Name: Síntesis de proteínas libres de células a partir de extractos celulares deficientes en exonucleasa utilizando plantillas de ADN lineal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprende a sintetizar proteínas sin células usando extractos de E. coli deficientes en exonucleasa V con plantillas de ADN lineal. Este método optimiza la expresión de proteínas y acelera el desarrollo de sistemas de biología sintética.

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Aquí, mostramos que el lisado celular preparado a partir de E. coli BL21 Rosetta2 con un knockout genómico para el operón recB o recBCD admite una alta expresión de proteínas a partir de plantillas de ADN lineal. Este protocolo elabora un procedimiento de calibración de lisado paso a paso específico para plantillas de ADN lineal (Figura 2), que es un paso crítico que conduce a la alta expresión de promotores σ70 en ADN lineal, alcanzando niveles cercanos al plásmid...

Los sistemas de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) se utilizan cada vez más como un método rápido, simple y eficiente para la ingeniería de biosensores, la fabricación descentralizada y la creación de prototipos de circuitos genéticos1. Debido a su gran potencial, los sistemas CFPS se utilizan regularmente en el campo de la biología sintética. Sin embargo, hasta ahora los sistemas CFPS dependen de plásmidos circulares que pueden limitar la tecnología de alcanzar su máximo potencial. La preparación del ADN plásmido depende de muchos pasos que consumen mucho tiempo durante la clonación y de grandes cantidades de aislamiento de ADN. Por otro lado, la amplificación por PCR de un plásmido, o una plantilla de ADN sintetizado, se puede utilizar simplemente para preparar plantillas CFPS en unas pocas horas 2,3. Por lo tanto, la aplicación de ADN lineal ofrece una solución prometedora para CFPS. Sin embargo, el ADN lineal es rápidamente degradado por exonucleasas naturalmente presentes en extractos celulares4. Existen soluciones que abordan este problema, como utilizarla proteína 5 del λ-fago GamS o el ADN que contiene los sitios Chi6 como agentes protectores, o proteger directamente el ADN lineal mediante la modificación química de sus extremos 2,7,8,9. Todos estos métodos requieren suplementos al extracto celular, que son costosos y requieren mucho tiempo. Se sabe desde hace mucho tiempo que el complejo exonucleasa V (RecBCD) degrada el ADN lineal en lisados celulares4. Recientemente, demostramos que el ADN lineal puede protegerse mucho mejor en lisados de células eliminadas para genes de exonucleasa (recBCD)10.
En este protocolo, se describen en detalle los pasos para la preparación de lisados libres de células de la cepa de E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lisis de sonicación. La lisis de sonicación es una técnica común y asequible empleada por varios laboratorios11,12. Los extractos producidos a partir de esta cepa no necesitan la adición de ningún componente adicional o modificación de la plantilla de ADN para apoyar la expresión de plantillas de ADN lineal. El método se basa en el paso esencial de la optimización del tampón para extractos celulares específicamente para la expresión lineal de ADN de promotores nativos de E. coli. Se ha demostrado que esta optimización específica del tampón para la expresión lineal del ADN es la clave para que los promotores nativos de σ70 produzcan una alta producción de proteínas sin suplementos de proteína GamS o ADN Chi, incluso evitando la purificación de los productos de PCR10. Se encontró que la concentración óptima de Mg-glu para la expresión lineal de ADN era similar a la del ADN plásmido. Sin embargo, la concentración óptima de K-glu mostró una diferencia sustancial entre el ADN lineal y el plásmido, probablemente debido a un mecanismo relacionado con la transcripción10. La funcionalidad de las proteínas expresadas mediante este método se ha demostrado para varias aplicaciones, como el cribado rápido de los interruptores de punto de apoyo y la evaluación de la actividad de las variantes enzimáticas10.
Este protocolo proporciona una solución simple, eficiente y rentable para el uso de plantillas de ADN lineal en sistemas libres de células de E. coli simplemente utilizando extractos de células ΔrecBCD mutantes y calibración específica para ADN lineal como plantilla.

<table><tbody><tr><td>Caldo de 2 YT</td><td>Invitrogen</td><td>22712020</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos Safe-Lock</td> Microtubo de <td>30120086</td><td>Eppendorf</td><td>de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Microplaca de fondo cuadrado de 384 pocillos</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>142761</td><td></td></tr><tr><td>3PGA (Ácido D-(-)-3-fosfoglicérico disódico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td></td></tr><tr><td>junta de placa adhesiva</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td></td><td></td>232701</tr><tr><td>Agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosina 5'-trifosfato, sal disódica, hidrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2</td><td>Merck, Millipore</td><td>71402</td><td></td></tr>, <tr><td>BL21, Rosetta2 y Delta; recB</td><td>Addgene</td><td>176582</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Rosetta2 y Delta; recBCD</td><td>Addgene</td><td>176583</td><td></td></tr><tr><td>cAMP (Adenosina 3' 5'-monofosfato cíclico)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9501</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>CoA (hidrato de coenzima A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>Corning Tubos de centrífuga PP de 15 mL, bastidor empaquetado con tapa CentriStar, tubo estéril</td><td>Corning</td><td>430790</td> de <td>15 mL</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga Corning PP de 50 mL, fondo cónico con tapa CentriStar, tubo estéril</td> de <td>Corning</td><td>430828</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>CTP (citidina 5'-trifosfato, sal disódica hidrato)</td><td>Alfa Aesar</td><td>&nbsp; J62238</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-Ditiothreitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Ácido folínico (sal cálcica sólida de ácido folínico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosina 5?-Trifosfato,&nbsp; Sal disódica)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>371701</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; H3375</td><td></td></tr><tr><td>K fosfato dibásico (K2HPO4)</td><td>Carl Roth</td><td>231-834-5</td><td></td></tr><tr><td>K fosfato monobásico (H2KO4P)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamato</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17232</td><td></td></tr><tr><td>Mg-glutamato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GP Unidad de filtro de jeringa, 0.22 y micro; m, polietersulfona</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>filtro de membrana 0,22 y micro; m</td></tr><tr><td>Monarch PCR & Kit de limpieza de ADN</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td>PCR & Kit de limpieza de ADN</td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de plásmido monarca</td><td>NEB</td><td>T1010S</td><td>Kit de minipreparación de plásmidos</td></tr><tr><td>NAD (hidrato de dinucleótido de adenina y b-nicotinamida)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>N6522</td><td></td></tr><tr><td>Estándar FITC trazable al NIST</td><td>Invitrogen</td><td>F36915</td><td>NIST-FITC</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740414.1</td><td>Kit de Maxiprep de plásmido</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td></td></tr><tr><td>lector de placas</td><td>Biotek&nbsp;</td><td>Synergy HTX</td><td></td></tr><tr><td>Chromotek de proteína EGFP recombinante purificada</td><td></td><td>egfp-250</td><td>eGFP recombinante</td></tr><tr><td>Q5 de alta fidelidad 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>ADN polimerasa</td></tr><tr><td>Q5 de alta fidelidad 2X Master Mix New</td><td>England Biolabs</td><td>M0492L</td> ADN <td>polimerasa</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit de ensayo</td><td>Thermo</td><td>Q32850</td><td>con colorante de unión al ADN</td></tr><tr><td>RTS Muestreador de aminoácidos</td><td>biotechrabbit</td><td>BR1401801</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>Agua</td><td></td><td></td> estéril <td>Agua purificada del sistema Millipore RiOs 8, esterilizada en autoclave.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>productos de Ciencias de la Vida Cytiva</td><td>17-1321-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ARNt</td><td>Roche</td><td>10109550001</td><td></td></tr><tr><td>Procesador ultrasónico Célula de vibración VC-505</td><td>SONICS</td><td>VC505</td><td>sonicador</td></tr><tr><td>UTP Na3 (Uridina 5'- trifosfato, hidrato de sal trisódica)</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td></td><td></td>226310010</tr><tr><td>Agua, sin nucleasas</td><td>Thermo</td><td>R0581</td><td>Agua sin nucleasas</td></tr></tbody></table>

síntesis de proteínas libres de células a partir de extractos celulares deficientes en exonucleasa utilizando plantillas de adn lineal

Cell-Free Protein Synthesis from Exonuclease-Deficient Cellular Extracts Utilizing Linear DNA Templates

La síntesis de proteínas libres de células (CFPS) se ha vuelto recientemente muy popular en el campo de la biología sintética debido a sus numerosas ventajas. El uso de plantillas de ADN lineal para CFPS permitirá que la tecnología alcance su máximo potencial, disminuyendo el tiempo experimental al eliminar los pasos de clonación, transformación y extracción de plásmidos. El ADN lineal puede ser rápida y fácilmente amplificado por PCR para obtener altas concentraciones de la plantilla, evitando la posible toxicidad de la expresión in vivo. Sin embargo, los moldes lineales de ADN son degradados rápidamente por exonucleasas que están naturalmente presentes en los extractos celulares. Hay varias estrategias que se han propuesto para abordar este problema, como la adición de inhibidores de nucleasa o la modificación química de los extremos lineales del ADN para la protección. Todas estas estrategias cuestan tiempo y recursos adicionales y aún no han obtenido niveles cercanos al plásmido de expresión de proteínas. Aquí se presenta un protocolo detallado para una estrategia alternativa para usar plantillas de ADN lineal para CFPS. Mediante el uso de extractos celulares de células knockout deficientes en exonucleasa, las plantillas de ADN lineal permanecen intactas sin requerir ninguna modificación final. Presentamos los pasos de preparación del lisado celular de la cepa Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD por lisis de sonicación y calibración de tampón para Mg-glutamato (Mg-glu) y K-glutamato (K-glu) específicamente para ADN lineal. Este método es capaz de alcanzar niveles de expresión de proteínas comparables a los del ADN plásmido en CFPS de E. coli.

Aquí se muestran resultados representativos después de la calibración del lisado para los niveles óptimos de Mg-glutamato y K-glutamato por separado para el ADN lineal y plásmido (Figura 1). La concentración óptima de Mg-glutamato es similar en los extractos de Δ recB y ΔrecBCD a 8 mM (Figura 1B). Sin embargo, la concentración óptima de K-glutamato para el ADN plásmido es de 140 mM, mientras que la concentración óptima de K-glutamato para el AD...

Aquí se presenta un protocolo para la preparación y calibración tampón de extractos celulares de cepas knockout de exonucleasa V de Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD y ΔrecB). Este es un enfoque rápido, fácil y directo para la expresión en sistemas de síntesis de proteínas libres de células utilizando plantillas de ADN lineal.

Síntesis de proteínas libres de células a partir de extractos celulares deficientes en exonucleasa utilizando plantillas de ADN lineal

Cell-free protein synthesis (CFPS) has recently become very popular in the field of synthetic biology due to its numerous advantages. Using linear DNA ...

El protocolo es muy importante porque permite el uso rápido, fácil y directo de plantillas de ADN lineal en sistemas de síntesis de proteínas libres de células, incluso a partir de parámetros nativos de E. coli. Las principales ventajas son la cantidad de tiempo ahorrada al evitar la clonación, las modificaciones químicas de los extremos lineales del ADN y los suplementos protectores como el ADN gamma o chi. A medida que se desarrollan extractos de síntesis autoinformados para diferentes organismos de interés, nuestro método presenta una forma de acelerar la creación de prototipos en esos extractos mediante el uso de ADN lineal.Para comenzar, raye la cepa BL21 Rosetta-2 delta recBCD desde menos 80 grados centígrados de glicerol en una placa de agar 2x YTP que contiene 10 microgramos por mililitro de cloranfenicol e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Luego, inocular una sola colonia de la placa de agar en un poco más de 40 mililitros de 2x YTP suplementado con 10 microgramos por mililitro de cloranfenicol e incubar durante la noche a 37 grados centígrados con agitación de 200 RPM. Luego, haga un subcultivo diluyendo el cultivo durante la noche 100 veces en cuatro litros de medios frescos 2x YTP que contienen 10 microgramos por mililitro de cloranfenicol.Divida los cuatro litros de los medios en cuatro matraces separados. Incubar a 37 grados centígrados, 200 RPM, durante aproximadamente tres a cuatro horas de crecimiento para alcanzar una densidad óptica de 1.5 a 2.0. Ponga el cultivo en hielo, gire las células a 5, 000 G durante 12 minutos a cuatro grados centígrados, y luego deseche el sobrenadante por decantación.Luego, resuspender los pellets de celda en 800 mililitros de S30A refrigerado con TDT. Nuevamente, gire las células a 5, 000 G durante 12 minutos a cuatro grados Celsius como se demostró anteriormente y deseche el sobrenadante por decantación. Después de resuspender los gránulos de células en 160 mililitros de S30A refrigerado con TDT, transfiera las células a tubos de 50 mililitros refrigerados y previamente pesados.Haga girar las células a 2000 G durante ocho minutos a cuatro grados centígrados y luego desechar el sobrenadante por decantación. Una vez más, gire las células a 2000 G durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados, y luego retire el sobrenadante restante con cuidado usando una pipeta. Luego, vuelva a medir el peso del tubo para calcular el peso del pellet de celda y mantenga los gránulos de celda a menos 80 grados centígrados.Después de tomar los gránulos de celda de menos 80 grados centígrados, descongelarlos en hielo durante una o dos horas y resuspender los gránulos de celda en 0.9 mililitros de S30A con tampón de TDT por gramo del peso del pellet de celda. Luego, pipetear lentamente para resuspender las células, evitando la espuma superior tanto como sea posible. Coloque alícuotas de un mililitro de las células resuspendidas en microtubos de 1,5 mililitros y manténgalas en hielo o en un bloque frío preenfriado a cuatro grados centígrados.A continuación, sonicar cada tubo en un sonicador con una configuración de 20% de amplitud durante tres ciclos y girar el lisado a 12, 000 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de recoger el sobrenadante con una pipeta, transfiera a un tubo de 50 mililitros. Incubar el lisado celular a 37 grados centígrados a 200 RPM agitación durante 80 minutos.Después de girar el lisado y recoger el sobrenadante en microtubos de 1,5 mililitros preenfriados, alícuota 30 microlitros en tubos de PCR de 8 tiras preenfriados, manteniendo todos los tubos en hielo. Congele rápidamente las alícuotas de lisado en hielo seco y guárdelas a menos 80 grados centígrados. Prepare una mezcla maestra de acuerdo con la pestaña de preparación del búfer como se describe en el manuscrito.Para un volumen de reacción de 10,5 microlitros, agregue 1,05 microlitros de diferentes concentraciones de Mg-glutamato y 9,45 microlitros de la mezcla maestra y mezcle suavemente. Pipetear 10 microlitros de las reacciones anteriores en una microplaca de fondo cuadrado de 384 pocillos y cubrirla con un sello de placa adhesiva. Mida la expresión génica como salida de fluorescencia registrando datos de fluorescencia con un lector de placas a intervalos regulares durante ocho horas de incubación a 30 grados centígrados con agitación orbital continua a 307 ciclos por minuto.Después de identificar la concentración de Mg-glutamato que resulta en el valor de fluorescencia más alto en el punto final, proceda a la calibración de K-glutamato. Ejecute el experimento e identifique el valor de fluorescencia más alto de entre las concentraciones de K-glutamato probadas, identificando así la composición tampón óptima para Mg-glutamato y K-glutamato para este lisado. Una vez establecidos los valores de Mg-glutamato y K-glutamato, preparar tubos madre de la composición tampón optimizada según el volumen de lote obtenido.Después de calcular el número de tubos amortiguadores necesarios, alícuota 38 microlitros por tubo y guárdelos a menos 80 grados centígrados. Primero, etiquete un microtubo de 1.5 mililitros para la preparación óptima de la mezcla maestra. Agregue los volúmenes correctos del tampón y el lisado y mezcle suavemente.Luego, pipetear primero las muestras de ADN, seguidas de agua libre de nucleasas y, finalmente, la mezcla maestra óptima. Mezcle suavemente la reacción sin células con una pipeta justo antes de añadirla al lector de placas y evite cualquier burbuja. Después de configurar las reacciones en el lector de placas, las ejecuciones cinéticas registraron datos de fluorescencia a intervalos regulares durante ocho horas de incubación a 30 grados centígrados con agitación orbital continua a 307 ciclos por minuto.Después de la calibración del lisado, la concentración óptima de Mg-glutamato fue similar a ocho milimolares a través de extractos para ADN lineal y plásmido. Sin embargo, la concentración óptima de K-glutamato para el ADN plásmido es de 140 milimolar, mientras que la concentración óptima de K-glutamato para el ADN lineal es de 20 milimolar. Después de los pasos de calibración, los niveles de expresiones de GFP se compararon entre el ADN lineal y plásmido en los extractos de tipo salvaje, delta recB y delta recBCD.La expresión de GFP del ADN lineal alcanzó el 102% y el 138% de la expresión del ADN plásmido en extractos de cepas delta recB y delta recBCD, respectivamente. Las cosas más importantes en el protocolo son la lisis de sonicación de la célula y los pasos de calibración del tampón por separado para el ADN lineal y plásmido, particularmente cuando se usan los parámetros nativos. Esta técnica ayudaría a acelerar las pruebas de diseños biológicos en sistemas libres de células, por ejemplo, la detección de biosensores, enzimas y vías, o la creación de prototipos de circuitos genéticos sintéticos.

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Este artículo presenta un método sensible llamado Circle-Seq para purificar el ADN circular extracromosómico (eccDNA). El método abarca la purificación en columna, la eliminación del ADN cromosómico lineal restante, la amplificación en círculo rodante y la secuenciación de alto rendimiento. Circle-Seq es aplicable al cribado a escala genómica del ECCDNA eucariota y al estudio de la inestabilidad del genoma y la variación del número de copias.

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Clonamos y analizamos genes de reportero generando ARN circulares. Estos genes reporteros son más grandes que las construcciones para analizar el empalme lineal y contener elementos Alu. Para investigar los ARN circulares, las construcciones se transinfectan en células y el ARN resultante se analiza utilizando RT-PCR después de la eliminación del ARN lineal.

Uso de Minigenes que contienen elementos Alu para analizar ARN circulares

El estudio describe un protocolo para crear grandes cantidades (μg-mg) de ADN para campañas de detección de proteínas a partir de fragmentos de genes sintéticos sin clonar ni usar células vivas. La plantilla mínima se digiere y circula enzimáticamente y luego se amplifica mediante amplificación de círculo de rodadura isotérmica. Las reacciones de expresión libre de células podrían realizarse con el producto no purificado.

Métodos rápidos y enzimáticos para la amplificación de plantillas mínimas y lineales para la creación de prototipos de proteínas utilizando sistemas libres de células

Este protocolo describe un método rápido y simple para producir lisado bacteriano para la expresión génica libre de células, utilizando una cepa modificada de Escherichia coli y requiriendo solo equipo de laboratorio estándar.

Producción rápida, asequible y sin complicaciones de lisado bacteriano libre de células

Las partes genéticas bien caracterizadas son necesarias para el diseño de nuevos circuitos genéticos. Aquí describimos un método rentable y de alto rendimiento para caracterizar rápidamente las partes genéticas. Nuestro método reduce el costo y el tiempo al combinar lisados libres de células, ADN lineal para evitar la clonación y manejo acústico de líquidos para aumentar el rendimiento y reducir los volúmenes de reacción.

Caracterización rápida de partes genéticas con sistemas libres de células

Este trabajo describe la preparación de extracto celular de Escherichia coli (E. coli) seguido de reacciones de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) en menos de 24 horas. La explicación del protocolo de autoinducción libre de células (CFAI) detalla las mejoras realizadas para reducir la supervisión del investigador y aumentar las cantidades de extracto celular obtenido.

De las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células

Este protocolo describe el sistema de síntesis de proteínas libres de células (CFPS) utilizado en la construcción de células sintéticas. Describe las etapas clave con resultados representativos en diferentes microcompartimentos. El protocolo tiene como objetivo establecer las mejores prácticas para diversos laboratorios en la comunidad de células sintéticas, avanzando en el desarrollo de células sintéticas.

Sistema de síntesis de proteínas libres de células para la construcción de células sintéticas

Aprende a sintetizar proteínas sin células usando extractos de E. coli deficientes en exonucleasa V con plantillas de ADN lineal. Este método optimiza la expresión de proteínas y acelera el desarrollo de sistemas de biología sintética.

Síntesis de proteínas libres de células a partir de extractos celulares deficientes en exonucleasa utilizando plantillas de ADN lineal (Video) | JoVE Journal

Síntesis de proteínas libres de células a partir de extractos celulares deficientes en exonucleasa utilizando plantillas de ADN lineal

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