Análisis por citometría de flujo de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea murina y células de nicho estromal

El protocolo descrito permite el análisis fenotípico de células madre y progenitoras hematopoyéticas de médula ósea y células estromales de médula ósea. Se puede utilizar para estudiar las perturbaciones de estas poblaciones en diferentes entornos. En comparación con otros métodos descritos anteriormente, esta técnica permite el análisis fenotípico de las células hematopoyéticas, específicamente en las dos áreas funcionales de la médula ósea, endosteal y médula ósea central, así como las células del estroma de la médula ósea.

Para comenzar, coloque al animal sacrificado con la barriga hacia arriba en una placa de Petri y rocíe con etanol al 70%. Haga un corte por encima del abdomen con tijeras y retire la piel hasta los tobillos. Agarra una de las patas y córtala en su parte inferior para separarla del animal usando tijeras.

Luego retire el pie de la pierna cortando el tobillo y coloque la pierna en PBS 2% FBS helado. A continuación, agarre el hueso de la cadera con pinzas y córtelo detrás de él para separarlo del animal con tijeras. Coloque el hueso de la cadera en PBS 2% FBS helado.

Después de colocar el hueso de la pierna y la cadera en una placa de Petri, limpie los huesos con un bisturí estéril. Luego separe la tibia y el fémur cortando la rodilla con el bisturí y coloque los huesos limpios en PBS 2% FBS helado. Coloque el fémur o la tibia en un mortero con PBS 2% FBS helado y aplaste el hueso presionándolo suavemente contra la pared del mortero con el mortero.

A continuación, pipetear la suspensión celular resultante hacia arriba y hacia abajo usando una pipeta de 10 mililitros para homogeneizarla y transferirla a un tubo de 50 mililitros a través de un filtro celular de 40 micrómetros colocado en la parte superior del tubo. Enjuague el mortero con un poco más de PBS 2% FBS y transfiera la solución al mismo tubo de 50 mililitros a través del mismo filtro de celda de 40 micrómetros. Centrifugar el tubo de 50 mililitros a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de tampón de lisis RBC a temperatura ambiente pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Después de una incubación de dos minutos a temperatura ambiente, agregue 15 mililitros de PBS 2% FBS y centrifugue el tubo de 50 mililitros. Si el pellet celular no se ve rojizo, deseche el sobrenadante, resuspenda el pellet en 200 microlitros de PBS 2% FBS y transfiera la suspensión celular a un pocillo de una placa inferior en V de 96 pocillos para teñir.

Después de aplastar el hueso como se demostró anteriormente, corte la punta de una pipeta P1000 con tijeras y úsela para transferir todo el contenido del mortero a un tubo de 50 mililitros. Luego centrifugar el tubo de 50 mililitros a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet en tres mililitros de colagenasa IV y esta solución de dispasa-II.

Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante 40 minutos. Rellene el tubo a 25 mililitros con PBS 2% FBS y vórtice para mezclar. A continuación, transfiera el contenido a un nuevo tubo de 50 mililitros a través de un filtro celular de 100 micrómetros.

Luego agregue 15 mililitros de PBS 2% FBS al tubo antiguo de 50 mililitros y transfiera la solución al nuevo tubo de 50 mililitros a través del filtro celular de 100 micrómetros. Después de centrifugar y desechar el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en cinco mililitros de tampón de lisis RBC pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces con una pipeta. Después de la incubación de dos minutos a temperatura ambiente, agregue 15 mililitros de PBS 2% FBS.

Nuevamente, centrifugar el tubo y si el pellet celular no se ve rojizo después de desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 200 microlitros de PBS 2% FBS y transferir la suspensión celular a un pozo de una placa inferior en V de 96 pocillos para teñir. Luego centrifugar la placa a 500 G durante tres minutos a cuatro grados centígrados. Coloque el fémur en una placa de Petri y corte los extremos del hueso con un bisturí estéril.

Luego enjuague la parte central del hueso pasando 100 microlitros de PBS 2% FBS a través del interior del hueso una vez desde cada lado usando una jeringa de insulina de 0.5 mililitros sin volumen muerto y recolectando la solución en un tubo de microcentrífuga que contiene un mililitro de PBS 2% FBS. Posteriormente, transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 mililitros etiquetado como médula ósea enrojecida que contiene cuatro mililitros de PBS 2% FBS. Aplastar los extremos del hueso en un mortero con PBS 2% FBS helado presionándolos suavemente contra la pared del mortero con el mortero.

Una vez que la suspensión celular esté homogeneizada, transfiérala a un tubo de 50 mililitros etiquetado como médula ósea triturada a través de un filtro celular de 40 micrómetros. Por último, enjuague el mortero con un poco más de PBS 2% FBS y transfiera la solución al mismo tubo. El análisis de citometría de flujo de células madre hematopoyéticas y progenitores multipotentes se realizó en médula ósea total en un ratón C57BL6J adulto joven sano.

En el análisis de células estromales, células endoteliales y células madre mesenquimales en la médula ósea total, las células madre mesenquimales se pueden identificar fácilmente en función de la expresión del receptor de leptina y las células endoteliales se pueden identificar en función de la expresión de CD31 y SCA-1. Análisis por citometría de flujo de células endoteliales en médula ósea total que muestra la discriminación entre células endoteliales arteriolares y sinusoidales basada en ICAM1. La cuantificación de las células endoteliales de la médula ósea arterial y sinusoidal en el tejido de la médula ósea central y endosteal muestra que las células endoteliales de la médula ósea arterial son más abundantes en las regiones endosteal, mientras que los sinusoides son más frecuentes en las áreas centrales de la médula ósea.

Al obtener médula ósea enrojecida, no se debe exceder el volumen o número de veces indicado para pasar PBS 2% FBS a través del interior de la parte central del hueso. La combinación del método descrito con ensayos funcionales de las poblaciones celulares analizadas fenotípicamente proporcionaría información valiosa adicional sobre las posibles perturbaciones a estas poblaciones que ocurren en las condiciones estudiadas. El protocolo descrito permite el análisis fenotípico de células hematopoyéticas diferencialmente en endosteal y médula ósea central, lo que permite a los investigadores investigar las perturbaciones de la hematopía que potencialmente ocurren específicamente en estas ubicaciones de la médula ósea.