Transfección eficiente del ARNm transcrito in vitro en células cultivadas utilizando nanopartículas de péptido-poloxamina

Las nanopartículas de péptido-poloxamina son uno de los posibles sistemas de administración de ARNm pulmonar. Nuestro protocolo fabrica las nanopartículas peptídico-poloxamina con mayor productividad y eficiencia, lo que facilita el desarrollo de la vacuna de ARNm de la mucosa. Los materiales requeridos por la técnica son de bajo costo y el protocolo se puede completar en poco tiempo.

Las nanopartículas péptido-poloxamina tienen la capacidad de mediar la transfección eficiente del ARNm. Las nanopartículas de péptido-poloxamina exhibieron una transfección exitosa de ARNm en células epiteliales bronquiales humanas, lo que implica aplicaciones adicionales para las vacunas COVID-19 de la mucosa, el tratamiento de cánceres de pulmón y la terapia génica con fibrosis quística. Espero que el individuo tenga algún conocimiento básico en un campo relacionado y con el protocolo y muchas de las técnicas también, antes de que él o ella comience a realizar los experimentos.

Después de sintetizar el marco de lectura abierto de la Metridia luciferasa y clonarlo en el vector pUC57, prepare una plantilla de ADN linealizada usando BamHI y KpnI a 37 grados centígrados durante una hora. Preparar una reacción de volumen de 20 microlitros para la síntesis de ARNm utilizando un kit de transcripción T7 y pseudouridina como se describe en el manuscrito. Mezclar bien los componentes e incubar a 37 grados centígrados durante tres horas.

Luego, retire la estructura secundaria de 50 microgramos de ARNm IVT sin tapa calentándolo a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Utilice el sistema de taponado Cap 1 para el tapado de ARNm IVT y prepare Cap 1 modificando la estructura del capuchón de 7-metilguanosina utilizando S-adenosilmetionina y 2'O-metiltransferasas a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Mida la concentración de ARNm de IVT tapado con un espectrofotómetro UV-visible.

Usando un marcador de ARN, analice el tamaño molecular del ARNm de IVT tapado en un gel de agarosa desnaturalizante de formaldehído al 1% que contiene 18% de formaldehído. Prepare 10 miligramos por mililitro de solución madre de poloxamina 704 solubilizando el T704 en agua libre de nucleasas. Prepare 2 miligramos por mililitro de solución madre del péptido solubilizando el péptido en agua libre de nucleasa.

Guarde la solución preparada a 4 grados centígrados. Descongele el ARNm IVT en hielo. Antes de abrir el tubo, centrifugar el tubo a 300 veces G durante tres segundos a temperatura ambiente y diluir la solución de ARNm IVT con agua libre de nucleasa.

Prepare T704 y la solución de mezcla de péptidos sintéticos diluyendo la solución de T704 a ocho microgramos por concentración de microlitro, y la solución de péptidos sintéticos a 0.555 microgramos por concentración de microlitro, con agua libre de nucleasa, respectivamente. Incubar la solución mezclada durante 15 minutos a temperatura ambiente antes de seguir usándola. Extraiga la solución de ARNm IVT en una jeringa de un mililitro, evitando espacios de aire o burbujas en la punta de la jeringa.

Cargue la jeringa en un lado del cartucho junto al bloque giratorio. Luego, llene una jeringa de un mililitro con T704 y solución de mezcla de péptidos sintéticos, y elimine cualquier burbuja o espacio de aire en la punta de la jeringa. Coloque la jeringa en la otra entrada de la bomba y ajuste la bomba con un caudal total de 4 a 10 mililitros por minuto.

Coloque un tubo cónico libre de RNasa de diez mililitros para recolectar la solución mixta de ARNm/PP-sNp IVT al final de la trayectoria de flujo del dispositivo de mezcla. Haga funcionar la bomba para iniciar la mezcla, asegurándose de que los parámetros se ingresen correctamente. Después de hacer funcionar la bomba durante seis segundos, recoja la muestra de ARNm/PP-sNp de la TRI del tubo cónico.

Placas de células epiteliales bronquiales humanas y una línea celular dendrítica en placas de 96 pocillos 24 horas antes de la transfección. Cultivar las células en un medio de cultivo suplementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% y estreptomicina al 1%. Después de retirar el medio de crecimiento, lave las células plateadas con 0,2 mililitros por PBS de pozo.

Agregue 170 microlitros de medio de cultivo sin suero a cada pocillo que contenga los cultivos celulares en placas. Luego, agregue 30 microlitros de formulación IVT mRNA / PP-sNp que contenga 0.4 microgramos de ARNm de Metridia luciferase en cada pocillo. Incubar las células con la formulación IVT mRNA/PP-sNp en una atmósfera humidificada enriquecida con dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante cuatro horas.

Aspirar el medio de transfección y añadir 0,2 mililitros de medio de cultivo fresco suplementado con suero fetal bovino inactivado térmicamente al 10% y estreptomicina al 1%. Incubar las células transfectadas durante 24 horas como se demostró anteriormente y recoger los sobrenadantes que se detectarán en cada pocillo. Prepare una solución de ensayo fresca agregando PBS al sustrato de celenterazina.

Mezcle bien la solución haciendo vórtice durante 10 segundos. Agregue 50 microlitros del sobrenadante recolectado a una placa de 96 pocillos. Configure el lector de microplacas con un tiempo de lectura de 1.000 milisegundos y agregue 30 microlitros de solución de celenterazina a cada pocillo manualmente o mediante inyección automatizada.

Inmediatamente después de agregar la solución de celenterazina al sobrenadante, haga clic en Inicio para medir la señal de luminiscencia. El plásmido recombinante fue aislado y digerido para producir la plantilla de ADN lineal. La transcripción in vitro produjo ARNm de MetLuc tapado y tapado.

Las células transfectadas con ARNm de Metridia luciferase / PP-sNp mostraron una expresión significativamente mayor de luciferasa en comparación con aquellas transfectadas con reactivo de transfección a base de lípidos disponible comercialmente, ARNm de Metridia luciferasa desnudo, PBS o péptidos sintéticos T7044, solución mixta en células epiteliales bronquiales humanas, 16 HBE y línea celular dendrítica DC2.4 Metridia luciferase mRNA / PP-sNp mostraron una mayor expresión de luciferasa que LP.lo que sugiere que el sistema de administración de PP-sNp es importante para protegiendo el ARNm de MetLuc contra la degradación y promoviendo la eficiencia de transfección del ARNm exógeno de la Metridia luciferasa. Asegúrese de que la estructura sintética del ARNm Met sin tapa se elimine con éxito. Calcule y descargue cuidadosamente el Met-mRNA T704 y el compuesto peptídico para preparar y compactar las nanopartículas de poloxamina.

Se puede realizar microscopía electrónica de transmisión para observar la morfología de las nanopartículas de péptido-poloxamina. Esta técnica ayuda a los investigadores a desarrollar vacunas de ARNm de la mucosa y permitir la detección de alto rendimiento de formulaciones de terapia génica para todas las células relacionadas.