Name: Hibridación fluorescente in situ y etiquetado de 5-etinil-2-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprende a visualizar células madre proliferantes en Cladonema pacificum mediante hibridación fluorescente in situ y etiquetado con EdU. Este protocolo permite distinguir células madre activas de las quiescentes.

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Este trabajo fue apoyado por AMED bajo el número de subvención JP22gm6110025 (a Y.N.) y por el número de subvención JSPS KAKENHI 22H02762 (a Y.N.).

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.
1. Síntesis de la sonda
<ol><li>Extracción de ARN<ol><li>Coloque tres Cladonema medusae vivas que se cultivan en agua de mar artificial (ASW) en un tubo de 1,5 ml utilizando una pipeta de transferencia de 3,1 ml con la punta cortada, y retire la mayor cantidad de ASW posible. NOTA: ASW se prepara disolviendo una mezcla de sales minerales en agua del grifo con neutralizador de cloro; la gravedad específica final (S.G.) es 1.018 o las partes por mil (ppt) es ~27.</li>
		<li>Congele los tubos de 1,5 ml en nitrógeno líquido para inhibir la actividad de la RNasa. Añadir 30 μL de tampón de lisis del kit de aislamiento de ARN total en el que se ha añadido 2-mercaptoetanol (1 μL/100 μL de tampón de lisis) y homogeneizar las muestras en el tampón de lisis utilizando un homogeneizador. NOTA: Para evitar el desbordamiento del tampón y la muestra de los tubos, se recomienda la homogeneización con una pequeña cantidad de tampón de lisis.</li>
		<li>Añadir 570 μL de tampón de lisis y extraer el ARN total siguiendo el protocolo del kit de aislamiento de ARN total (Figura 1).</li>
		<li>Mida la concentración del ARN extraído utilizando un espectrofotómetro y guárdelo a −80 °C hasta su uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntesis de ADNc<ol><li>Usando un kit, sintetice ADNc usando el ARN total extraído de las medusas como plantilla (Figura 1 y Tabla 1).</li>
		<li>Incubar a 65 °C durante 5 min.</li>
		<li>Enfriar rápidamente sobre hielo.</li>
		<li>Realizar la síntesis de ADNc con la mezcla del paso 1.2.1 (Tabla 1). Mezclar bien pipeteando e incubar a 42 °C durante 60 min.</li>
		<li>Incubar a 95 °C durante 5 min.</li>
		<li>Enfriar rápidamente sobre hielo.</li>
		<li>Mida la concentración del ADNc sintetizado utilizando un espectrofotómetro y almacene a -20 °C o menos hasta su uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Síntesis de productos de PCR<ol><li>Para crear una plantilla de PCR, diseñe el cebador específico utilizando Primer-BLAST. Obtener la secuencia de referencia a partir de datos NCBI o datos RNA-seq. NOTA: Consulte la Tabla de materiales para ver los cebadores utilizados en este protocolo.</li>
		<li>Para amplificar la secuencia objetivo, realice la clonación de TA, que no requiere el uso de enzimas de restricción. Para obtener un producto de PCR en el que se añade una adenina en el extremo 3', utilice los siguientes ajustes: 98 °C durante 2 min; 35 ciclos de 98 °C durante 10 s, 55-60 °C durante 30 s, 72 °C durante 1 min. Utilice Taq DNA polimerasa para las reacciones (Tabla 1). NOTA: Para determinar las condiciones de PCR, siga el protocolo que acompaña a la ADN polimerasa a utilizar, que generalmente proporciona una temperatura de recocido recomendada y un tiempo de extensión.</li>
		<li>Pase el producto de PCR a través de un gel de agarosa al 1% y corte la banda de interés. Extraiga los productos de PCR de los geles cortados utilizando un kit de extracción en gel.</li>
	</ol></li>
	<li>Ligadura<ol><li>Ligate el producto de PCR al vector con voladizos de timina 3' mezclando los reactivos (Tabla 1) e incubando a 37 °C durante 30 min (Figura 1). NOTA: La relación molecular del vector:PCR debe ser de 1:>3. El tamaño del vector pTA2 es de aproximadamente 3 kb. Si el producto de PCR (inserto) es A (kb) y B (ng/μL), el volumen del inserto (X en la Tabla 1) a tomar puede calcularse por ([50 ng de vector × A kb de inserto])/(3 kb vector × [ 1/3]) = 50· Un ng de inserto. Si la concentración del inserto es B ng/μL, entonces el volumen tomado es 50· A/B μL del inserto.</li>
	</ol></li>
	<li>Transformación y chapado<ol><li>Para la transformación, descongelar las células competentes en hielo y dispensarlas en alícuotas de 20 μL cada una. Añadir 1 μL de los plásmidos que contienen el producto de PCR (menos del 5% del volumen celular competente) y vórtice durante 1 s. Incubar en hielo durante 5 min, y luego incubar a 42 °C durante 45 s, y vórtice durante 1 s.</li>
		<li>Añadir 180 μL de caldo Super Optimal con medio de represión catabolítica (SOC) (un medio de cultivo bacteriano nutricionalmente rico) a las células competentes e incubar a 37 °C durante 30 min. Después de 30 min, esparcir las células competentes sobre una placa de agar que contenga ampicilina, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galacto-piranosido (X-gal) e isopropil-β-d-1-tiogalactopiranosida (IPTG), e incubar a 37 °C durante 12-16 h (Figura 1). NOTA: X-gal e IPTG se utilizan para seleccionar colonias azules y blancas.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultivo líquido<ol><li>Elija una colonia blanca de las colonias blancas y azules en el plato. Añádalo a 3-5 mL de medio LB con ampicilina e incubar en un agitador durante 12-16 h a 37 °C (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Minipreparación<ol><li>Extraiga el plásmido del medio LB usando una minipreparación de plásmido (Figura 1).</li>
		<li>Cuantificar la concentración de plásmidos utilizando un espectrofotómetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Lea la secuencia.<ol><li>Para leer la secuencia de ADN del plásmido, envíe el plásmido para la secuenciación de Sanger y luego use un software para alinearlo con la secuencia genoma/transcriptoma para confirmar si la secuencia objetivo se sintetiza correctamente y evaluar en qué dirección se inserta la secuencia objetivo en el plásmido (5' a 3' o 3' a 5'). NOTA: Si la secuencia diana se inserta en el plásmido en la dirección 5' a 3' desde el sitio de unión de la ARN polimerasa cerca del extremo 3', se puede generar una sonda antisentido mediante transcripción in vitro . Si la secuencia objetivo se inserta en la dirección inversa de 3' a 5', se puede generar una sonda de detección (control negativo). Si se utilizan vectores como pTA2, se pueden usar dos sitios de unión de transcripción dependiendo del propósito.</li>
	</ol></li>
	<li>Transcripción in vitro <ol><li>Prepare la plantilla de ADN del plásmido creado realizando PCR utilizando cebadores fuera del sitio de unión de la ARN polimerasa (por ejemplo, sitios de unión T7/T3) en el plásmido (Figura 1). NOTA: Los cebadores universales como el cebador directo M13-20 y el cebador inverso M13 se pueden usar para preparar una plantilla de ADN que incluya sitios de unión a la ARN polimerasa.</li>
		<li>Purificar la plantilla después de la amplificación por PCR utilizando un kit de extracción de gel/PCR.</li>
		<li>Mezclar los reactivos que se muestran a continuación y realizar la reacción de transcripción a 37 °C durante 3 h (Figura 1 y Tabla 1).</li>
		<li>Añadir 1,5 μL de DNasa e incubar a 37 °C durante 30 min.</li>
		<li>Añadir 10 μL de agua libre de RNasa y purificar la sonda de la solución de reacción de transcripción utilizando una columna de limpieza.</li>
		<li>Compruebe el tamaño del ARN sintetizado cargando 1 μL en un gel de agarosa al 1% y determine la concentración utilizando un espectrofotómetro. NOTA: Las sondas de ARN sintetizadas deben tener una concentración de al menos 100 ng/μL.</li>
		<li>Añadir 30 μL de formamida para su almacenamiento a −20 °C o menos.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Incorporación y fijación de EdU
<ol><li>Introducir Cladonema medusae (5-10 animales por tubo) en tubos de 1,5 ml utilizando una pipeta de transferencia de 3,5 ml y añadir ASW hasta un volumen total de 500 μL. Añadir 7,5 μL de solución madre de EdU de 10 mM e incubar las muestras durante 1 h a 22 °C (figura 2). La concentración final de EdU es de 150 μM. NOTA: Use medusas de 5 a 7 días de edad para monitorear la formación de la tercera rama (Figura 3A). El día en que las medusas se desprenden del pólipo se cuenta como el día 1, y el día 5, las medusas generalmente comienzan a exhibir una tercera rama en sus tentáculos principales.</li>
	<li>Después de 1 h, retire la mayor cantidad posible de ASW que contenga EdU.</li>
	<li>Para anestesiar las medusas, añadir MgCl2 al 7% enH2Oe incubar durante 5 min.</li>
	<li>Eliminar el MgCl 2 al 7% en H2Oy fijar las medusas durante la noche (O.N.) a 4 °C con paraformaldehído al 4% (PFA) en ASW (Figura 2). NOTA: Cuando se realiza FISH sin incorporación de EdU, las muestras se pueden fijar de manera similar a las tratadas con EdU después de la anestesia (pasos 2.3-2.4).</li>
</ol>3. Hibridación fluorescente in situ
<ol><li>Tratamiento con proteinasa y post fijación<ol><li>Retire el PFA y lave las muestras con PBS que contenga 0,1% de Tween-20 (PBST) durante 3 x 10 min. Use 300-500 μL de PBST por lavado. NOTA: Desde este paso hasta el final de la hibridación, el experimento debe realizarse en un entorno libre de RNasa, usando guantes y una máscara. El 1x PBS en este paso debe hacerse con agua tratada con DEPC. Después de la hibridación, se puede usar 1x PBS hecho con agua sin tratamiento DEPC. Algunos protocolos ISH y FISH deshidratan las muestras utilizando pasos de metanol, lo que permite guardar las muestras fijas a -20 °C hasta su uso. Para evitar trabajos superfluos, el proceso de deshidratación se omite de este protocolo, particularmente porque las muestras se pueden mantener en PBST hasta por unos pocos días.</li>
		<li>Después de la fijación, colocar la muestra en tubos de 1,5 ml en un agitador, excepto para la etapa de incubación del anticuerpo anti-DIG-POD O.N. (paso 3.4.2). Después del lavado, añadir 10 mg/ml de solución madre de proteinasa K en PBST e incubar las medusas con proteinasa K (concentración final: 10 μg/ml) a 37 °C durante 10 min.</li>
		<li>Retire la solución de proteinasa K y lave las muestras durante 2 x 1 min con PBST.</li>
		<li>Para postfijar las medusas, añadir 4% de PFA en 1x PBS e incubar a 37 °C durante 15 min.</li>
		<li>Retire la solución de PFA y lave las muestras durante 2 x 10 min con PBST. NOTA: Si el gen diana está altamente expresado con una señal de fondo baja, se pueden omitir los pasos 3.1.2-3.1.5.</li>
	</ol></li>
	<li>Hibridación<ol><li>Elimine el PBST y agregue el búfer de hibridación (búfer HB, tabla 1). Incubar las muestras en HB Buffer durante 15 min a temperatura ambiente (RT). Utilice 300-400 μL de HB Buffer, que proporciona suficiente volumen para una hibridación exitosa. NOTA: HB Buffer, Wash Buffer 1 y Wash Buffer 2 se preparan con 20x SSC stock. HB Buffer se almacena a −20 °C o menos y debe introducirse en RT antes de su uso.</li>
		<li>Elimine el búfer HB y agregue un nuevo búfer HB. Prehibridar a 55 °C durante al menos 2 h en una incubadora de hibridación.</li>
		<li>Extraiga el tampón HB e incube con el tampón HB que contenga las sondas almacenadas en el paso 1.9.7 (concentración final de la sonda: 0,5-1 ng/μL en el tampón HB). Hibridar a 55 °C durante 18-24 h (Figura 2) en una incubadora de hibridación. NOTA: La intensidad y especificidad de la señal FISH puede variar debido a la expresión génica objetivo, así como a la longitud y especificidad de la sonda. Para aumentar la intensidad, se pueden ajustar parámetros como la duración de la hibridación (18-72 h) y la temperatura (50-65 °C), y se pueden probar diferentes sondas. Para evitar señales inespecíficas, el tratamiento con proteinasa K (concentración y duración) puede ser modificado19.</li>
	</ol></li>
	<li>Extracción de la sonda<ol><li>Quite el búfer HB que contiene sondas y, a continuación, agregue el búfer de lavado 1 (tabla 1). Lavar las muestras con Wash Buffer 1 durante 2 x 15 min a 55 °C. Use 300-400 μL de tampón de lavado. NOTA: Las sondas que contienen HB Buffer se pueden utilizar repetidamente, hasta unas diez veces. En lugar de desechar, almacene el HB Buffer utilizado que contiene sondas a -20 °C o menos. Precaliente el tampón de lavado 1, el tampón de lavado 2, 2x SSC y PBST a 55 °C antes de usar.</li>
		<li>Quite el tampón de lavado 1 y, a continuación, agregue el tampón de lavado 2 (tabla 1). Lavar las muestras con Wash Buffer 2 durante 2 x 15 min a 55 °C.</li>
		<li>Quite el búfer de lavado 2 y, a continuación, agregue 2x SSC. Lavar las muestras con 2x SSC durante 2 x 15 min a 55 °C.</li>
		<li>Quite 2x SSC y, a continuación, agregue PBST precalentado. Lave las muestras durante 1 x 15 min con PBST en RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubación de anticuerpos anti-DIG<ol><li>Elimine PBST y, a continuación, agregue un búfer de bloqueo del 1%. Incubar las muestras durante al menos 1 h en RT mientras agita lentamente sobre un balancín. NOTA: Prepare el colchón de bloqueo al 1% diluyendo el stock regulador de bloqueo del 5% (Tabla 1). Revise las muestras antes de la siguiente reacción de anticuerpos porque la muestra tiende a adherirse a la parte posterior de la tapa o la pared como resultado de la sacudida.</li>
		<li>Después del bloqueo, retire el tampón de bloqueo al 1%, agregue la solución anti-DIG-POD (1:500, en tampón de bloqueo al 1%) e incube las muestras O.N. a 4 °C (Figura 2). NOTA: Tenga cuidado de mantener el tiempo de incubación dentro de 12-16 h para evitar la detección de señales no específicas.</li>
	</ol></li>
	<li>Detección de sonda marcada con DIG<ol><li>Retire la solución anti-DIG-POD y, a continuación, agregue el tampón Tris-NaCl-Tween (TNT, tabla 1). Lave las muestras con TNT durante 3 x 10 min en RT. NOTA: El uso de la técnica de amplificación de señal de tiramida (TSA) proporciona una imagen de mejor resolución contra los reactivos marcados con peroxidasa de rábano picante (por ejemplo, anti-DIG-POD).</li>
		<li>Solución madre diluida de tiramida conjugada con colorante fluorescente (Cy5-tiramida) (1:50) en el tampón diluyente de amplificación para producir la solución activa de tiramida Cy5 (Figura 2).</li>
		<li>Retire la mayor cantidad de TNT posible y, a continuación, agregue la solución activa de Cy5-tiramida. Incubar las muestras durante 10 minutos en la oscuridad.</li>
		<li>Lave las muestras con PBST durante 3 x 10 minutos en la oscuridad.</li>
	</ol></li>
	<li>Detección de EdU NOTA: El kit EdU detecta EdU incorporado como señales fluorescentes (Figura 2).<ol><li>Para preparar el cóctel de detección EdU, mezcle los componentes como se muestra en la Tabla 1. Utilice 100 μL de cóctel de detección de EdU para cada muestra. NOTA: Prepare 1x aditivo de tampón de reacción diluyendo 10x aditivo de tampón de reacción con agua ultrapura.</li>
		<li>Elimine PBST y, a continuación, agregue el cóctel de detección EdU. Incubar en la oscuridad durante 30 min.</li>
		<li>Lavar con PBST durante 3 x 10 min en la oscuridad.</li>
	</ol></li>
	<li>Tinción de ADN<ol><li>Diluir Hoechst 33342 (1:500) en PBST para preparar la solución de Hoechst. Quite el PBST y, a continuación, agregue la solución de Hoechst. Incubar las muestras durante 30 minutos en la oscuridad (Figura 2).</li>
		<li>Lave las muestras con PBST durante 3-4 x 10 minutos en la oscuridad.</li>
	</ol></li>
	<li>Montura<ol><li>Haga un banco en el portaobjetos de vidrio para evitar que la muestra se aplaste. Aplique cinta de vinilo a la corredera de vidrio y ahueca el centro.</li>
		<li>Transfiera las medusas al banco en el vidrio deslizante usando una pipeta de transferencia de 3,1 ml con la punta cortada. NOTA: Tenga cuidado de no dejar que los tentáculos se superpongan.</li>
		<li>Retire cualquier PBST con una pipeta P200 y luego agregue lentamente glicerol al 70% como medio de montaje (Figura 2). NOTA: En lugar de 70% de glicerol, se puede usar un medio de montaje antidecolorante para evitar que la fluorescencia se desvanezca.</li>
		<li>Coloque suavemente un cubreobjetos en las medusas con pinzas y selle el costado del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.</li>
		<li>Mantener los portaobjetos a 4 °C en la oscuridad si no se realiza inmediatamente la observación microscópica.</li>
	</ol></li>
	<li>Imagenológico<ol><li>Utilice un microscopio confocal de barrido láser para adquirir imágenes. Para una resolución de una sola celda, use una lente de aceite de 40x o una lente para un aumento mayor.</li>
		<li>Después de la adquisición de la imagen, abra las imágenes con el software ImageJ/FIJI y cuente las celdas que son positivas para EdU+ y/o Nanos1+ con la herramienta multipunto20.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Las células proliferantes y las células madre son fuentes celulares importantes en diversos procesos como la morfogénesis, el crecimiento y la regeneración21,22. Este artículo describe un método para teñir conjuntamente el marcador de células madre Nanos1 mediante el etiquetado de FISH y EdU en Cladonema medusae. Trabajos previos utilizando el etiquetado de EdU o BrdU han sugerido que las células proliferativas se localizan en los bulbos del ten...

Cnidaria es considerado un filo metazoario de ramificación basal que contiene animales con nervios y músculos, colocándolos en una posición única para comprender la evolución del desarrollo y la fisiología animal 1,2. Los cnidarios se clasifican en dos grupos principales: los antholozoos (por ejemplo, las anémonas de mar y los corales) poseen solo larvas de planula y etapas de pólipos sésiles, mientras que los medusozoos (miembros de hidrozoos, estaurozoos, esciphozoa y cubozoa) generalmente toman la forma de medusas o medusas que nadan libremente, así como larvas y pólipos de plánula. Los cnidarios comúnmente exhiben una alta capacidad regenerativa, y sus mecanismos celulares subyacentes, particularmente su posesión de células madre adultas y células proliferativas, han atraído mucha atención 3,4. Inicialmente identificadas en Hydra, las células madre hidrozoarias se encuentran en los espacios intersticiales entre las células epiteliales ectodérmicas y se conocen comúnmente como células intersticiales o células i3.
Las células i hidrozoarias comparten características comunes que incluyen multipotencia, la expresión de marcadores de células madre ampliamente conservados (por ejemplo, Nanos, Piwi, Vasa) y potencial de migración 3,5,6,7,8. Como células madre funcionales, las células i están ampliamente involucradas en el desarrollo, fisiología y respuestas ambientales de los animales hidrozoarios, lo que atestigua su alta capacidad regenerativa y plasticidad3. Si bien las células madre, similares a las células i, no se han identificado fuera de los hidrozoos, incluso en la especie modelo establecida Nematostella, las células proliferativas todavía están involucradas en el mantenimiento y la regeneración del tejido somático, así como en la línea germinal9. Como los estudios sobre el desarrollo y la regeneración del cnidario se han realizado predominantemente en animales de tipo pólipo como Hydra, Hydractinia y Nematostella, la dinámica celular y las funciones de las células madre en especies de medusas siguen sin abordarse en gran medida.
La medusa hidrozoaria Clytia hemisphaerica , una especie de medusa cosmopolita con diferentes hábitats en todo el mundo, incluyendo el Mar Mediterráneo y América del Norte, ha sido utilizada como animal modelo experimental en varios estudios de desarrollo y evolución10. Con su pequeño tamaño, fácil manejo y huevos grandes, Clytia es adecuado para el mantenimiento en laboratorio, así como para la introducción de herramientas genéticas como los métodos de transgénesis y knockout recientemente establecidos11, abriendo la oportunidad para un análisis detallado de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes a la biología de las medusas. En el tentáculo de Clytia medusa, las células I se localizan en la región proximal, llamada bulbo, y los progenitores como los nematoblastos migran a la punta distal mientras se diferencian en distintos tipos de células, incluidos los nematocitos12.
Durante la regeneración del Clytia manubrium, el órgano oral de las medusas, las células Nanos1+ i que están presentes en las gónadas migran a la región donde se pierde el manubrio en respuesta al daño y participan en la regeneración del manubrio7. Estos hallazgos apoyan la idea de que las células I en Clytia también se comportan como células madre funcionales que están involucradas en la morfogénesis y la regeneración. Sin embargo, dado que las propiedades de las células i difieren entre animales representativos de tipo pólipo como Hydra e Hydractinia3, es posible que las características y funciones de las células madre se diversifiquen entre las especies de medusas. Además, con la excepción de Clytia, las técnicas experimentales han sido limitadas para otras medusas, y la dinámica detallada de las células proliferativas y las células madre son desconocidas13.
La medusa hidrozoaria Cladonema pacificum es un organismo modelo emergente que se puede mantener en un entorno de laboratorio sin una bomba de agua o sistema de filtración. El Cladonema medusa tiene tentáculos ramificados, una característica común en la familia Cladonematidae, y un órgano fotorreceptor llamado ocelo en la capa ectodérmica cerca del bulbo14. El proceso de ramificación del tentáculo ocurre en un nuevo sitio de ramificación que aparece a lo largo del lado adaxial del tentáculo. Con el tiempo, los tentáculos continúan alargando y ramificándose, con las ramas más viejas empujadas hacia la punta15. Además, los tentáculos de Cladonema pueden regenerarse en unos pocos días después de la amputación. Estudios recientes han sugerido el papel de las células proliferantes y las células madre en la ramificación y regeneración de tentáculos en Cladonema16,17. Sin embargo, mientras que la hibridación in situ convencional (ISH) se ha utilizado para visualizar la expresión génica en Cladonema, debido a su baja resolución, actualmente es difícil observar la dinámica de las células madre a nivel celular en detalle.
Este artículo describe un método para visualizar células madre en Cladonema por FISH y co-tinción con EdU, un marcador de proliferación celular18. Visualizamos el patrón de expresión de Nanos1, un marcador de células madre 5,17, por FISH, que permite la identificación de la distribución de células madre a nivel de una sola célula. Además, la co-tinción de la expresión de Nanos1 con el etiquetado de EdU permite distinguir células similares a las células madre que proliferan activamente. Este método para monitorear tanto las células madre como las células proliferativas se puede aplicar a una amplia gama de áreas de investigación, incluida la ramificación de tentáculos, la homeostasis tisular y la regeneración de órganos en Cladonema, y se puede aplicar un enfoque similar a otras especies de medusas.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol&nbsp;</td><td>Wako</td><td>137-06862</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferencia de 3,1 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>233-20S</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galactopiranósido (X-Gal)</td><td>Wako</td><td>029-15043</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG-POD</td><td>Roche</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Nanos1 imprimación</td><td></td><td></td> directa <td>5'- AAGAGACACAGTCATTATCAAGC GA-3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Nanos1 imprimación</td><td></td><td></td> inversa <td>5'-CGACGTGTCCAATTTTACGTGTGT -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi adelante cebador</td><td></td><td></td><td>5'- AAAAGAGCAGCGGCCAGAAAGA AGGC -3'</td></tr><tr><td>Cladonema pacificum Piwi imprimación</td><td></td><td></td> inversa <td>5'- GCGGGTCGCATACTTGTTGGTA CTGGC -3'</td></tr><tr><td>Kit de proliferación celular Click-iT EdU para imágenes, Alexa Fluor 488 dye</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>C10337</td><td>Kit EdU</td></tr><tr><td>Coroline off</td><td>GEX Co. ltd</td><td>N/A</td><td>neutralizador de cloro</td></tr><tr><td>DIG Kit de detección de ácido nucleico Reactivo de bloqueo</td><td>Roche</td><td>11175041910</td><td>tampón de bloqueo&nbsp;</td></tr><tr><td>Mezcla de marcaje de ARN DIG&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;</td><td>Promega</td><td>P117B</td><td></td></tr><tr><td>ECOS célula competente DH5&alpha;</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-06233</td><td>célula competente</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel/PCR de gen rápido</td><td>Kit</td> de <td>extracción de gel</td><td>FG-91302</td></tr><tr><td>Mini kit de plásmido de gen rápido</td><td>FG-90502</td><td>miniprep de plásmido</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Wako&nbsp;</td><td>068-00426</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de heparina porcina</td><td>SIGMA-ALDRICH&nbsp;</td><td>H3393-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil-&beta;-D(-)-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Wako</td><td>096-05143</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td>placa de agar</td></tr><tr><td>LB Base de caldo LB</td><td>Invitrogen</td><td>12780-052</td><td>LB</td></tr><tr><td>medio Ácido maleico</td><td>Wako</td><td>134-00495</td><td></td></tr><tr><td>mini Columnas de ARN de espín rápido</td><td>Roche</td><td>11814427001</td><td>columna de limpieza</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako&nbsp;</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumen NanoDrop OneC con Wi-Fi</td><td>Espectrofotómetro</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td></tr><tr><td>Polioxietileno (20) Monolaurato de sorbitán (Tween-20)</td><td>Wako&nbsp;</td><td>166-21115</td><td></td></tr><tr><td>PowerMasher 2</td><td>nippi&nbsp;</td><td>891300</td><td>homogeneizador</td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Nacarai Tesque&nbsp;</td><td>29442-14</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de RNasa</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>74004</td><td>kit de aislamiento de ARN total</td></tr><tr><td>RQ1 RNasa libre de ARNasa</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de citrato de sodio salino 20x polvo (20x SSC)</td><td>TaKaRa</td><td>T9172</td><td></td></tr><tr><td>SEA LIFE</td><td>Marin Tech</td><td>N/A</td><td>mezcla de sales minerales</td></tr><tr><td>T3 ARN polimerasa&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11031163001</td><td></td></tr><tr><td>T7 ARN polimerasa&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10881767001</td><td></td></tr><tr><td>TAITEC HB-100</td><td>TAITEC</td><td>0040534-000</td><td>Incutador de hibridación</td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq&nbsp;</td><td>TaKaRa</td><td>RR001A</td><td>Taq ADN polimerasa</td></tr><tr><td>TaKaRa PrimeScript 2 1st hebra Kit de síntesis de ADNc</td><td>TaKaRa</td><td>6210A Kit de</td><td>síntesis de ADNc</td></tr><tr><td>Clon objetivo</td><td>TOYOBO&nbsp;</td><td>TAK101</td><td>pTA2 Vector</td></tr><tr><td>ARNt</td><td>Roche</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>TSA Plus cianina 5</td><td>AKOYA Biosciences</td><td>NEL745001KT</td><td>técnica de amplificación de señal de tiramida (TSA)</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Microscopio confocal de barrido láser</td></tr></tbody></table>

hibridación fluorescente in situ y etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria cladonema pacificum

Fluorescent In Situ Hybridization and 5-Ethynyl-2'-Deoxyuridine Labeling for Stem-Like Cells in the Hydrozoan Jellyfish Cladonema pacificum

Los cnidarios, incluidas las anémonas de mar, los corales y las medusas, exhiben una morfología y estilos de vida diversos que se manifiestan en pólipos sésiles y medusas que nadan libremente. Como se ejemplifica en modelos establecidos como Hydra y Nematostella, las células madre y / o células proliferativas contribuyen al desarrollo y regeneración de pólipos cnidarios. Sin embargo, los mecanismos celulares subyacentes en la mayoría de las medusas, particularmente en la etapa de medusa, son en gran medida poco claros y, por lo tanto, es fundamental desarrollar un método sólido para identificar tipos de células específicas. Este artículo describe un protocolo para visualizar células proliferantes similares a tallos en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum. Cladonema medusae posee tentáculos ramificados que crecen continuamente y mantienen la capacidad regenerativa a lo largo de su etapa adulta, proporcionando una plataforma única con la que estudiar los mecanismos celulares orquestados por la proliferación y / o células madre. La hibridación in situ fluorescente de montaje completo (FISH) utilizando un marcador de células madre permite la detección de células madre, mientras que el marcado de pulsos con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), un marcador de fase S, permite la identificación de células en proliferación. Combinando el etiquetado de FISH y EdU, podemos detectar células madre que proliferan activamente en animales fijos, y esta técnica se puede aplicar ampliamente a otros animales, incluidas las especies de medusas no modelo.

Los tentáculos de Cladonema se han utilizado como modelo para estudiar los procesos celulares de morfogénesis y regeneración15,16,17. La estructura del tentáculo está compuesta por un tubo epitelial donde las células madre, o células i, se encuentran en la región proximal, llamada bulbo del tentáculo, y se agregan nuevas ramas secuencialmente a la parte posterior de la región distal del bulbo a lo largo del lado adaxial...

Aquí, describimos un protocolo para visualizar células proliferantes similares a tallos en la medusa Cladonema. La hibridación in situ fluorescente de montaje completo con un marcador de células madre permite la detección de células madre, y el etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina permite la identificación de células en proliferación. Juntas, se pueden detectar células similares a la proliferación activa.

Hibridación fluorescente in situ y etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum

Cnidarians, including sea anemones, corals, and jellyfish, exhibit diverse morphology and lifestyles that are manifested in sessile polyps and ...

La tinción conjunta de la expresión de Nanos1 con el etiquetado de EdU permite distinguir células similares a las células madre que proliferan activamente. Podemos identificar la distribución de células madre a nivel de una sola célula en la medusa Cladonema. Podemos visualizar células madre y células proliferantes en la misma muestra de medusas, lo que permite la detección de células madre proliferantes y no proliferantes, lo que lleva a la comprensión de la heterogeneidad de las células madre.Estudios de biología del desarrollo y regeneración utilizando modelos animales que incluyen células madre. La medusa hidrozoaria Cladonema pacificum es un organismo modelo emergente que se puede mantener en un entorno de laboratorio sin ningún sistema especializado. Cladonema medusae tiene tentáculos ramificados.La ramificación ocurre en un nuevo sitio a lo largo del lado adaxial del tentáculo. Con el tiempo, los tentáculos continúan alargando y ramificándose, y las ramas más viejas son empujadas hacia la punta. Los tentáculos también pueden regenerarse a los pocos días de la amputación.El pequeño tamaño, el fácil manejo y la presencia de células madre adultas o células madre hacen de Cladonema un buen sistema para investigar el papel de las células madre en diferentes procesos. Para comenzar, coloque Cladonema medusae en tubos de 1,5 mililitros utilizando una pipeta de transferencia de 3,5 mililitros y agregue ASW hasta un volumen total de 500 microlitros. Añadir 7,5 microlitros de solución madre de EdU 10 milimolares e incubar las muestras durante una hora a 22 grados centígrados.Espere una hora y retire la mayor cantidad posible de ASW que contenga EdU. Después de anestesiar las medusas, incubar durante cinco minutos. Arregle las medusas durante la noche a cuatro grados centígrados con 4% de paraformaldehído en ASW.Para el tratamiento con proteinasa y post-fijación, retire el paraformaldehído y lave las muestras con PBS que contiene 0,1% Tween 20 tres veces durante 10 minutos cada una. Elimine el PBST y agregue el búfer de hibridación. Incubar las muestras en el tampón de hibridación durante 15 minutos a temperatura ambiente.Retire el búfer de hibridación y agregue el búfer de hibridación nuevo. Prehibridar a 55 grados centígrados durante al menos dos horas en una incubadora de hibridación. Retire el tampón de hibridación e incube con el tampón de hibridación que contiene las sondas.Hibridar a 55 grados centígrados durante 18 a 24 horas en una incubadora de hibridación. A continuación, proceda con la extracción de la sonda. Comience con la eliminación del tampón de hibridación que contiene sondas y luego agregue el tampón de lavado uno.Lave las muestras con tampón de lavado dos veces durante 15 minutos a 55 grados centígrados. Retire el tampón de lavado uno y agregue el tampón de lavado dos. Lave las muestras con tampón de lavado dos veces durante 15 minutos a 55 grados centígrados.Retire el tampón de lavado dos y luego agregue 2X SSC. Lave las muestras con 2X SSC dos veces durante 15 minutos a 55 grados centígrados. Elimine 2X SSC y luego agregue PBST precalentado.Lave las muestras durante 15 minutos con PBST a temperatura ambiente. Para la incubación de anticuerpos anti-DIG, comience por eliminar PBST y luego agregue un tampón de bloqueo del 1%. Incubar las muestras durante al menos una hora a temperatura ambiente mientras agita lentamente un balancín.Después del bloqueo, elimine el búfer de bloqueo del 1%. Agregue la solución anti-DIG-POD e incube las muestras durante la noche a cuatro grados centígrados. Para detectar la sonda marcada con DIG, retire la solución anti-DIG-POD y agregue tampón Tween de cloruro de sodio trisódico.Lave las muestras con tampón Tween de cloruro de sodio tris tres veces durante 10 minutos a temperatura ambiente. Diluir la solución madre de tiramida conjugada con colorante fluorescente en el tampón diluyente de amplificación para producir la solución activa de tiramida Cy5. Retire la mayor cantidad posible de tampón Tween de cloruro de sodio de tris y, a continuación, agregue la solución activa de tiramida Cy5.Incubar las muestras durante 10 minutos en la oscuridad. Lave las muestras con PBST tres veces durante 10 minutos en la oscuridad. Para preparar el cóctel de detección EdU, mezcle los componentes.Elimine PBST y luego agregue el cóctel de detección EdU. Incubar la muestra en la oscuridad durante 30 minutos. Lavar con PBST tres veces durante 10 minutos en la oscuridad.Para la tinción de ADN, diluir Hoechst en PBST para preparar la solución de Hoechst. Quite el PBST y, a continuación, agregue la solución Hoechst. Incubar las muestras durante 30 minutos en la oscuridad.Lave las muestras con PBST de tres a cuatro veces durante 10 minutos en la oscuridad. A continuación, para el montaje, transfiera las medusas al banco en el vidrio deslizante usando una pipeta de transferencia con la punta cortada. Coloque suavemente un cubreobjetos sobre las medusas con pinzas y selle el costado del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente.El etiquetado conjunto de la expresión de Nanos1 y las células positivas de EdU reveló el patrón espacial de células madre y células proliferativas en el tentáculo. Las células positivas para EdU se distribuyeron más ampliamente por todo el bulbo del tentáculo, mientras que las células positivas para Nanos1 se acumularon más localmente en el bulbo del tentáculo y el nuevo sitio de ramificación, lo que sugiere que se detectan distintas distribuciones de células madre y células proliferantes dependiendo del momento del desarrollo y las diferentes etapas. El etiquetado conjunto de EdU y Nanos1 se observó en el 19,79% de las células, lo que sugiere que estas células son una población de células madre que prolifera activamente.Curiosamente, se encontró que el 14,46% de las células eran Nanos1 negativas para EdU en el medio del bulbo y en el nuevo sitio de ramificación, lo que sugiere la presencia de células proliferativas no similares al tallo. En contraste, se observó que el 26,32% de las células eran Nanos1 positivas para EdU negativas en la base del bulbo y en el nuevo sitio de ramificación, lo que indica la presencia de una población de células madre que es de ciclo lento o inactiva, ninguna de las cuales se detecta mediante el etiquetado del pulso de EdU. El etiquetado de pulsos EdU con un tiempo de incubación corto permite la detección de solo células proliferativas entre células madre y células no similares a las células madre.Al cambiar el tiempo de incubación de EdU y combinar experimentos de persecución a largo plazo, se pueden marcar células madre de ciclo lento u otros tipos de células, incluidas la progenie y las células diferenciadas.

fluorescent-situ-hybridization-5-ethynyl-2-deoxyuridine-labeling-for

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Aprende a visualizar células madre proliferantes en Cladonema pacificum mediante hibridación fluorescente in situ y etiquetado con EdU. Este protocolo permite distinguir células madre activas de las quiescentes.

Hibridación fluorescente in situ y etiquetado de 5-etinil-2-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum (Video) | JoVE Journal

Hibridación fluorescente in situ y etiquetado de 5-etinil-2'-desoxiuridina para células madre en la medusa hidrozoaria Cladonema pacificum

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