Aislamiento y caracterización de la microbiota natural del nematodo modelo Caenorhabditis elegans
August 17th, 2022
Caenorhabditis elegans es una de las principales especies modelo en biología, sin embargo, casi todas las investigaciones se realizan en ausencia de sus microbios naturalmente asociados. Los métodos descritos aquí ayudarán a mejorar nuestra comprensión de la diversidad de microbios asociados como base para futuras investigaciones funcionales de C. elegans.
Este protocolo permite nuevos conocimientos sobre la microbiota natural de C.elegans. Simultáneamente, los microbios aislados se pueden utilizar en experimentos de laboratorio controlados para caracterizar las interacciones microbiota-huésped y la biología de C. elegans. Este protocolo se centra en aislar microbios asociados con C.elegans en la naturaleza, que por lo tanto son clave para comprender la biología de este importante huésped modelo en un contexto más natural.
Será útil estar familiarizado con la apariencia de Caenorhabditis en comparación con otros nematodos. El pipeteo bajo el alcance de disección puede ser inicialmente un desafío, pero la práctica será útil. Comience recolectando las muestras ambientales como compost o frutas podridas en bolsas de plástico separadas, tubos o recipientes limpios.
Extienda uniformemente las piezas de las muestras ambientales recolectadas en una placa de Petri vacía estéril de nueve centímetros y agregue aproximadamente 20 mililitros de medio viscoso estéril para cubrir la muestra con el medio. Bajo el microscopio de disección, busque nematodos Caenorhabditis siguiendo las pautas para aislar Caenorhabditis elegans y nematodos relacionados. Usando una pipeta de 20 a 100 microlitros, recoja la menor cantidad posible de líquido que contenga los nematodos Caenorhabditis de la placa y transfiérala a la placa de Petri de tres centímetros que contiene de uno a tres mililitros de M9T estéril.
Para establecer una población de gusanos, los gusanos individuales pueden transferirse a una placa con un medio de crecimiento de nematodos o NGM. Para lavar los nematodos y eliminar los microbios presentes fuera de los nematodos, incubarlos en M9T durante 10 a 15 minutos. Pipetear la menor cantidad posible de líquido que contenga los nematodos y transferirlo a una nueva placa de Petri estéril de tres centímetros que contenga de uno a tres mililitros de M9T fresco.
Para la identificación imparcial de microbios asociados a nematodos, prepare una placa de 96 pocillos con aproximadamente tres perlas estériles de un milímetro de diámetro y agregue una mezcla de 19.5 microlitros de tampón de PCR y 0.5 microlitros de proteinasa K por pocillo. Transfiera un solo nematodo lavado a cada pocillo con el menor líquido posible. Rompa los nematodos transferidos usando un homogeneizador de perlas durante tres minutos a 30 hercios y centrifugue las placas o tubos a 8, 000 G durante 10 segundos a temperatura ambiente para que el líquido llegue al fondo.
Para identificar C. elegans, caliente las muestras en un ciclador de PCR durante una hora a 50 grados centígrados y 15 minutos a 95 grados centígrados para aislar el ADN de nematodos individuales, o use kits comerciales para aislar el ADN de las poblaciones de gusanos. Congele el ADN aislado a menos 20 grados centígrados para su almacenamiento a largo plazo. Utilice el ADN y el par de cebadores NLP 30 hacia adelante y NLP 30 hacia atrás y produzca un producto de PCR de 154 pares de bases.
Para aislar las bacterias, prepare una placa de 96 pocillos con aproximadamente tres perlas estériles de un milímetro, 20 microlitros de tampón M9 por pocillo y pipete un solo nematodo lavado a cada pocillo con el menor líquido posible. Rompa los nematodos como se demostró antes de usar un homogeneizador de perlas, seguido de una breve centrifugación de la placa para llevar el líquido al fondo. Una vez hecho esto, recoja la suspensión y diluyala en serie en una proporción de uno a 10.
Placa de hasta 100 microlitros de la suspensión diluida en placas de agar de nueve centímetros. Luego incubar las placas a 15 a 20 grados centígrados durante 24 a 48 horas. Para obtener el cultivo bacteriano puro, elija una sola colonia de la placa incubada usando un asa estéril o palillo de dientes y raye en una nueva placa de agar que contenga el mismo medio de agar utilizado durante la purificación.
Asegúrese de usar solo 1/3 de la placa. Luego esterilice un bucle reutilizable o use un nuevo bucle estéril y arrástrelo a través de la primera raya para crear una segunda raya en otra parte de 1/3 de la placa de muestra. Repítalo arrastrando un bucle a través de la segunda racha y creando la tercera racha para lograr el crecimiento de una sola colonia.
Incubar la placa en las mismas condiciones de crecimiento utilizadas para el aislamiento y, si es necesario, repetir el paso de purificación. Cultive las colonias puras en un medio líquido utilizando la misma temperatura y condiciones de crecimiento. A continuación, caracterice las bacterias extrayendo el ADN bacteriano de cultivos líquidos puros amplificando el ARN ribosómico 16S utilizando 27 cebadores directos y 1495 inversos y realizando la PCR como se describe en el texto.
Cuando las muestras de fruta y compost recolectadas se distribuyeron en placas de Petri y se sumergieron en un medio líquido o viscoso, los gusanos abandonaron el material del sustrato y nadaron hacia la superficie del medio. Los microbios se aislaron como colonias individuales puras y la purificación jugó un papel esencial ya que algunas bacterias asociadas a C.elegans pueden formar biopelículas o agregarse fácilmente, lo que resulta en cultivos de múltiples especies. La PCR utilizando los cebadores específicos de C.elegans, a saber, NLP 30 hacia adelante y NLP 30 hacia atrás, dio como resultado la amplificación de un producto de 154 pares de bases para C.elegans.
El ADN aislado de gusanos individuales dio como resultado bandas de PCR débiles, mientras que la extracción de ADN de las poblaciones de gusanos que consistían en al menos 50 gusanos produjo una cantidad mayor y bandas más claras. El éxito de la PCR específica de C. elegans se confirmó mediante la ejecución del ADN de una cepa de laboratorio, a saber, N2, como control positivo simultáneamente con el ADN de los nematodos aislados Los microbios están en todas partes. Por lo tanto, es esencial trabajar en condiciones estériles para garantizar que los microbios que están aislados estén realmente asociados con el gusano en la naturaleza.
Los microbios aislados se pueden usar para estudiar las interacciones huésped-microbiota o el papel de los microbios en la biología del huésped, por ejemplo, el envejecimiento, el desarrollo o la inmunidad en experimentos de laboratorio controlados. Los microbios aislados con esta técnica son utilizados actualmente por la comunidad de C.elegans para mejorar la comprensión de la diversidad de la microbiota en la aptitud del huésped o el papel de los microbios en la inmunidad.
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Visión general
Este estudio explora la microbiota natural asociada con Caenorhabditis elegans, un organismo modelo vital en la investigación biológica. Al aislar estos microbios en un entorno controlado, la investigación busca mejorar nuestra comprensión de las interacciones microbiota-huésped y sus implicaciones para la biología de C. elegans.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Interacciones microbiota-huésped
- Biología del organismo modelo
- Microbiología ambiental
Contexto
- Importancia de C. elegans como sistema modelo en biología
- Papel de los microbios asociados en la influencia de la biología del huésped
- Necesidad de comprender las asociaciones naturales en estudios de laboratorio
Métodos utilizados
- Aislamiento de microbios de muestras ambientales
- Uso de C. elegans como organismo modelo
- Amplificación por PCR para identificar microbios asociados a nematodos
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de microbios utilizando un protocolo definido
- Mejora en la comprensión de los roles que desempeñan los microbios en la biología de C. elegans
- Establecimiento de metodologías para futuros estudios de microbiota
Conclusiones
- Este estudio demuestra la importancia de estudiar la microbiota natural en C. elegans
- Los hallazgos son relevantes para avanzar en la investigación sobre las interacciones huésped-microbiota y sus efectos biológicos
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Isolation and characterization of the natural microbiota of Caenorhabditis elegans enables biopharma teams to interrogate host-microbe interactions in a genetically tractable model. This workflow supports predictive confidence in translational studies by providing defined microbial communities for mechanistic de-risking. The approach strengthens early discovery pipelines by enabling functional studies of microbiota impact on host biology, immunity, and development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional validation of host-microbiota interactions in a controlled genetic background.
- Supports mechanistic de-risking by isolating native microbial strains for hypothesis-driven studies.
- Facilitates pathway clarification for immunity, development, and aging in a model organism.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible microbiota samples for downstream phenotypic assays.
- Enables quantitative assessment of microbial effects on host phenotypes using defined communities.
- Supports assay development for screening microbial impact on host biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns model microbiota with disease-relevant host responses for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of microbiota-modulating interventions in preclinical models.
- Supports biomarker discovery by linking microbial composition to host phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from environmental sampling to preclinical model development, supporting both hypothesis testing and assay readiness.
- Discovery Biology: Facilitates isolation of native microbiota for mechanistic studies of host-microbe interactions.
- Screening: Provides reproducible, quantitative microbial inputs for phenotypic screening platforms.
- Analytics: Enables 16S rRNA-based community profiling and quantitative PCR outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges environmental microbiota diversity with laboratory model systems for preclinical relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for microbiota isolation and characterization across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in host-microbiota studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes microbiota isolation and characterization for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for microbiota-targeted interventions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbiota-modulating assets and supports cross-program comparability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode handling, microbiology, and molecular analysis.
- Needs access to sterile workspaces, bead homogenizers, PCR instrumentation, and sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility of microbial isolation and identification.
- Adaptation may be needed for different environmental sources or nematode species.
- Potential limitations include low DNA yield from single worms and challenges in isolating pure microbial cultures from biofilm-forming species.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:45
Preparation of Environmental Samples
1:10
Isolation of Caenorhabditis Nematodes
2:07
Preparation of the Worms for Molecular Identification of Caenorhabditis elegans and Microbes
3:18
Isolation and Cultivation of Nematode-Associated Bacteria
5:04
Results: Characterization of the Caenorhabditis elegans Microbiota
6:15
Conclusion
