Name: Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprende a cuantificar la formación y extensión de bucles D durante la recombinación homóloga en Saccharomyces cerevisiae mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa. Esta técnica permite estudiar proteínas clave en el metabolismo de bucles D.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El trabajo en el laboratorio Heyer está respaldado por las subvenciones GM58015 y GM137751 a W.-D.H. La investigación en el laboratorio Piazza cuenta con el apoyo del Consejo Europeo de Investigación (ERC-StG 3D-loop, gran acuerdo 851006). D.R. cuenta con el apoyo de T32CA108459 y la Fundación A.P. Giannini. Agradecemos a Shih-Hsun Hung (Heyer Lab) por compartir los resultados de su ensayo DLC/DLE y por validar adicionalmente los cambios en los ensayos que se detallan en este protocolo.

1. Precrecimiento, inducción DSB y recolección de muestras
NOTA: Se recomienda la suplementación de todos los medios con 0,01% de adenina para las cepas de Ade.
<ol><li>Rayar las cepas haploides apropiadas (ver Tabla 1) en levadura peptona dextrosa adenina (YPDA) ( 1% extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa, 2% agar, 0,001% adenina) y crecer durante 2 días a 30 °C.</li>
	<li>Use una sola colonia para inocular 5 ml de YPDA en un tubo de cultivo de vidrio de 15 ml. Cultivar cultivos hasta la saturación a 30 °C con agitación o rotación para aireación.</li>
	<li>Ensayo DLC: Prepare la solución madre de psoraleno 5x (0.5 mg / ml de trioxaleno en etanol a prueba de 200) en una campana extractora disolviendo psoraleno en un tubo cónico de 50 ml envuelto en papel de aluminio durante la noche a temperatura ambiente con agitación o inversión continua. Selle la parte superior de tornillo con una película transparente para evitar la evaporación. No prepare más de 7 ml de solución madre de psoraleno 5x por tubo cónico de 50 ml para asegurar la disolución adecuada del psoraleno.</li>
	<li>Al día siguiente, use 5 ml del cultivo YPDA cultivado durante la noche para inocular 50-100 ml de YEP-lactato (1% de extracto de levadura, 2% peptona, 2% p/p de lactato, 0,001% de adenina) en un matraz de tamaño adecuado (la levadura en ciernes crece de manera óptima en un matraz que es al menos 5 veces el volumen del cultivo) a un OD600 de ~0,03.</li>
	<li>Cultivar el cultivo durante ~16 h a 30 °C con agitación a 220 rpm. Después de ~16 h, mida el OD600 del cultivo y debe ser ~0.5-0.8. No utilice cultivos submaduros o demasiado grandes.</li>
	<li>Para cada punto de tiempo, recoja el volumen apropiado de células en un tubo cónico y colóquelo en hielo. Típicamente, esto es 1 x 108 células (aproximadamente 7,5 ml de cultivo en OD 600 1,0 para una cepa haploide de tipo salvaje) para el ensayo DLC y 5 x 107 células (aproximadamente 2,5 ml de cultivo en OD600 1.0) para el ensayo DLE.</li>
	<li>Para garantizar la precisión de los valores de OD 600, prepare diluciones 1:5 para cultivos con un OD600≥0.2 para mantener la lectura de OD en 0.2 o menos. Para las cepas de tipo salvaje, los puntos de tiempo óptimos para el análisis DLC son entre 2 h y 6 h, y los puntos de tiempo óptimos para el análisis DLE son entre 4 h y 8 h (ver Figura 3 y Figura 4).</li>
	<li>Ensayo DLC<ol><li>Antes de cada punto de tiempo, prepare suficiente solución de psoraleno 1x (0,1 mg/ml de trioxsaleno, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0, 20% de etanol) en una campana extractora para todas las muestras en un tubo cónico de 50 ml envuelto en papel de aluminio. Salir en RT.</li>
		<li>Centrifugar las muestras a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C. Resuspender el pellet en 2,5 ml de 1x solución de psoraleno en una campana extractora y transferir a una placa de Petri de 60 mm x 15 mm. Alternativamente, resuspenda el pellet en 2,5 ml de solución TE1 (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 50 mM EDTA pH 8,0) para un control sin reticulación.</li>
		<li>Entrecruza las muestras. Para un ajuste de reticulación UV con bombillas de onda larga (365 nm), coloque las placas de Petri 1-2 cm por debajo de la fuente de luz UV con la tapa retirada sobre una placa de plástico o plexiglás que se haya enfriado previamente a -20 ° C. Para una caja de luz UV, coloque las placas de Petri directamente encima de la fuente de luz UV. Exponga las muestras durante 10 minutos con una agitación suave. NOTA: Se recomienda colocar la fuente de luz UV encima de un agitador orbital configurado a ~ 50 rpm.</li>
		<li>En una campana extractora, transfiera la muestra a un nuevo tubo de 15 ml. Enjuague la placa de Petri con 2,5 ml de solución TE1 y agréguela al tubo. Centrifugar las muestras a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C, desechar adecuadamente el sobrenadante y almacenar el pellet a -20° C. Las muestras se pueden almacenar hasta 1 semana antes de pasar al siguiente paso.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo DLE<ol><li>Centrifugar las muestras a 2.500 x g durante 5 min a 4 °C. Lavar el pellet de la celda en 2,5 ml de solución TE1 fría antes de repetir el centrifugado y almacenar los gránulos a -20 °C. Las muestras se pueden almacenar hasta 1 semana antes de pasar al siguiente paso.</li>
	</ol></li>
	<li>Para la recolección de muestras a las 0 h, recolectar las muestras antes de la adición de galactosa al 20%. Para puntos de tiempo posteriores, inducir la formación de DSB agregando 20% de galactosa a los cultivos a una concentración final de 2%. Recolectar las muestras restantes como se describió anteriormente, pellets y congelar en relación con el tiempo posterior a la inducción DSB (es decir, la muestra de 4 h se recolecta 4 h después de la adición de galactosa al 20%).</li>
</ol>2. Esferoplastia celular, lisis y restauración del sitio de restricción
<ol><li>Descongele las muestras en hielo. Precalentar un baño seco a 30 °C.</li>
	<li>Resuspender las muestras en 1 mL de tampón de esferoplasting (0,4 M de sorbitol, 0,4 M KCl, tampón fosfato de sodio de 40 mM pH 7,2, 0,5 mM MgCl2) y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Añadir 3,5 μL de solución de zimolyase (2% de glucosa, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mg/ml de zymolyase 100T; 17,5 μg/ml de zymolyase concentración final). Mezclar suavemente dando golpecitos o inversión. Incubar a 30 °C durante 15 min, y luego colocar en hielo. Durante la incubación de 15 minutos, obtenga nitrógeno líquido o hielo seco.</li>
	<li>Centrifugar durante 3 min a 2.500 x g a 4 °C y colocar las muestras en hielo. Lave las muestras 3 veces en 1 ml de tampón de esferaturado. Centrifugar las muestras durante 3 min a 2.500 x g a 4 °C.</li>
	<li>Resuspender las muestras en 1 ml de tampón enzimático de restricción 1x frío (50 mM de acetato de potasio, 20 mM de Tris-acetato, 10 mM de acetato de magnesio, 100 μg/mL BSA pH ~8,0 a RT) y centrifugar durante 3 min a 16.000 x g a 4 °C. Coloque las muestras en hielo. Repita el lavado 1x.</li>
	<li>Resuspender las muestras en 1 ml de tampón enzimático de restricción 1x frío. Divida la muestra (0,5 ml cada una) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar las muestras durante 3 min a 16.000 x g a 4 °C.</li>
	<li>Resuspender un tubo de cada muestra en 180 μL de tampón enzimático de restricción 1,4x con oligos hibridantes (ver Tabla 2) y un tubo en 180 μL de tampón enzimático de restricción 1,4x sin oligos hibridantes. Cada oligo hibridante se resuspende en 1x TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0) y se utiliza a una concentración final de 7 nM. El TE 1x reemplaza los oligos hibridantes en el tampón de la enzima de restricción 1.4x sin hibridar oligos. NOTA: Los oligos hibridantes deben almacenarse a −20 °C en pequeñas alícuotas en la dilución de trabajo. La concentración de los oligos hibridantes puede requerir optimización; véase Discusión.</li>
	<li>Congele rápidamente las muestras en nitrógeno líquido o hielo seco/etanol y guárdelas a -80 °C. Las muestras se pueden almacenar en esta etapa durante varios meses.</li>
</ol>3. Digestión enzimática de restricción y ligadura intramolecular
<ol><li>Descongele las muestras en hielo. Precalentar un baño seco a 65 °C y otro a 37 °C.</li>
	<li>Pipet 36 μL de la muestra en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml sobre hielo. Devuelva rápidamente la muestra restante a −80 °C para su almacenamiento.</li>
	<li>Añadir 4 μL de SDS al 1% (0,1% de concentración final) y mezclar golpeando suavemente el lado del tubo. Incubar a 65 °C durante 15 min con golpecitos suaves cada 5 min. Colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación. NOTA: Este tratamiento SDS promueve la desnaturalización de las proteínas asociadas al ADN, la solubilización de la envoltura nuclear y la accesibilidad a la cromatina antes de los pasos de digestión de enzimas de restricción y ligadura intramolecular.</li>
	<li>Añadir 4,5 μL de Triton X-100 al 10% (concentración final al 1%) y mezclar por pipeteo. Añadir 20-50 U de enzima de restricción (EcoRI-HF o HindIII-HF) a cada muestra e incubar a 37 °C durante 1 h con agitación suave cada 20-30 min. Durante este tiempo, precaliente un baño seco a 55 °C y preajuste un baño maría a 16 °C.</li>
	<li>Añadir 8,6 μL de SDS al 10% (concentración final del 1,5%) a cada muestra y mezclar mediante pipeteo y roscado. Incubar a 55 °C durante 10 min. Añadir 80 μL de Triton X-100 al 10% (concentración final al 6%) a cada muestra y mezclar por pipeteo.</li>
	<li>Añadir 660 μL de 1x tampón de ligadura sin ATP (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT,2,5 μg/mL BSA) + 1 mM ATP pH 8,0 + T4 DNA ligasa (8 U/muestra) a cada muestra y mezclar mediante una inversión suave. Incubar a 16 °C durante 1,5 h con inversión cada 30 min. Colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación.</li>
</ol>4. Purificación del ADN
<ol><li>Precalentar un baño seco a 65 °C y otro a 37 °C. Añadir 1 μL de proteinasa K de 10 mg/ml (preparada en 1x TE pH 8,0) a cada muestra (concentración final de 12,5 μg/ml). Incubar a 65 °C durante 30 min y colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación hasta que se hayan enfriado.</li>
	<li>Transfiera las muestras a tubos de 2 ml. Trabajando en una campana extractora, agregue un volumen igual (~ 800 μL) de fenol / cloroformo / alcohol isoamílico (P / C / IA; pH 8.0) a cada muestra. Vortex las muestras durante ~30 s y centrifugar las muestras durante 5-10 min a 16.000 x g en una microcentrífuga.</li>
	<li>Retire con cuidado 600 μL de la fase superior de cada muestra en un nuevo tubo de 1,5 ml. Deseche adecuadamente los tubos de fase inferior y de 2 ml.</li>
	<li>Precipitar el ADN añadiendo un volumen de 1/10 de acetato de sodio 3 M pH 5.2 (~60 μL) a cada muestra, seguido de 1 volumen de isopropanol (~660 μL). Invierta las muestras 5x-10x e incube a RT durante 30 min.</li>
	<li>Colocar las muestras en hielo durante 2 min, y luego centrifugar las muestras a 16.500 x g durante 15 min a 4 °C en una microcentrífuga. Devuelva las muestras al hielo, vierta el sobrenadante y drene el tubo en una toalla de papel.</li>
	<li>Lave el pellet de ADN con 200 μL de etanol al 70%. Centrifugar a 16.500 x g durante 3 min a 4 °C, volver a colocar las muestras en hielo, verter el sobrenadante y eliminar el alcohol residual con una pipeta. Secar las muestras con las tapas de los tubos abiertas a 37 °C durante 15-20 min.</li>
	<li>Resuspender los gránulos de ADN en 50 μL de 1x TE por vórtice. Incubar a RT durante 30 min, vórtice, y luego incubar a 37 °C en un baño seco durante 30 min. Vuelva a vomitar las muestras y luego colóquelas en hielo. Las muestras se pueden almacenar en esta etapa a -20 °C durante varios meses, pero es aconsejable proceder inmediatamente para los pasos de desenlace (DLC solamente) y qPCR.</li>
</ol>5. Reversión de enlaces cruzados de psoraleno (solo para el ensayo DLC)
<ol><li>Pipet 9 μL de ADN purificado en un tubo de PCR sobre hielo. Añadir 1 μL de 1 M KOH (0,1 M concentración final). Incubar las muestras a 90 °C durante 30 min en un termociclador.</li>
	<li>Añadir 19,73 μL de solución de acetato de sodio (0,1 M de acetato de sodio, 9,6 mM de Tris-HCl pH 8,0, 1,0 mM EDTA pH 8,0). Las muestras pueden almacenarse en esta etapa a -20 °C durante varios meses, pero es aconsejable proceder inmediatamente a la etapa de qPCR.</li>
</ol>6. PCR cuantitativa, controles y análisis
<ol><li>Usando 2 μL de ADN purificado, con o sin reticulación, configure una reacción qPCR de 20 μL de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Configura cada reacción por duplicado. Para los ensayos DLC y DLE, hay cinco reacciones de control y una reacción de cuantificación DLC/DLE, o un total de seis reacciones por muestra, ejecutadas por duplicado. La Tabla Suplementaria S1 y la Tabla Suplementaria S2 proporcionan una plantilla para configurar estas reacciones y análisis, y las secuencias de los cebadores de qPCR se enumeran en la Tabla 3.</li>
	<li>Las condiciones de ciclo de qPCR deben optimizarse para cada kit de qPCR.<ol><li>Utilice las siguientes condiciones de qPCR DLC, dependiendo de los kits de qPCR utilizados: desnaturalización inicial (95 °C durante 3 min); 50 rondas de amplificación (95 °C durante 15 s, 61 °C durante 25 s, 72 °C durante 15 s con una sola adquisición); análisis de la curva de fusión (95 °C durante 5 s, 65 °C durante 1 min, 97 °C con adquisición continua); y refrigeración (37 °C durante 30 s).</li>
		<li>Utilice las siguientes condiciones de qPCR para el ensayo de DLA: desnaturalización inicial (95 °C durante 5 min); 50 rondas de amplificación (95 °C durante 15 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 15 s con una sola adquisición); análisis de la curva de fusión (95 °C durante 5 s, 65 °C durante 1 min, 97 °C con adquisición continua); y refrigeración (37 °C durante 30 s). Tenga en cuenta que puede ser necesaria la optimización para diferentes máquinas/kits de qPCR.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo DLC<ol><li>Controles: Consulte la lista de cebadores de qPCR en la Tabla 3. En la Figura S1 se muestra un mapa de los sitios de unión de imprimación. Para archivos de secuencia suplementarios para las características genómicas y amplicones relevantes, verifique los archivos A plásmidos Editor (ApE); Archivos de secuencia suplementaria 1-5.<ol><li>ADN genómico en ARG4: Utilice olWDH1760/olWDH1761 para amplificar el dsDNA localizado en ARG4. Utilice esta reacción como control de carga y normalice todas las demás reacciones, excepto la reacción de la señal DLC a este control.</li>
			<li>Eficiencia de la ligadura intramolecular en DAP2: Utilice el fragmento de 1.904 pb creado por la digestión EcoRI para la ligadura intramolecular en paralelo con la ligadura DLC. La amplificación a través de esta unión de ligadura informa sobre la eficiencia de la ligadura intramolecular y sirve como un control al que se normaliza la señal DLC.</li>
			<li>Inducción DSB: Utilice olWDH1766/olWDH1767 para amplificar una región que abarca el DSB inducido.</li>
			<li>Reticulación y resección de psoraleno: use olWDH2019/olWDH2020 para amplificar la región única de PhiX aguas abajo del sitio de reconocimiento EcoRI. Sin inversión de reticulación, utilice la proporción de ssDNA (sin reticulación) sobre ARG4 (dsDNA reticulado) para determinar la eficiencia de reticulación. Con la inversión de reticulación, la resección conducirá a una disminución progresiva de 1 a 0,5 de la señal en relación con ARG4.</li>
			<li>EcoR I restauración y corte del sitio de reconocimiento: Utilice olWDH1768/olWDH1764 para amplificar una región que abarca el sitio de reconocimiento EcoRI restaurado aguas arriba del DSB en la hebra resecada. olWDH1769/olWDH1763 amplifican una región que abarca el sitio de la enzima de restricción EcoRI en DAP2. Realizar la escisión EcoRI en este sitio para usarla como control de ligadura intramolecular.</li>
		</ol></li>
		<li>Señal DLC: Utilice olWDH1764/olWDH1765 para amplificar la molécula de ADN quimérico creada por la ligadura intramolecular de la hebra resecada (invasora) y el donante.</li>
		<li>Análisis: Calcular la media y la desviación estándar de los valores de Cp para cada una de las reacciones duplicadas. Utilice los valores de Cp de qPCR de ADN genómico ARG4 como referencia para normalizar todas las demás qPCR de control. Normalizar la señal DLC al control de ligadura intramolecular en DAP2. Consulte la Figura 3 para conocer los valores típicos de la señal DLC a las 2 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensayo DLE<ol><li>Controles: Consulte la lista de cebadores de qPCR en la Tabla 3. En la Figura S1 se muestra un mapa de los sitios de unión de imprimación. Para archivos de secuencia suplementarios para las características genómicas y amplicones relevantes, verifique los archivos A plásmidos Editor (ApE) (Archivos de secuencia suplementaria 1-5).<ol><li>ADN genómico en ARG4: Ver sección 6.3.1.1.</li>
			<li>Eficiencia de la ligadura intramolecular en YLR050C: Utilice la digestión HindIII para crear un fragmento de 765 pb que se someterá a la ligadura intramolecular en paralelo con la ligadura DLE. La amplificación a través de esta unión de ligadura informa sobre la eficiencia de la ligadura intramolecular y sirve como un control al que se normaliza la señal DLE.</li>
			<li>Inducción del OSD: Véase la sección 6.3.1.3.</li>
			<li>Cierva III restauración y corte del sitio de reconocimiento: Utilice olWDH2010/olWDH2012 y olWDH2009/2011 para amplificar una región que abarca los sitios de enzimas de restricción HindIII en la hebra rota donde se ha resecado y extendido, respectivamente.</li>
		</ol></li>
		<li>Señal DLE: Utilice olWDH2009/olWDH2010 para amplificar la molécula de ADN quimérico creada por la ligadura intramolecular del extremo resecado de la hebra invasora aguas arriba del DSB al extremo recién extendido aguas abajo del DSB.</li>
		<li>Análisis: Calcular la media y la desviación estándar de los valores de Cp para cada una de las reacciones duplicadas. Utilice los valores de Cp de qPCR de ADN genómico ARG4 como referencia para normalizar todas las demás qPCR de control. Normalizar la señal DLE al control de ligadura intramolecular en YLR050C. Los valores típicos de la señal DLE a las 6 h se informan en la Figura 4 y en publicaciones anteriores9.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45 (1), 247-271 (2011).</li>
<li>Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+recombination+and+genomic+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of recombination and genomic maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), 016501(2015).</li>
<li>Mimitou, E. P., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sae2%2C+Exo1+and+Sgs1+collaborate+in+DNA+double-strand+break+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sae2, Exo1 and Sgs1 collaborate in DNA double-strand break processing.</a> Nature. 455 (7214), 770-774 (2008).</li>
<li>Bzymek, M., Thayer, N. H., Oh, S. D., Kleckner, N., Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Holliday+junctions+are+intermediates+of+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Double Holliday junctions are intermediates of DNA break repair.</a> Nature. 464 (7290), 937-941 (2010).</li>
<li>Chen, H., Lisby, M., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RPA+coordinates+DNA+end+resection+and+prevents+formation+of+DNA+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RPA coordinates DNA end resection and prevents formation of DNA hairpins.</a> Molecular Cell. 50 (4), 589-600 (2013).</li>
<li>Mazón, G., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mph1+and+Mus81-Mms4+prevent+aberrant+processing+of+mitotic+recombination+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mph1 and Mus81-Mms4 prevent aberrant processing of mitotic recombination intermediates.</a> Molecular Cell. 52 (1), 63-74 (2013).</li>
<li>Saini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+bubble+during+break-induced+replication+drives+conservative+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Migrating bubble during break-induced replication drives conservative DNA synthesis.</a> Nature. 502 (7471), 389-392 (2013).</li>
<li>Piazza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+processing+of+displacement+loops+during+recombinational+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic processing of displacement loops during recombinational DNA repair.</a> Molecular Cell. 73 (6), 1255-1266 (2019).</li>
<li>Piazza, A., Koszul, R., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximity+ligation-based+method+for+quantitative+measurement+of+D-loop+extension+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">A proximity ligation-based method for quantitative measurement of D-loop extension in S. cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 601, 27-44 (2018).</li>
<li>Sugawara, N., Wang, X., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+roles+of+Rad52%2C+Rad54%2C+and+Rad55+proteins+in+Rad51-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo roles of Rad52, Rad54, and Rad55 proteins in Rad51-mediated recombination.</a> Molecular Cell. 12 (1), 209-219 (2003).</li>
<li>Renkawitz, J., Lademann, C. A., Kalocsay, M., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+homology+search+during+DNA+double-strand+break+repair+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Monitoring homology search during DNA double-strand break repair in vivo.</a> Molecular Cell. 50 (2), 261-272 (2013).</li>
<li>Petukhova, G., Stratton, S., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+of+homologous+DNA+pairing+by+yeast+Rad51+and+Rad54+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Catalysis of homologous DNA pairing by yeast Rad51 and Rad54 proteins.</a> Nature. 393 (6680), 91-94 (1998).</li>
<li>Wright, W. D., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+functions+as+a+heteroduplex+DNA+pump+modulated+by+its+DNA+substrates+and+Rad51+during+D-loop+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 functions as a heteroduplex DNA pump modulated by its DNA substrates and Rad51 during D-loop formation.</a> Molecular Cell. 53 (3), 420-432 (2014).</li>
<li>Tavares, E. M., Wright, W. D., Heyer, W. -D., Cam, E. L., Dupaigne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+role+of+Rad54+in+Rad51-ssDNA+filament-dependent+homology+search+and+synaptic+complexes+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In vitro role of Rad54 in Rad51-ssDNA filament-dependent homology search and synaptic complexes formation.</a> Nature Communications. 10 (1), 4058(2019).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181 (6), 1380-1394 (2020).</li>
<li>Lydeard, J. R., Jain, S., Yamaguchi, M., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break-induced+replication+and+telomerase-independent+telomere+maintenance+require+Pol32%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Break-induced replication and telomerase-independent telomere maintenance require Pol32.</a> Nature. 448 (7155), 820-823 (2007).</li>
<li>Jain, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombination+execution+checkpoint+regulates+the+choice+of+homologous+recombination+pathway+during+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A recombination execution checkpoint regulates the choice of homologous recombination pathway during DNA double-strand break repair.</a> Genes & Development. 23 (3), 291-303 (2009).</li>
<li>Donnianni, R. A., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Break-induced+replication+occurs+by+conservative+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Break-induced replication occurs by conservative DNA synthesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13475-13480 (2013).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+break-induced+replication+shows+that+it+stalls+at+roadblocks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tracking break-induced replication shows that it stalls at roadblocks.</a> Nature. 590 (7847), 655-659 (2021).</li>
<li>Liu, L., Sugawara, N., Malkova, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+kinetics+of+break-induced+replication+%28BIR%29+by+the+assay+for+monitoring+BIR+elongation+rate+%28AMBER%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Determining the kinetics of break-induced replication (BIR) by the assay for monitoring BIR elongation rate (AMBER).</a> Methods in Enzymology. 661, 139-154 (2021).</li>
<li>Pham, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+restraining+break-induced+replication+at+two-ended+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanisms restraining break-induced replication at two-ended DNA double-strand breaks.</a> The EMBO Journal. 40 (10), 104847(2021).</li>
<li>Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralens+as+photoactive+probes+of+nucleic+acid+structure+and+function%3A+Organic+chemistry%2C+photochemistry%2C+and+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry.</a> Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).</li>
<li>Yeung, A. T., Dinehart, W. J., Jones, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkali+reversal+of+psoralen+cross-link+for+the+targeted+delivery+of+psoralen+monoadduct+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkali reversal of psoralen cross-link for the targeted delivery of psoralen monoadduct lesion.</a> Biochemistry. 27 (17), 6332-6338 (1988).</li>
<li>Shi, Y. B., Spielmann, H. P., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-catalyzed+reversal+of+a+psoralen-DNA+cross-link%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Base-catalyzed reversal of a psoralen-DNA cross-link.</a> Biochemistry. 27 (14), 5174-5178 (1988).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+Mph1+helicase+dissociates+Rad51-made+D-loops%3A+Implications+for+crossover+control+in+mitotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Yeast Mph1 helicase dissociates Rad51-made D-loops: Implications for crossover control in mitotic recombination.</a> Genes & Development. 23 (1), 67-79 (2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srs2+promotes+synthesis-dependent+strand+annealing+by+disrupting+DNA+polymerase+%CE%B4-extending+D-loops%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Srs2 promotes synthesis-dependent strand annealing by disrupting DNA polymerase δ-extending D-loops.</a> eLife. 6, 22195(2017).</li>
<li>Fasching, C. L., Cejka, P., Kowalczykowski, S. C., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top3-Rmi1+dissolve+Rad51-mediated+D+loops+by+a+topoisomerase-based+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Top3-Rmi1 dissolve Rad51-mediated D loops by a topoisomerase-based mechanism.</a> Molecular Cell. 57 (4), 595-606 (2015).</li>
<li>Shah, S. S., Hartono, S. R., Chédin, F., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisulfite+treatment+and+single-molecule+real-time+sequencing+reveal+D-loop+length%2C+position%2C+and+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Bisulfite treatment and single-molecule real-time sequencing reveal D-loop length, position, and distribution.</a> eLife. 9, 59111(2020).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los ensayos presentados permiten la detección de bucles D nacientes y extendidos (ensayo DLC), extensión de bucle D (ensayo DLE) y formación de productos BIR (ensayo DLE sin oligonucleótidos hibridantes) utilizando ligadura de proximidad y qPCR. La ChIP-qPCR de Rad51 a sitios distantes del DSB se ha utilizado previamente como un proxy para la búsqueda de homología mediada por Rad51 y la formación de bucle D. Sin embargo, esta señal ChIP-qPCR es independiente de la homología de secuencia entre el sitio de ruptura y un don...

La recombinación homóloga (HR) es un mecanismo de alta fidelidad de reparación de roturas bicatenarias de ADN (DSB), enlaces cruzados entre cadenas y brechas de ssDNA, así como una vía para la tolerancia al daño del ADN. La FC difiere de las vías propensas a errores para la reparación/tolerancia al daño del ADN, como la unión de extremos no homólogos (NHEJ) y la síntesis de translesiones, en que utiliza un ADN dúplex homólogo intacto como donante para modelar el evento de reparación. Además, muchos de los intermedios clave en la vía de FC son reversibles, lo que permite una regulación exquisita de los pasos individuales de la vía. Durante las fases S, G2 y M del ciclo celular, HR compite con NHEJ para la reparación de los DSB de dos extremos1. Además, la FC es esencial para la replicación del ADN para la reparación del daño del ADN asociado a la replicación, incluidas las brechas de ssDNA y los DSB unilaterales, y como mecanismo de derivación de la lesión del ADN2.
Un intermediario crítico en la vía HR es el bucle de desplazamiento, o bucle D (Figura 1). Después de la resección final, la recombinasa central en la reacción, Rad51, se carga sobre el ssDNA recién resecado de la molécula rota, formando un filamento helicoidal2. Rad51 luego lleva a cabo una búsqueda de homología para identificar un donante homólogo adecuado, típicamente la cromátida hermana en células somáticas. El D-loop se forma cuando el filamento Rad51-ssDNA invade un ADN dúplex homólogo, lo que conduce al emparejamiento de la base Watson-Crick de la hebra rota con la hebra complementaria del donante, desplazando la hebra donante opuesta. La extensión del extremo 3' de la hebra rota por una ADN polimerasa reemplaza las bases que se perdieron durante el evento de daño del ADN y promueve la resolución del intermedio de bucle D extendido en un producto de dsDNA a través del recocido de hebra dependiente de la síntesis (SDSA), la unión de doble Holliday (dHJ) o las subvías HR de replicación inducida por rotura (BIR).
Los ensayos que monitorean físicamente los intermediarios en la vía HR permiten el análisis de los requisitos genéticos para cada paso (es decir, análisis de vía). La formación de DSB, la resección final, las dHJ, las burbujas de replicación BIR y los productos HR se observan fácilmente mediante Southern blotting 3,4,5,6,7. Sin embargo, Southern blotting no informa sobre los bucles D nacientes y extendidos y, por lo tanto, se requiere un método alternativo para medir de manera confiable estas moléculas conjuntas 4,8,9. Una estrategia ampliamente utilizada para analizar la formación naciente del bucle D es la inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) de Rad51 junto con la PCR cuantitativa (qPCR)10,11. Sin embargo, la asociación de Rad51 con dsDNA medida por ChIP-qPCR es independiente de la homología de secuencia y del factor accesorio Rad51 Rad5410,11. En contraste, una señal apreciable utilizando el método de análisis de bucle D presentado aquí, llamado ensayo de captura de bucle D (DLC), depende de la formación de DSB, homología de secuencia, Rad51 y las proteínas accesorias Rad51 Rad52 y Rad548. El hallazgo de que la formación del bucle D promovido por Rad51 por Saccharomyces cerevisiae depende de Rad54 in vivo está de acuerdo con numerosos experimentos de reconstitución in vitro que indican que Rad54 es necesario para la búsqueda de homología y la formación del bucle D por la levadura en ciernes Rad51 8,12,13,14,15.
Los enfoques actuales para medir la extensión del bucle D, principalmente a través de PCR semicuantitativa, son igualmente problemáticos. Un ensayo típico basado en PCR para detectar la extensión del bucle D amplifica una secuencia única, resultante de la recombinación entre un sitio de ruptura y un donante ectópico y la posterior síntesis de ADN asociada a la recombinación, a través de un cebador aguas arriba de la región de homología en la hebra rota y otro cebador aguas abajo de la región de homología en la cadena donante. Utilizando este método, la detección de la síntesis de ADN asociada a la recombinación requiere el factor de procesividad Pol δ no esencial Pol3216. Este hallazgo entra en conflicto con la observación de que la eliminación de POL32 tiene solo un efecto leve sobre la conversión génica in vivo17. Además, estos ensayos basados en PCR no logran resolver temporalmente la extensión del bucle D y la formación del producto BIR, lo que sugiere que la señal resulta de productos de dsDNA en lugar de intermedios de ssDNA17,18,19. El ensayo de extensión de bucle D (DLE) se desarrolló recientemente para abordar estas discrepancias. El ensayo DLE cuantifica la síntesis de ADN asociada a la recombinación en un sitio ~ 400 pares de bases (pb) aguas abajo del extremo invasor inicial3' 9. Mediante este método, la extensión del bucle D es independiente de Pol32 y es detectable dentro de las 4 h posteriores a la inducción DSB, mientras que los productos BIR se observan por primera vez a las 6 h. De hecho, una publicación reciente de los laboratorios Haber y Malkova señaló que el uso de este método de preparación de ADN genómico resulta singularmente en la preservación del ssDNA 9,20.
Aquí, los ensayos DLC y DLE se describen en detalle. Estos ensayos se basan en la ligadura de proximidad para detectar bucles D nacientes y extendidos en S. cerevisiae (Figura 2)8,9. Los productos BIR se pueden cuantificar utilizando este mismo sistema de ensayo. Para ambos ensayos, la formación de DSB en un sitio de corte de endonucleasa HO ubicado en el locus URA3 en el cromosoma (Chr.) V es inducida por la expresión de la endonucleasa HO bajo el control de un promotor inducible por galactosa. La invasión de la cadena de ADN mediada por Rad51 conduce a la formación naciente del bucle D en el sitio de un donante ectópico ubicado en el locus LYS2 en Chr. II. Como el lado derecho del DSB carece de homología con el donante, la reparación a través de SDSA y la formación de dHJ no es factible. La reparación inicial del DSB por BIR es posible, pero la formación de productos viables es inhibida por la presencia del centrómero21. Este diseño deliberado impide la reparación productiva de DSB, evitando así la reanudación del crecimiento de las células con DBS reparadas, que de otro modo podrían superar el cultivo durante el análisis del curso del tiempo.
En el ensayo DLC, la reticulación de psoraleno de las dos hebras del ADN heterodúplex dentro del bucle D preserva el intermedio de recombinación. Después de la restauración del sitio de la enzima de restricción en la hebra rota (resecada) y la digestión, la reticulación permite la ligadura de las secuencias únicas aguas arriba de los ADN rotos homólogos y donantes. Usando qPCR, se cuantifica el nivel de molécula de ADN quimérico presente en cada muestra. En el ensayo DLE, no se requiere reticulación, y la restauración del sitio de la enzima de restricción y la digestión seguida de la ligadura intramolecular en su lugar vinculan el extremo 5' de la molécula rota al extremo 3' recién extendido. Una vez más, la qPCR se utiliza para cuantificar las cantidades relativas de este producto quimérico en cada muestra. En ausencia de restauración del sitio de la enzima de restricción, el ensayo DLE informa sobre los niveles relativos del producto BIR (dsDNA) que se forma después de la extensión del bucle D.
Se muestran los resultados representativos de cada ensayo con una cepa de tipo salvaje, y los lectores son remitidos a Piazza et al.8 y Piazza et al.9 para el uso de estos ensayos para el análisis de mutantes de recombinación 8,9. La intención de esta contribución es permitir que otros laboratorios adopten los ensayos DLC y DLE, y el soporte para ellos está disponible a pedido.

<table><tbody><tr><td><fuerte>1. Precrecimiento, inducción DSB y recolección de muestras</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 y 50 mL Tubos cónicos de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubos de cultivo de vidrio de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL, 500 mL o 1 L Matraces</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>60 mm x 15 mm Placas de Petri ópticamente transparentes con fondo</td><td></td> plano<td></td><td>Sugerido: Corning, número de catálogo 430166; o Genesee Scientific, número de catálogo 32-150G</td></tr><tr><td>Centrífuga de sobremesa con adaptadores</td><td></td><td></td><td></td>de tubo cónico de 15 y 50 mL</tr><tr><td>Agitador orbital de sobremesa o rotador/revólver</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reticulante UV rotador</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>o caja de luz con bombillas UV de 365 nm colocadas encima de un agitador</td><td></td><td></td> <td>orbitalSugerido: Spectrolinker XL-1500 UV Crosslinker (Spectronics Corporation) o Vilbert Lourmat BLX-365 BIO-LINK, número de catálogo 611110831</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60% w/w jarabe de DL-lactato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1375</td><td>Para la preparación de medios</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423500</td><td>Para la preparación de medios</td></tr><tr><td>Bacto peptona</td><td>BD Difco</td><td>211840</td><td>Para la preparación de medios</td></tr><tr><td>Extracto de levadura Bacto</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td>Para</td></tr><tr><td>la preparación de medios D-(+)-glucosa</td><td>BD Difco</td><td>0155-17-4</td><td>Para la preparación de medios</td></tr><tr><td>Trioxsalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6137</td><td>Para reticulación de psoraleno</td></tr> <tr><td>2. Esferoplasto, lisis y restauración del sitio de la enzima de restricción</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Suministros</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Tubos de</td><td></td><td></td><td></td>microcentrífuga</tr><tr><td>Baño</td><td></td><td></td><td></td>seco</tr><tr><td>Nitrógeno líquido o hielo seco/etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga refrigerada o microcentrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X tampón de enzima de restricción (CutSmart) (500 mM de acetato de potasio, 200 mM de acetato de tris, 100 mM de acetato de magnesio, 1 mg/mL BSA, pH 7.8-8.0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>US Biological</td><td>Z1004</td><td>Para esferoplasting</td></tr><tr><td><fuerte>3. Digestión de enzimas de restricción y ligadura intramolecular</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Suministros</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>baño</td><td></td><td></td><td></td> de agua</tr><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101</td><td>Digestión de enzimas de restricción para el ensayo DLC</td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3104</td><td>Digestión de enzimas de restricción para el ensayo DLE</td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligadura intramolecular</td></tr><tr><td><fuerte>4. Purificación de ADN</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Suministros</td></fuerte><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 y 2 mL de tubos de microcentrífuga</td><fuerte>Materiales</fuerte>fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (P/C/IA) a 25:24:1 Sigma-Aldrich P2069 purificación de ADN <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>5. Inversión de reticulación > psorale</fuerte<</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fuerte>Suministros</fuerte></td>Termociclador/Máquina <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>de <td>PCR</td></tr><tr><td><fuerte>6. qPCR</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Suministros</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480</td><td>Roche</td><td>5015278001</td><td>Máquina de qPCR utilizada por los autores</td></tr><tr><td>Lightcycler 96</td><td>Roche</td><td>5815916001</td><td>máquina de qPCR utilizada por los autores</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Placa de 96 pocillos, placa blanca</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>de 96 pocillos para qPCR</td></tr><tr><td>SsoAdvanced Universal SYBR Green Super Mix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>kit de qPCR utilizado por los autores</td></tr><tr><td>SYBR Green I Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>kit de qPCR utilizado por los autores</td></tr></tbody></table>

detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y pcr cuantitativa en saccharomyces cerevisiae

Detection of Homologous Recombination Intermediates via Proximity Ligation and Quantitative PCR in Saccharomyces cerevisiae

El daño del ADN, incluidas las roturas de doble cadena del ADN y los enlaces cruzados entre cadenas, incurridos durante las fases S y G2 del ciclo celular pueden repararse mediante recombinación homóloga (HR). Además, HR representa un mecanismo importante de rescate de la bifurcación de replicación después de un estancamiento o colapso. La regulación de los muchos pasos reversibles e irreversibles de esta compleja vía promueve su fidelidad. El análisis físico de los intermedios de recombinación formados durante la FC permite la caracterización de estos controles por diversos factores de nucleoproteínas y sus interactores. Aunque existen métodos bien establecidos para evaluar eventos específicos e intermedios en la vía de recombinación, la detección de la formación y extensión del bucle D, dos pasos críticos en esta vía, ha demostrado ser un desafío hasta hace poco. Aquí, se describen métodos eficientes para detectar eventos clave en la vía HR, a saber, la formación de rotura de doble cadena de ADN, la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos a través de la replicación inducida por rotura (BIR) en Saccharomyces cerevisiae . Estos ensayos detectan sus intermedios de recombinación relevantes y productos con alta sensibilidad y son independientes de la viabilidad celular. La detección de D-loops, extensión D-loop y el producto BIR se basa en la ligadura de proximidad. Juntos, estos ensayos permiten el estudio de la cinética de la FC a nivel de la población para abordar con precisión las funciones de las proteínas y reguladores de la FC en pasos significativos en la vía.

Ensayo DLC El ensayo DLC detecta bucles D nacientes y extendidos formados por la invasión de un DSB específico del sitio en un solo donante (Figura 2). La reticulación del psoraleno une físicamente la hebra rota y el donante a través del ADN heterodúplex dentro del bucle D. La restauración del sitio de la enzima de restricción con un oligo hibridante largo en la hebra resecada de la ruptura permite la escisión de la enzima de restricción, seguida de la ligadura d...

Los ensayos de captura de bucle D (DLC) y extensión de bucle D (DLE) utilizan el principio de ligadura de proximidad junto con PCR cuantitativa para cuantificar la formación de bucle D, la extensión del bucle D y la formación de productos en el sitio de una ruptura ducible de doble cadena en Saccharomyces cerevisiae.

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

DNA damage, including DNA double-stranded breaks and inter-strand cross-links, incurred during the S and G2 phases of the cell cycle can be repaired by ...

Los ensayos de captura y extensión del bucle D son los primeros en permitir la cuantificación imparcial y directa de los pasos de formación y extensión del bucle D durante la recombinación homóloga en células de levadura en crecimiento mitótico. Esta técnica independiente de la viabilidad permite el estudio de proteínas en el metabolismo del bucle D que de otro modo no sería posible desenredar de los roles posteriores, simplemente mirando los productos BIR. En el futuro, prevemos la transición de estos ensayos a células humanas para comprender mejor el papel de las proteínas clave, incluidos BRCA2 y los casos de floración y kilo de Warner en la recombinación homóloga.Comience centrifugando las muestras durante cinco minutos. Resuspenda el pellet en 2,5 mililitros de 1x solución de psoraleno y transfiéralo a una placa de Petri de 60 por 15 milímetros. Para ningún control de reticulación, resuspenda el pellet en 2,5 mililitros de solución TE1.A continuación, coloque la fuente de luz UV en la parte superior del agitador orbital, configurada a 50 RPM. Para entrecruzar las muestras utilizando un reticulante UV con bombillas de onda larga de 365 nanómetros. Coloque las placas de Petri de uno a dos centímetros por debajo de la fuente de luz UV durante 10 minutos agitando suavemente una placa de plástico o plexiglás previamente enfriada.Luego transfiera la muestra a un nuevo tubo de 15 mililitros. Enjuague la placa de Petri con 2,5 mililitros de solución TE1 y agréguela al tubo. Centrifugar las muestras durante cinco minutos.Deseche el sobrenadante y guarde el pellet a menos 20 grados centígrados. Coloque las muestras en hielo para descongelarlas. Simultáneamente, precaliente un baño seco a 30 grados centígrados.Resuspender las muestras en un mililitro de tampón de esferoplasting y transferirlas a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Luego agregue 3.5 microlitros de solución de zymolyase y mezcle suavemente golpeando. Incubar a 30 grados centígrados durante 15 minutos.Y luego coloque los tubos sobre hielo. Centrifugar durante tres minutos y colocar las muestras en hielo. Lave las muestras tres veces en un tampón de esferaturado de mililitro y centrifugar las muestras durante tres minutos.Resuspender las muestras en un mililitro de tampón enzimático de restricción fría. Centrifugar durante tres minutos y colocar las muestras en hielo. Repita el lavado una vez.Resuspender las muestras en un mililitro de tampón enzimático de restricción 1x frío. Divida la muestra en partes iguales en dos. Centrifugar las muestras durante tres minutos a 16.000 g a cuatro grados centígrados.Resuspender un tubo de cada muestra en 180 microlitros de tampón enzimático de restricción 1.4x con oligos hibridantes y otro tubo en 180 microlitros de tampón enzimático de restricción 1.4x sin oligos hibridantes. Congele rápidamente las muestras en nitrógeno líquido. Descongele las muestras en hielo.Precaliente un baño seco a 65 y otro a 37 grados centígrados. Alícuota 36 microlitros de la muestra en un nuevo tubo de microcentrífuga y cuatro microlitros de 1% SDS y mezclar golpeando suavemente el lado del tubo. Incubar a 65 grados centígrados durante 15 minutos con golpecitos suaves cada cinco minutos.Colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación. Añadir 4,5 microlitros de Triton X-100 al 10% y mezclar por pipeteo. Agregue de 20 a 50 unidades de enzima de restricción EcoR1 o HindIII de alta fidelidad a cada muestra.E incubar a 37 grados centígrados durante una hora con una agitación suave cada 20 a 30 minutos. Durante este tiempo, baño seco precalentado a 55 grados centígrados y un baño de agua a 16 grados centígrados. Agregue 8.6 microlitros de 10% SDS a cada muestra y mezcle pipeteando y roscando.Incubar a 55 grados centígrados durante 10 minutos. Añadir 80 microlitros de Triton X-100 al 10% a cada muestra y mezclar por pipeteo. Agregue 660 microlitros de 1x tampón de ligadura sin ATP, un ATP milimolar a pH 8.0 y ocho unidades de ADN ligasa T4 a cada muestra, y mezcle suavemente por inversión.Incubar 16 grados centígrados durante 1,5 horas con una inversión cada 30 minutos. Colocar las muestras en hielo inmediatamente después de la incubación. Después de la purificación del ADN como se describe en el protocolo, use dos microlitros de ADN purificado para configurar una reacción qPCR de 20 microlitros de acuerdo con las instrucciones del fabricante.Para cada muestra, configure cinco reacciones de control y una reacción de cuantificación y ejecútelas por duplicado. El análisis del ensayo DLC dos horas después de la rotura de doble cadena o la inducción DSB mostró que la reticulación del psoraleno es crítica y la eficiencia depende del tiempo entre la recolección de la muestra y la qPCR. Los valores de ARG4 Cp fueron similares entre las muestras reticuladas, pero más bajos para la muestra sin reticulación, ya que el ADN sin enlaces cruzados amplifica de manera más eficiente.Para todas las muestras, el control de qPCR de ligadura intermolecular estuvo dentro del rango. La inducción DSB robusta se evidenció por una señal de qPCR baja para el control que amplifica a través del sitio de reconocimiento de endonucleasa HO. Se observaron resultados similares para el control de qPCR EcoR1.La señal DLC con oligo hibridante se calculó normalizando al control de ligadura intermolecular. El análisis del ensayo DLE realizado a las seis horas posteriores a la inducción DSB mostró que los valores de CP de ARG4 fueron similares entre la muestra con y sin oligos hibridantes. El control de qPCR de ligadura intermolecular reveló una señal aceptable para la muestra con y sin oligos hibridantes, pero una señal menor para la muestra fallida.En las tres muestras, hubo una inducción DSB robusta. Dado que la escisión de HindIII depende de la restauración del sitio de la enzima de restricción por el oligo hibridante. Hubo una diferencia significativa en la amplificación a través del sitio de escisión HindIII en la hebra resecada entre el ancho y sin muestras oligo.Se observó una diferencia menor en la amplificación a través del sitio en la hebra extendida porque aquí la escisión HindIII también depende de la extensión. Las muestras y el tampón deben mantenerse fríos en todo momento. Las muestras deben congelarse rápidamente después de la resuspensión en tampón enzimático de restricción fría 1.4x con o sin oligos hibridantes.Los efectos posteriores de la formación y extensión del bucle D en la formación del producto pueden estudiarse mediante Southern blotting o ensayos genéticos de punto final. Los efectos sobre la búsqueda de homología pueden investigarse utilizando PC alto. La inmunoprecipitación de cromatina puede proporcionar información sobre el reclutamiento de una proteína de interés.

detection-homologous-recombination-intermediates-via-proximity

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El ensayo de translocación HO-estimulado monitores de una sola hebra de recocido después de la creación de ADN de doble filamento se rompe en múltiples loci en...

Cuantificación y análisis de la formación de HO-endonucleasa Estimulado translocaciones cromosómicas por un solo capítulo recocido en Saccharomyces cerevisiae</em

En este video, describimos la técnica de Southern blot para identificar eventos de recombinación homólogos en el genoma de células madre embrionarias de ratón utilizando sondas radiomarcadas. Las regiones de ADN que contienen eventos de recombinación homólogos aparecen como bandas distintas cuando la membrana que contiene el ADN unido a la sonda se expone a los rayos X.

Southern Blotting para detectar recombinaciones homólogas en el genoma de células madre embrionarias de ratón

Este manuscrito describe el procedimiento experimental y el análisis de software para un ensayo de sitio de integración bidireccional que puede analizar simultáneamente el ADN de unión vector-huésped aguas arriba y aguas abajo. Los productos de PCR bidireccionales pueden utilizarse para cualquier plataforma de secuenciación aguas abajo. Los datos resultantes son útiles para una comparación cuantitativa de alto rendimiento de dianas de ADN integradas.

Sitio de Integración Retroviral Bidireccional Metodología de PCR y Flujo de Trabajo de Análisis de Datos Cuantitativos

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Ribonucleótidos están entre los nucleótidos no canónico más abundantes incorporados en el genoma durante la replicación del ADN nuclear eucariótica. Si no quitado, ribonucleótidos pueden causar mutagénesis y daño de la DNA. Presentamos dos enfoques experimentales que se utilizan para evaluar la abundancia de incorporación ribonucleótido en ADN y sus efectos mutagénicos.

Estudio incorporación de ribonucleótido: Filamento específicos detección de ribonucleótidos en el genoma de levadura medir mutagénesis inducida por la ribonucleótido

Aquí, presentamos un protocolo detallado para la identificación de eventos de recombinación homóloga que se produjeron en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot o PCR. Este método es ejemplificado por la generación de modelos UROLOGICAL miosina II reemplazo genético ratón tecnología tradicional embrionario basada en células madre homólogo mediada por la recombinación dirigida a.

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa

La hemizigosidad recíproca a través de la secuenciación (RH-seq) es un nuevo y poderoso método para mapear la base genética de una diferencia de rasgos entre especies. Los grupos de hemizygotes son generados por la mutagénesis de la transposon y su estado físico es rastreado a través del crecimiento competitivo usando la secuenciación alta a lo largo de la secuenciación. El análisis de los datos resultantes identifica los genes subyacentes al rasgo.

Mapeo genético de las diferencias de termotolerancia entre especies de levadura Saccharomyces a través del análisis de hemizygosity recíproca en todo el genoma

Aquí, describimos la utilización de Grafix (Gradient Fixation), una centrifugación de gradiente de glicerol en presencia de un ticulador, para identificar interacciones entre factores de empalme que se unen transitoriamente al complejo de espliceosomas.

Utilización de Grafix para la detección de interactores transitorios de subcomplejos de Saccharomyces cerevisiae Spliceosome

Este trabajo describe un protocolo para un cribado genético supresor multicopia en Schizosaccharomyces pombe. Esta pantalla utiliza una biblioteca de plásmidos de todo el genoma para identificar clones supresores de un fenotipo de pérdida de función asociado con una cepa mutante de consulta. Los nuevos supresores genéticos del mutante nulo ell1 se identificaron utilizando esta pantalla.

Cribado genético para la identificación de supresores multicopia en Schizosaccharomyces pombe

Describimos dos protocolos complementarios para determinar con precisión la duración de la fase S en S. cerevisiae utilizando EdU, un análogo de la timidina, que se incorpora in vivo y se detecta mediante química Click por microscopía y citometría de flujo. Permite la fácil caracterización de la duración de la replicación del ADN y los defectos de replicación pasados por alto en los mutantes.

Determinación de la duración de la fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina en Saccharomyces cerevisiae

Este protocolo presenta un método de aislamiento de cromatina específico de locus basado en la recombinación específica del sitio para purificar un locus de gen de una sola copia de interés en su contexto de cromatina nativa a partir de la levadura en ciernes, Saccharomyces cerevisiae.

Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en Saccharomyces cerevisiae

Aprende a cuantificar la formación y extensión de bucles D durante la recombinación homóloga en Saccharomyces cerevisiae mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa. Esta técnica permite estudiar proteínas clave en el metabolismo de bucles D.

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae (Video) | JoVE Journal

Detección de intermediarios de recombinación homóloga mediante ligadura de proximidad y PCR cuantitativa en Saccharomyces cerevisiae

Explorar más videos