Name: Determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Aprende a determinar la afinidad de unión entre un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica. Este protocolo detalla la preparación de muestras, el análisis de datos termodinámicos y la interpretación de parámetros cinéticos sin necesidad de marcado.

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Esta investigación fue apoyada por la financiación de investigación y desarrollo de Aptagen LLC.

NOTA: La Figura 2 muestra los pasos principales del experimento ITC para determinar la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina.
1. Preparación de las muestras
NOTA: Las muestras para ITC deben prepararse en el mismo tampón tanto para el aptámero como para el ligando, a fin de evitar la liberación de calor causada por la mezcla de diferentes tampones de la celda y la jeringa de la muestra. Esto generalmente se logra a través de la diálisis de todos los materiales en el mismo tampón. El tampón se intercambia utilizando un protocolo adaptado del protocolo de un concentrador de corte de peso molecular (MWC) de 3 kDa con algunas modificaciones, como se muestra a continuación:
<ol><li>Active la membrana de la columna de diálisis (3 kDa MWC) con 1x PBS, pH 7.4, comprada al fabricante, siguiendo los siguientes pasos: llene con 1x tampón (PBS), equilibre durante 10 min a RT y centrifugar a 5,000 x g durante 15 min.</li>
	<li>Retire el tampón y cargue 500 μL de muestras de aptámero en la columna, centrifugar a 5.000 x g y repetirlo 4 veces para cambiar el tampón original por 1x PBS. Cuando el tampón atraviesa la membrana, todas las moléculas con una masa inferior a 3 kDa pasarán a través de la membrana y el aptámero permanecerá en la parte superior de la membrana.</li>
	<li>Recoja el aptámero de ADN dializado con una pipeta y transfiéralo a los nuevos tubos de 1,5 ml.</li>
	<li>Recoja el último tampón de flujo para disolver la tetraciclina. El polvo de tetraciclina es puro y pequeño, por lo que no se necesita diálisis. Sin embargo, utilice el tampón dializado anterior para el ADN del objetivo para asegurarse de que el tampón para el experimento en la jeringa coincida con el tampón en la celda de referencia.</li>
	<li>Determine de nuevo la concentración del aptámero utilizando un espectrómetro UV-visible. Utilice el último tampón de intercambio para ajustar la concentración a 40 μM de tetraciclina y 2 μM de aptámero.</li>
	<li>Doblar el aptámero de ADN calentando a 90 °C durante 10 min, enfriando a 4 °C durante 10 min y luego volviendo a RT durante 20 min.</li>
	<li>Desgasifique el aptámero plegado y la tetraciclina dializada utilizando una estación de desgasificación o una bomba de vacío ajustada a 600 mmHg a 25 °C durante 25 min para eliminar los gases disueltos.</li>
</ol>2. Lavado del instrumento y funcionamiento del kit de prueba
<ol><li>Limpie los puertos de disolvente para asegurarse de que toda la ruta de la muestra esté despejada. Limpie desechando la solución residual y cargándola con metanol puro, agua y tampón. Cada puerto contiene más de 250 ml para garantizar suficiente solución para la limpieza. NOTA: El proceso de limpieza se completa automáticamente mediante un software de control ITC programable por el usuario.</li>
	<li>Pruebe la limpieza de la máquina ejecutando ITC usando buffer en un buffer (es decir, 1x PBS en 1x PBS). NOTA: Una línea base de ruido normal es visible entre el pequeño búfer en los picos de inyección de tampón. Cuando la jeringa de titulación y las cánulas se limpian adecuadamente y se secan por completo, la línea de base será estable; Un aumento o disminución en la línea de base refleja instrumentación sucia o burbujas dentro del instrumento, que deben corregirse antes de ejecutar muestras reales.</li>
	<li>Pruebe la precisión de la máquina con un kit estándar que incluye EDTA y CaCl2 (Figura 3), utilizando el programa predeterminado y siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
</ol>3. Ejecución de la muestra para determinar la unión entre el aptámero y la tetraciclina
<ol><li>Configure los parámetros de funcionamiento: una velocidad de agitación de 200 rpm, funcionando a 25 °C, 2 μM aptámero y 40 μM tetraciclina, 30 inyecciones con 2,0 μL cada una, un tiempo de retardo de 180 s.</li>
	<li>Compruebe los volúmenes necesarios utilizando una calculadora de programas en ejecución. Con este parámetro de ejecución, realice la medición ITC con 230 μL de tetraciclina de 40 μM en la jeringa ITC y 485 μL de aptámero de 2 μM en la celda de muestra ITC utilizando el ITC.</li>
	<li>Cargue las placas de jeringa de tetraciclina dializada y el aptámero plegado en la celda de muestra, evitando burbujas, utilizando una pipeta.</li>
	<li>Comience a ejecutar el instrumento ITC haciendo clic en el botón de inicio del software. NOTA: El proceso de funcionamiento del instrumento ITC está totalmente automatizado después de llenar manualmente la celda de referencia y las placas de muestra de valorante.</li>
</ol>4. Análisis de datos usando software
<ol><li>Abra el software de análisis de datos haciendo doble clic para comenzar a analizar los datos.</li>
	<li>Abra la ruta de los datos sin procesar guardados para conocer la tendencia de vincular.</li>
	<li>Abra la pestaña de modelado y utilice diferentes modelos de enlace para encontrar el que mejor se ajuste a la curva de datos. Luego, el software calcula automáticamente el termograma ITC y varios parámetros termodinámicos, incluida la entalpía (ΔH), la entropía (ΔS), la energía libre (ΔG), la constante de enlace de equilibrio (Ka) y la estequiometría.</li>
	<li>Recopile los parámetros termodinámicos determinados a partir de los datos y la información del modelo de ajuste.</li>
	<li>Cree un informe, que incluya imágenes del termograma ITC y varios parámetros termodinámicos, como se muestra en la Figura 4 y la Tabla 1.</li>
</ol>

<ol><li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249 (4968), 505-510 (1990).</li>
<li>Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aptasensors+for+environmental+monitoring+of+contaminants+in+water+and+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Environmental+Science+%26+Health%22%5BJournal%5D)">Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil.</a> Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).</li>
<li>Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aptamer+discovery+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of aptamer discovery and technology.</a> Nature Reviews Chemistry. 1, 0076(2017).</li>
<li>Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SELEX--A+%28r%29evolutionary+method+to+generate+high-affinity+nucleic+acid+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Engineering%22%5BJournal%5D)">SELEX--A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands.</a> Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).</li>
<li>Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+kinetics+by+isothermal+titration+calorimetry%3A+Allostery%2C+inhibition%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826(2020).</li>
<li>Velazquez-Campoy, A., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry+to+determine+association+constants+for+high-affinity+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands.</a> Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).</li>
<li>Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+aptamers+specific+for+antibiotics+tetracyclines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).</li>
<li>Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+aptasensor+for+tetracycline+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioprocess+and+Biosystems+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electrochemical aptasensor for tetracycline detection.</a> Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+indirect+competitive+assay-based+aptasensor+for+highly+sensitive+detection+of+tetracycline+residue+in+honey%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey.</a> Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).</li>
<li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+colorimetric+aptasensor+using+gold+nanoparticle+for+a+highly+sensitive+and+specific+detection+of+oxytetracycline%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).</li>
<li>Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+photosensitisation+processes+by+an+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer.</a> Scientific Reports. 7, 43272(2017).</li>
<li>Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+structure+and+thermodynamics+of+2%27%2C5%27+RNA+intercalation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Solution structure and thermodynamics of 2',5' RNA intercalation.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).</li>
<li>Sigurskjold, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exact+analysis+of+competition+ligand+binding+by+displacement+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry.</a> Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).</li>
<li>Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt-mediated+two-site+ligand+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).</li>
<li>Turnbull, W. B., Daranas, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+value+of+c%3A+Can+low+affinity+systems+be+studied+by+isothermal+titration+calorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry.</a> Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).</li>
<li>Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+reactions+for+the+amplification+of+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

El método presentado aquí fue modificado de acuerdo con las instrucciones de TA Instruments y es suficiente para determinar la afinidad de unión y la termodinámica de muchos aptámeros y objetivos seleccionados en nuestro centro. Los pasos cruciales de este procedimiento incluyen el intercambio del tampón para tener un objetivo que coincida con el ligando, ejecutar muestras con los parámetros adecuados y encontrar el modelo de ajuste de unión apropiado para analizar los datos. El registro continuo de la liberación de calo...

Los aptámeros son fragmentos de ssDNA o ARN seleccionados a través de un proceso de evolución con alta afinidad y especificidad de unión a las dianas deseadas1,2, que pueden funcionar como elementos de reconocimiento avanzado o anticuerpos químicos 3,4,5. Por lo tanto, la afinidad y especificidad de unión de los aptámeros a sus objetivos juegan un papel crucial en la selección y aplicación de un aptámero, y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se ha utilizado ampliamente para estos fines de caracterización. Se han utilizado muchos enfoques para determinar la afinidad de los aptámeros, incluyendo ITC, resonancia de plasmones de superficie (SPR), titulación colorimétrica, termoforesis a microescala (MST) e interferometría de biocapa (BLI). Entre ellas, ITC es una de las últimas técnicas para determinar la asociación termodinámica y cinética de dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración 6,7. A diferencia de otros métodos, ITC puede ofrecer afinidad de unión, varios sitios de unión y asociación termodinámica y cinética (Figura 1A). A partir de estos parámetros iniciales, los cambios de energía libre de Gibbs y los cambios de entropía se determinan utilizando la siguiente relación:
ΔG = ΔH-TΔS
Eso significa que ITC ofrece un perfil termodinámico completo de la interacción molecular para dilucidar los mecanismos de unión (Figura 1B). Determinar la afinidad de unión para moléculas pequeñas con un aptámero es difícil debido a los tamaños drásticamente diferentes entre el aptámero y el objetivo. Mientras tanto, ITC puede proporcionar mediciones sensibles sin etiquetar e inmovilizar moléculas, lo que proporciona un medio para mantener la estructura natural del aptámero y el objetivo durante la medición. Con los atributos mencionados, ITC se puede utilizar como el método estándar para la caracterización de la unión entre un aptámero y objetivos pequeños.
Después de la selección por parte del grupo Gu, este aptámero se integró con diferentes plataformas, incluidos biosensores electroquímicos basados en aptámeros, un ensayo competitivo de aptámero ligado a enzimas y una placa de microtitulación, que puede lograr una detección de alto rendimiento de tetraciclina 8,9,10. Sin embargo, sus características de unión no se han dilucidado lo suficientemente bien como para elegir la plataforma adecuada8; vale la pena caracterizar la unión del aptámero a la tetraciclina utilizando ITC.

<table><tbody><tr><td>5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGGGGGGGGGGGGGG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated</td> <td>DNA Technologies, Inc</td><td></td><td>La secuencia se adopta de la investigación de Gu, que no ha identificado Kd utilizando ITC (consulte las referencias 8 y 9)</td></tr><tr><td>Affinity ITC Auto Low Volume (190 &micro; L) Sistema completo&ndash; Gold Cells</td><td>TA Instruments</td><td>61000.901</td><td>Sistema de calorimetría de titulación isotérmica</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Avantor (VWR)</td><td>E506-100ML</td><td>Cloruro de calcio 1 M en solución acuosa, grado biotecnológico,</td></tr><tr><td>centrífuga</td> estéril <td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>La Eppendorf 5417R es insuperable en seguridad, fiabilidad y facilidad de uso. Muy fácil de mantener con un motor sin escobillas que gira hasta 16.400 RPM con RCF máximo de hasta 25.000 x g.</td></tr><tr><td>Estación de desgasificación completa (110/230V)</td><td>TA Instruments</td><td>6326</td><td>Este desgasificador proporciona una plataforma de agitación autónoma, una cámara de vacío, un puerto de vacío, un control de temperatura y un temporizador electrónico para la preparación adecuada de la muestra.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>TekNova</td><td>E0375</td><td>EDTA 500 mM, pH 7.5</td></tr><tr><td>NanoDrop One Microvolumen Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-ONE-W</td><td>Espectrofotómetro UV-Vis</td></tr><tr><td>Nanosep, Nanosep MF y NAB Dispositivos centrífugos</td><td>Pall Laboratory</td><td>OD030C34</td><td>3 kDa</td></tr> concentrador de corte de peso molecular <tr><td>PBS pH 7.4</td><td>IBI Scientific IB70165</td><td></td><td>Tampón que contiene fosfato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de potasio y cloruro de potasio Grado ultrapuro estéril filtrado con 0.2 y micro; Filtro M. Esterilizado en autoclave a 121 &deg; C durante más de 20 min.</td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL Tubos de Microcentrífuga de Tapa Grande</td><td>labForce (una marca de Thomas Scientific)</td><td>1149K01</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina, Hidrochorro</td><td>EMD Millipore Corperation</td><td>CAS64-75-5</td><td></td></tr></tbody></table>

determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de adn y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

La determinación de la afinidad y el comportamiento de unión entre un aptámero y su objetivo es el paso más crucial en la selección y el uso de un aptámero para su aplicación. Debido a las drásticas diferencias entre el aptámero y las moléculas pequeñas, los científicos deben esforzarse mucho en caracterizar sus propiedades de unión. La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es un enfoque poderoso para este propósito. ITC va más allá de determinar constantes de disociación (Kd) y puede proporcionar los cambios de entalpía y la estequiometría de unión de la interacción entre dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración, por lo que el proceso puede medir con sensibilidad la unión entre macromoléculas y sus pequeños objetivos. Aquí, el artículo presenta un procedimiento paso a paso de la medición ITC de un aptámero seleccionado con un objetivo pequeño, la tetraciclina. Este ejemplo demuestra la versatilidad de la técnica y su potencial para otras aplicaciones.

ITC proporciona una constante de disociación precisa (Kd), la estequiometría de unión y los parámetros termodinámicos de las interacciones de dos moléculas6. En este ejemplo, el aptámero seleccionado por Kim et al.9,11 se une a la tetraciclina con afinidades de unión de K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Curiosamente, esta unión se determinó utilizando el método de filtración de equili...

El presente protocolo describe el uso de la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para analizar la cinética de asociación y disociación de la unión entre un aptámero de ADN y tetraciclina, incluida la preparación de muestras, los patrones de ejecución y las muestras, y la interpretación de los datos resultantes.

Determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Este protocolo permite a los investigadores determinar las afinidades de unión de los aptámeros contra objetivos libres en solución, al tiempo que proporciona información sobre el mecanismo de unión. Debido a que ITC mide los cambios en el calor debido a la unión, ni el aptámero ni el ligando necesitan ser etiquetados o funcionalizados, como sería el caso de técnicas como SPR. Los nuevos usuarios deben prestar mucha atención a los búferes coincidentes en todos los componentes de enlace.Además, tenga en cuenta que la técnica tiene altos requisitos de muestra que pueden ser difíciles de cumplir para ligandos más grandes, como las proteínas. Para comenzar, active la membrana de la columna de diálisis, llene con tampón PBS, equilibre durante 10 minutos a temperatura ambiente y centrifugue a 5, 000 veces G durante 15 minutos. Retire el tampón y cargue 500 microlitros de muestras de aptámeros en la columna.Centrifugar a 5.000 veces G y repetirlo cuatro veces para cambiar el búfer original por PBS. Recoja el aptámero de ADN dializado con una pipeta y transfiéralo al nuevo tubo de 1,5 mililitros. Recoja el último tampón de flujo para disolver la tetraciclina.Asegúrese de que el tampón del experimento en la jeringa coincida con el tampón de la celda de referencia. Determine de nuevo la concentración del aptámero utilizando un espectrómetro UV-visible. Utilice el último tampón de intercambio para ajustar la concentración a tetraciclina 40 micromolares y aptámero de dos micromolares.Doble el aptámero de ADN calentando a 90 grados centígrados durante 10 minutos, enfriando a cuatro grados centígrados durante 10 minutos y luego volviendo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Desgasifique el aptámero plegado y la tetraciclina dializada utilizando una estación de desgasificación o una bomba de vacío durante 25 minutos para eliminar los gases disueltos. Después de limpiar y confirmar la limpieza de la máquina, pruebe la precisión de la máquina con un kit estándar que incluya EDTA y cloruro de calcio utilizando el programa predeterminado y siguiendo las instrucciones del fabricante.Configure los parámetros de ejecución. Compruebe los volúmenes necesarios utilizando una calculadora de programas en ejecución. Con este parámetro de ejecución, realice la medición ITC con 230 microlitros de tetraciclina 40 micromolares en la jeringa ITC y 485 microlitros de aptámero de dos micromolares en la celda de muestra ITC utilizando el ITC.Cargue las placas de jeringa de tetraciclina dializada y el aptámero plegado en la celda de muestra, evitando burbujas, utilizando una pipeta. Comience a ejecutar el instrumento ITC haciendo clic en el botón Inicio del software. Abra el software de análisis de datos haciendo doble clic para comenzar a analizar los datos.Abra la ruta de los datos sin procesar guardados para conocer la tendencia de vincular. Abra la pestaña Modelado y utilice diferentes modelos de enlace para encontrar el que mejor se ajuste a la curva de datos. Luego, el software calcula automáticamente el termograma ITC y varios parámetros termodinámicos, incluyendo entalpía, entropía, energía libre, constante de unión de equilibrio y estequiometría.Recopile los parámetros termodinámicos determinados a partir de los datos y la información del modelo de ajuste. Cree un informe que incluya imágenes del termograma ITC y varios parámetros termodinámicos. El aptámero seleccionado por Kim, et al se une a la tetraciclina con afinidades de unión de la constante de disociación uno es igual a 13 micromolar y la constante de disociación dos es igual a 53 nanomolar.El modelo de ajuste y la estequiometría de ITC reflejan que el aptámero se une a la tetraciclina a través de una relación de unión de 2:1 con el modelo de unión secuencial. Los parámetros termodinámicos determinados por la medición ITC para el sitio dos indicaron que la entalpía que supera la pérdida entrópica relativamente significativa impulsa la unión fuerte. La unión impulsada por entalpía con pérdida de entropía se relaciona con cambios conformacionales de ácidos nucleicos, que se han reportado como comportamientos de unión entre el ARN y una molécula pequeña.El aptámero y el ligando deben estar en el mismo tampón. El aptámero debe volver a plegarse si se desarrolla con repliegue, y las muestras deben desgasificarse. Abordar estas consideraciones asegurará que solo las interacciones aptámero-ligando contribuyan a la señal medida.Debido al tamaño del objetivo del aptámero, un método de seguimiento apropiado podría ser la termoforesis a microescala para confirmar la afinidad de unión medida libre en solución.

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Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

ITC es una herramienta poderosa para el estudio de la unión de un ligando a su anfitrión. En los sistemas complejos sin embargo, varios modelos pueden adaptarse bien a los datos. El método descrito aquí proporciona un medio para dilucidar el modelo de encuadernación adecuado para los sistemas complejos y extraer los parámetros termodinámicos correspondientes.

Recogida de concentración variable conjuntos de datos calorimetría de titulación isotérmica para determinar los mecanismos de enlace

Un protocolo general para el uso de la calorimetría de titulación isotérmica para controlar la termodinámica vinculante para los sistemas biológicos con moderada afinidad de unión se presenta.

Calorimetría de titulación isotérmica para la medición de macromoléculas-ligando de afinidad

Este video describe la anisotropía de fluorescencia de alto rendimiento que ayuda a monitorear la interacción entre los factores de transcripción y el ADN. El ensayo monitorea las interacciones de una molécula de ADN marcada con fluoróforos con su factor de transcripción específico midiendo el grado de polarización debido a la rotación molecular o anisotropía del ADN marcado con fluoróforos.

Anisotropía de fluorescencia para determinar la afinidad de unión entre el factor de transcripción y el ADN

Este video muestra la calorimetría diferencial de barrido, una técnica para estudiar la interacción entre una biomolécula y un ligando. La unión de un aptámero de ADN y un ligando termolábil se estudia mediante la aplicación de repetidos ciclos de calentamiento y enfriamiento a la muestra y la obtención de escaneos para el análisis termodinámico.

Calorimetría diferencial de barrido para estudiar la interacción entre el aptámero y el ligando termolábil del ADN

Medidas de calorimetría de titulación isotérmica flujo de calor liberado o absorbido en las reacciones químicas. Este método se puede utilizar para cuantificar la enzima-catálisis. En este trabajo, el protocolo para la configuración instrumental, experimento en marcha, y el análisis de datos se describe generalmente, y se aplica a la caracterización de la hidrólisis enzimática de la urea por la ureasa jack bean.

Hot Catálisis Biológica: Calorimetría de titulación isotérmica para caracterizar las reacciones enzimáticas

La fluorimetría diferencial de barrido es un método ampliamente utilizado para el cribado de bibliotecas de moléculas pequeñas en busca de interacciones con proteínas. Aquí, presentamos un método sencillo para ampliar estos análisis para proporcionar una estimación de la constante de disociación entre una molécula pequeña y su proteína asociada.

Determinación de las interacciones proteína-ligando Uso diferencial de barrido Fluorimetría

La termoforesis a microescala (MST) es una tecnología sensible para caracterizar las interacciones aptámero-objetivo. Este manuscrito describe un protocolo MST para caracterizar las interacciones aptámero-molécula pequeña.

Mapear el sitio de unión de un aptámero de ATP utilizando MicroScale termoforesis

Aquí presentamos un nuevo método para la determinación de las afinidades de Unión en equilibrio y en la solución con alta sensibilidad a gran escala. Esto mejora el análisis cuantitativo de enlace de la DNA factor de transcripción. El método se basa en las medidas de anisotropía de fluorescencia automatizada en un sistema de control.

Medición de alta sensibilidad de transcripción DNA Factor obligatorio afinidades por valoración competitiva utilizando microscopía de fluorescencia

La estabilidad térmica de la actividad enzimática se mide fácilmente por calorimetría isoterma de titulación (ITC). Ensayos de estabilidad de la proteína la mayoría actualmente utilizan medir proteína despliegue, pero no proporcionan información sobre la actividad enzimática. CCI permite la determinación directa del efecto de las modificaciones de la enzima sobre la estabilidad de la actividad enzimática.

Medir estabilidad enzimática por calorimetría isoterma de titulación

El protocolo presenta dos métodos para determinar la cinética de los aptámeros de ARN fluorogénico Spinach2 y Brócoli. El primer método describe cómo medir la cinética del aptámero fluorogénico in vitro con un lector de placas, mientras que el segundo método detalla la medición de la cinética del aptámero fluorogénico en las células mediante citometría de flujo.

Determinación de cinética de encendido in vitro y celular para aptámeros de ARN fluorogénicos

Aprende a determinar la afinidad de unión entre un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica. Este protocolo detalla la preparación de muestras, el análisis de datos termodinámicos y la interpretación de parámetros cinéticos sin necesidad de marcado.

Determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica (Video) | JoVE Journal

Determinación de la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina mediante calorimetría de titulación isotérmica

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