enfoque está ganando popularidad, hay una falta de protocolos detallados disponibles públicamente adecuados para los recién llegados al campo. En este trabajo se describe un método para evaluar cuantitativamente la síntesis de novo de productos de FAS utilizando D2O y espectrometría de masas por cromatografía de gases (GCMS), con cálculos desarrollados previamente por Lee et al.31. Este método mide la síntesis de ácidos grasos de novo independientemente de una fuente de carbono, y es potencialmente útil para prácticamente cualquier tejido, en cualquier modelo de ratón y bajo cualquier perturbación externa. Aquí, nos centramos en el análisis del tejido adiposo marrón (BAT) debido a sus altos niveles de DNL y su papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis metabólica.

<table><tbody><tr><td>Viales de vidrio de 4 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-334</td><td></td></tr><tr><td>0.2 y micro; m filtro Olympus</td><td>Plástico</td><td>25-244</td><td></td></tr><tr><td>26G Jeringas necesitadas</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Merck</td><td>34850</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Merck</td><td>900667</td><td></td></tr><tr><td>Azul GC tapón de rosca con septos</td><td>Centrífuga Agilent</td><td>5190-1599</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma</td><td>366927</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deuterio</td><td>Sigma</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Di-terc-butil-4-metilfenol (BHT) Seleccionar columna FAME</td><td>Merck</td><td>B1378</td><td></td></tr><tr><td>Di-terc-butil-4-metilfenol (BHT) Seleccionar columna FAME</td><td>Agilent</td><td>CP7419</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>411395105</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecenoic-d31 Ácido</td><td>Larodan</td><td>71-1631</td><td></td></tr><tr><td>Hexano</td><td>Merck</td><td>34859</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Merck</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga</td><td>Olympus Plastic</td><td>24-282</td><td></td></tr><tr><td>Cámara ambiental para ratones</td><td>Caron</td><td>Caron 7001-33</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Biorreactivos</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio</td><td>MP Biomedicals</td><td>194727</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga SafeLock</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de rosca ámbar GC vial</td><td>Agilent</td><td>5182-0716</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Biorreactivos Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio, dibásico</td><td>Fisher Bioreactivos</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de sodio</td><td>Merck</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Merck</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Inserto de vial</td><td>Agilent</td><td>5183-2088</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación cuantitativa de la síntesis de ácidos grasos de novo en tejido adiposo marrón mediante óxido de deuterio

Quantitative Determination of De Novo Fatty Acid Synthesis in Brown Adipose Tissue Using Deuterium Oxide

La síntesis de ácidos grasos es una vía metabólica compleja y altamente exigente en energía con importantes funciones en el control de la homeostasis metabólica de todo el cuerpo y otros procesos fisiológicos y patológicos. A diferencia de otras vías metabólicas clave, como la eliminación de glucosa, la síntesis de ácidos grasos no se evalúa funcionalmente de forma rutinaria, lo que lleva a interpretaciones incompletas del estado metabólico. Además, hay una falta de protocolos detallados disponibles públicamente adecuados para los recién llegados al campo. Aquí, describimos un método cuantitativo de bajo costo que utiliza óxido de deuterio y cromatografía de gases y espectrometría de masas (GCMS) para el análisis de la síntesis total de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón in vivo. Este método mide la síntesis de los productos de la sintasa de ácidos grasos independientemente de una fuente de carbono, y es potencialmente útil para prácticamente cualquier tejido, en cualquier modelo de ratón y bajo cualquier perturbación externa. Se proporcionan detalles sobre la preparación de la muestra para GCMS y los cálculos posteriores. Nos centramos en el análisis de la grasa parda debido a sus altos niveles de síntesis de ácidos grasos de novo y su papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis metabólica.

Basándonos en la dosificación deD2O descrita en el paso 1, normalmente encontramos que el agua corporal está enriquecida en el rango del 2,5% al 6%, y que un nivel basal de enriquecimiento de deuterio en el agua corporal se alcanza rápidamente en 1 h y se mantiene durante la duración del estudio a través del agua potable enriquecida al 8% (Figura 1). El enriquecimiento continuo de agua corporal en estado estacionario es una suposición de los cálculos utilizados en el paso...

Aquí, presentamos un método cuantitativo de bajo costo que utiliza óxido de deuterio y cromatografía de gases (GCMS) para el análisis de la lipogénesis total de novo de ácidos grasos en tejido adiposo marrón in vivo.

Determinación cuantitativa de la síntesis de ácidos grasos de novo en tejido adiposo marrón mediante óxido de deuterio

Fatty acid synthesis is a complex and highly energy demanding metabolic pathway with important functional roles in the control of whole-body metabolic ...

A diferencia de otras vías metabólicas como la eliminación de glucosa, la síntesis de ácidos grasos no se evalúa de forma rutinaria, lo que lleva a interpretaciones incompletas del estado metabólico. Los beneficios clave de este método es que es relativamente no invasivo, y es probable que refleje mejor el flujo de síntesis de ácidos grasos que el uso de glucosa marcada con isótopos, donde los cambios en el manejo de la glucosa aguas arriba pueden afectar los resultados. Aquí, nos centramos en el tejido adiposo marrón, pero este método es potencialmente útil para estudiar cualquier tejido en cualquier modelo de ratón.Para comenzar, coloque las muestras en hielo seco. Tome un tubo de microcentrífuga preetiquetado, colóquelo en una balanza analítica y tara la balanza. Luego coloque unas pinzas y un bisturí o una hoja de afeitar de acero sobre hielo seco durante 10 a 20 segundos para que se enfríe.Use las pinzas para sacar la muestra de tejido congelado del tubo y colóquela en un bote de pesas de plástico, que se puede colocar sobre un bloque plano de hielo seco u otra superficie preenfriada. Con el bisturí o la hoja de afeitar de acero, diseccione una pequeña porción del tejido equivalente a 5 a 15 miligramos de peso y colóquela en el tubo de microcentrífuga. Registre el peso exacto y repita para cada espécimen.Agregue un microlitro por miligramo de ácido D31 hexadecanoico de 10 milimolares, seguido de tres perlas de acero inoxidable de cinco milímetros a cada muestra. Luego agregue 250 microlitros de metanol, 250 microlitros de agua y 500 microlitros de cloroformo a cada muestra con perlas. Coloque los tubos en un bloque preenfriado de un molino de molienda y mezcle las muestras a una frecuencia vibratoria de 25 hercios durante cinco minutos.Retire las perlas con un imán y centrifugue las muestras a 12.000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Con una micropipeta, tome un volumen fijo de la fase inferior de cada muestra en tubos de microcentrífuga marcados correspondientemente. Agregue 500 microlitros de cloroformo a la muestra restante y repita estos pasos.Coloque los tubos con la fase inferior combinada bajo gas nitrógeno o en un vacío centrífugo refrigerado resistente al cloroformo a cuatro grados centígrados hasta que estén completamente secos. Pipetear 98 mililitros de metanol anhidro en una botella de vidrio. Y agregue lentamente dos mililitros de ácido sulfúrico anhidro en la campana extractora para hacer ácido sulfúrico al 2% en metanol.Mezcle girando la botella cerrada. Agregue 500 microlitros de esta solución de ácido sulfúrico al 2% en metanol a cada muestra y vórtice brevemente. Incubar las muestras en el bloque térmico a 50 grados centígrados durante dos horas y añadir 100 microlitros de solución saturada de cloruro de sodio y 500 microlitros de hexano a cada muestra.Agite vigorosamente las muestras a temperatura ambiente durante un minuto y déjelas reposar durante un minuto. Las dos fases deberían ser evidentes después de esto. Recoja la fase superior en un tubo de microcentrífuga nuevo.Luego repita la adición de hexano. Y después de la separación de fases, recoja las muestras de la segunda fase superior en los mismos tubos etiquetados. Secar las muestras a temperatura ambiente bajo gas nitrógeno y volver a suspender las muestras en 20 microlitros de hexano por miligramo de peso original del tejido.Transfiera las muestras inmediatamente a un vial de cromatografía de gases de vidrio con un inserto de vidrio. Inyecte las muestras en un único espectrómetro de masas de cromatografía cuádruple de gases para determinar la abundancia de ésteres metílicos de ácidos grasos o isótopos FAME. Inyecte un microlitro de muestra en una entrada dividida o sin división a una temperatura de entrada de 270 grados Celsius utilizando helio como gas portador.En tubos de microcentrífuga con cierre seguro etiquetados, combine 10 microlitros de cada muestra de plasma o cuatro microlitros estándar de hidróxido de sodio 10 molar y cuatro microlitros de acetona al 5% en acetonitrilo. Realice esto por triplicado para cada muestra. Después de incubar las muestras durante la noche a temperatura ambiente, agregue de 450 a 550 miligramos de sulfato de sodio a cada muestra, agregue 600 microlitros de cloroformo a cada tubo en la campana extractora y haga un vórtice vigoroso durante 15 segundos.Centrifugar las muestras a 300 G durante dos minutos. Tome viales de vidrio etiquetados con GCMS con insertos de vidrio y transfiera el triplicado y luego 80 alícuotas de microlitros del sobrenadante de cada muestra a los viales. Tape bien los viales para el análisis GCMS.Aquí se muestra el porcentaje de enriquecimiento de D2O en el plasma de ratones en múltiples puntos de tiempo. Se encontró que el agua corporal está enriquecida en el rango de 2.5 a 6%que un nivel de referencia de enriquecimiento de deuterio en el agua corporal se alcanza rápidamente en una hora y se mantiene durante la duración del estudio. Aquí se muestra la distribución isotópica masiva del palmitato en el tejido adiposo marrón después de tres días de administración de D2O a temperatura ambiente y termoneutralidad.Este resultado muestra un mayor enriquecimiento de deuterio M1 y M2 a temperatura ambiente. En esta figura se presenta el enriquecimiento molar del tejido adiposo marrón y el enriquecimiento molar plasmático de una serie de ácidos grasos después de tres días de administración de D2O a temperatura ambiente y termoneutralidad. El enriquecimiento de temperatura más fría se encontró en una amplia gama de ácidos grasos en el tejido adiposo marrón.En particular, el enriquecimiento de ácidos grasos totales en plasma no sigue la misma tendencia que el tejido adiposo marrón, sino que el enriquecimiento de ácidos grasos aumenta con la termoneutralidad. Estas imágenes representan la abundancia total y el palmitato sintetizado de novo en el tejido adiposo marrón después de tres días de administración de D2O. El resultado muestra un aumento en la síntesis total de palmitato a temperatura ambiente.Tenga cuidado al ejecutar ácidos grasos en el GCMS. Asegúrese de que el palmitato no esté sobrecargado, ya que puede dar valores de enriquecimiento de isótopos artificialmente altos. Además, cuando analice la acetona en el GCMS, asegúrese de que no haya un pico de acetona de fondo antes de ejecutar las muestras, así que ejecute espacios en blanco para eliminar la acetona del sistema.Este método analiza los ácidos grasos totales en múltiples clases de lípidos, pero si desea comprender cómo la síntesis de ácidos grasos afecta a clases específicas de lípidos, primero puede separar estas clases de lípidos mediante cromatografía y luego extraer los ácidos grasos de estas fracciones. Debido a que la lipogénesis es un factor clave para el desarrollo normal, pero también para muchas enfermedades, este protocolo puede ser útil en muchos campos.

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Biología

De la lipogénesis de novo y la oxidación de ácidos grasos β-constituyen vías metabólicas claves en los hepatocitos, las vías que son perturbados en varios trastornos metabólicos, incluyendo la enfermedad de hígado graso. Aquí se demuestra el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón y describimos cuantificación de la oxidación de ácidos grasos β-y la lipogénesis.

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