Construcción de péptidos cíclicos usando un centro de sulfonio en la correa

En este protocolo, se construyó la sal de sulfonio que podía actuar como una nueva mano que reaccionaba con la proteína cisteína en la proximidad especial. La ventaja de esta técnica era que esta reacción era rápida y eficiente, y libre de catalizador Met y desarrolló un método simple y eficiente para estabilizar péptidos. Para comenzar, prepare la solución de desprotección N-terminal de 9-fluorinil-metiloxicarbonilo de piperidina al 20% o morfolina al 50% y DMF en un vaso o matraz de 500 mililitros.

Luego, agregue 10 mililitros de la solución de desprotección a la columna y burbujee nitrógeno en la solución durante 30 minutos o dos veces durante cinco minutos. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente cinco veces con diclorometano y N, N-dimetilformamida. Para detectar la resina como una solución de color amarillo oscuro, agregue un mililitro de N, N-dimetilformamida a una pequeña cantidad de resina y agregue 200 microlitros de ninhidrina al 5% a un tubo de vidrio.

Caliéntalo a 130 grados centígrados durante tres minutos para evaluar los cambios en el color de la resina. Para el acoplamiento de péptidos, prepare una solución de mezcla como se describe en el manuscrito en un tubo de polipropileno y disuélvala en tres mililitros de N, N-dimetilformamida. Luego, agregue 173 microlitros de N, N-diisopropiletilamina o 154 microlitros de N, N'diisopropilcarbodiimida a la solución para inactivar el aminoácido.

A continuación, agregue la mezcla a la columna con resina y burbujee con nitrógeno durante dos horas. Después del acoplamiento, agregue un mililitro de N, N-dimetilformamida a una pequeña cantidad de resina y agregue 200 microlitros de ninhidrina al 5% a un tubo de vidrio. Calentarlo a 130 grados centígrados durante tres minutos mientras la resina cambia a incolora, lo que confirma la ausencia de un grupo amino libre antes del paso de desprotección.

Después de drenar la solución, lave la resina como se demostró anteriormente y agregue 10 mililitros de la solución de desprotección a la columna. Luego, burbujee con nitrógeno durante 30 minutos o dos veces durante cinco minutos. Y de nuevo, agregue una solución nueva.

Agregue 10 mililitros de metanol anhidro a la columna con resina para deshidratar y seque con nitrógeno para el próximo uso. Pesar 100 miligramos de la resina en una columna y lavar la resina con diclorometano y N, N-dimetilformamida antes de la etapa de acoplamiento. Preparar una solución para eliminar el grupo de protección de tritil-L-cisteína añadiendo ácido trifluoroacético, triisopropilsilano y mezcla de diclorometano en un vaso o matraz de 100 mililitros para eliminar el grupo protector.

Agregue de cinco a 10 mililitros de la solución preparada a la columna para eliminar el grupo de protección durante 10 minutos. Repita seis veces con nitrógeno burbujeante hasta que el color amarillo desaparezca por completo. Después de drenar la solución con una bomba de vacío, lave la resina como se demostró anteriormente.

A continuación, preparar una solución para reaccionar con cisteína desprotegida añadiendo enlazador dihalogenado y N, N-diisopropiletilamina en un vaso de precipitados de 50 mililitros o matraz con N, N-dimetilformamida. Agregue de cinco a 10 mililitros de la solución de reacción a la columna para reaccionar con cisteína protegida durante al menos tres horas con burbujeo de nitrógeno. Nuevamente, drene la solución con una bomba de vacío y lave la resina secuencialmente como se demostró anteriormente.

Para preparar la solución de ciclación peptídica, agregue la mezcla de ácido trifluoroacético en un vaso de precipitados o matraz de 20 mililitros en la campana extractora para la ciclación peptídica. Luego, agregue de cinco a 10 mililitros de la solución de mezcla al tubo de polipropileno y divida la resina bajo el cóctel de ácido trifluoroacético durante tres horas. Después de deshidratar y lavar la resina antes de que se demuestre previamente el paso de acoplamiento, prepare una solución acuosa de ácido fórmico al 1% y un bromuro de propargil milimolar y agréguelo a la solución de péptido de metionina.

A continuación, agite la reacción de acoplamiento de metionina y bromuro de propargil a temperatura ambiente durante 12 horas. Después de la reacción, disuelva el producto en un tubo de polipropileno y acetonitrilo y fílelo a través de una membrana filtrante de 0,22 micrómetros. Luego, purifique la solución por HPLC de fase inversa inmediatamente y séquela por congelación en polvo para el próximo uso.

Los péptidos cíclicos sintetizados utilizando bis-alquilación entre cisteína y metionina se caracterizaron por el espectro de HPLC y LCMS, lo que muestra que los epímeros exhibieron distintos tiempos de retención e idénticos pesos moleculares. Las trazas de HPLC de los epímeros y su producto conjugado demostraron la conversión dependiente del tiempo entre el péptido cíclico y su producto. El peso molecular de los péptidos cíclicos sintetizados mediante una reacción de tipo tiol-yne se determinó mediante LCMS y el péptido se aisló y purificó mediante HPLC.

Los péptidos se caracterizaron además por RMN de protones y espectros heteronucleares simples de coherencia cuántica, revelando el cambio químico. Se obtuvieron espectros de RMN de protones de la conversión dependiente del tiempo entre péptido cíclico y ditiothreitol y óxido de deuterio para explorar la estabilidad del péptido debido a la apertura del anillo de sulfonio. Los resultados mostraron que no se formaron productos de adición o apertura de anillo después de 24 horas.

Este procedimiento estableció una estrategia efectiva para sintetizar péptidos cíclicos. La reacción dice que la selectividad también mejoró al formar una confirmación que estabiliza el péptido de ciclización, lo que indica que los péptidos cíclicos eran prometedores catalizadores de fármacos.