Name: Construcción de péptidos cíclicos usando un centro de sulfonio en la correa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Aprenda a sintetizar péptidos cíclicos mediante bisalquilación entre cisteína y metionina usando un centro de sulfonio propargílico. Este método eficiente estabiliza péptidos sin necesidad de catalizador de metales.

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Reconocemos el apoyo financiero del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China (2021YFC2103900); las subvenciones de la Fundación de Ciencias Naturales de China (21778009 y 21977010); la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Guangdong (2022A1515010996 y 2020A1515010521): el Comité de Innovación Científica y Tecnológica de Shenzhen, (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 y JCYJ20200109140406047); y la subvención Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions (2019SHIBS0004). Los autores agradecen el apoyo de la revista Chemical Science, The Royal Society of Chemistry para la referencia 30 y The Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, para la referencia 31.

1. Preparación del equipo
PRECAUCIÓN: Morfolina, N,N-dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), TFA, morfolina, piperidina, éter dietílico y metanol son tóxicos, volátiles y corrosivos. Estos reactivos pueden dañar el cuerpo humano a través de la inhalación, ingestión o contacto con la piel. Para todos los experimentos químicos, use equipo de protección, incluidos guantes desechables, abrigos experimentales y anteojos protectores.
<ol><li>Construir todos los sustratos peptídicos en resina Rink-amida 4-metilbenzhidrilamina (MBHA) mediante la síntesis manual estándar de péptidos en fase sólida (SPPS)29, como se muestra en la Figura 1.</li>
	<li>Utilice cualquiera de las dos opciones para construir péptidos lineales: uno, sintetizar el péptido utilizando agente condensador 2-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N, N',N'-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HATU) y un reactivo de DIPEA; o dos, sintetizar utilizando 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) y N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC) como reactivo de condensación de amida. Seleccione un protocolo apropiado para la síntesis de péptidos de acuerdo con la secuencia del péptido.</li>
	<li>Para establecer un dispositivo manual de síntesis de péptidos, configure un equipo de extracción de fase sólida al vacío modificado en una campana extractora de humos y conéctelo con una llave de paso de tres vías. A continuación, coloque un cartucho de filtro de polipropileno o un reactor de vidrio en el equipo mientras está conectado al gas nitrógeno (N2). NOTA: Para modificar el equipo de extracción en fase sólida al vacío, retire el tubo de extracción y mantenga el sistema sellado al vacío.</li>
	<li>Cargue la resina MBHA en las columnas llenas de resina y disuélvala en DMF. Ajuste el interruptor de las llaves de paso de tres vías para el burbujeo de N2 y luego retire el disolvente en la columna utilizando una bomba de trabajo conectada a un sistema de vacío. Calcule la cantidad de aminoácido o agente condensador requerido utilizando la siguiente fórmula: Aminoácido (g) y agente condensador (g) = escala de resina (g) × capacidad de carga de resina (mM/g) × equivalente (5 eq) × peso molecular (g/M) NOTA: Elija la cantidad de resina cargada de acuerdo con la longitud del péptido de acoplamiento. Se utilizan múltiples equivalentes (eq) de aminoácidos para reaccionar más plenamente. Los disolventes líquidos deben convertirse en volumen por densidad. El 5 eq muestra que la cantidad de entrada del compuesto calculado se amplifica por un factor de cinco.</li>
</ol>2. Preparación de la resina
NOTA: Elija la cantidad de resina cargada de acuerdo con la longitud del péptido de acoplamiento.
<ol><li>Pesar 302 mg de resina Rink-amide MBHA (0,331 mM/g cargada) en una columna (depósito de 20 ml). Agregue 5-10 ml de DCM o DMF en la columna para hinchar la resina bajo N2 burbujeando durante 30 min.</li>
	<li>A continuación, cierre el interruptor N2 y luego encienda el interruptor de succión de la bomba de vacío para eliminar el solvente. Luego, lave las resinas secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.</li>
</ol>3. Desprotección Fmoc N-terminal
NOTA: La desprotección por morfolina requiere 30 min, y la desprotección por piperidina toma 5 min.
<ol><li>Prepare la solución de desprotección N-terminal de 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc): prepare un volumen suficiente (500 ml) de piperidina al 20% (v/v) o morfolina al 50% (v/v) en DMF en un recipiente de vidrio para la desprotección del grupo Fmoc.</li>
	<li>Añadir 10 ml de la solución de desprotección a la columna, burbujear N2 en la solución durante 30 min o 5 min 2x, y repetir los procedimientos de desprotección 2x.</li>
	<li>Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.</li>
	<li>Detectar la resina como una solución de color amarillo oscuro con ninhidrina al 5% (prueba de Kaiser) después de cada desprotección para confirmar la ausencia del grupo Fmoc antes del paso de acoplamiento. En detalle, agregue 1 ml de DMF a una pequeña cantidad de resina y agregue 200 μL de ninhidrina al 5% a un tubo de vidrio calentado a 130 ° C durante 3 minutos para evaluar los cambios en el color de la resina.</li>
	<li>Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.</li>
</ol>4. Acoplamiento del péptido lineal (Figura 2)
NOTA: Cuando las secuencias de péptidos sintéticos contienen dos o más unidades repetitivas, el procedimiento de acoplamiento se puede llevar a cabo directamente seleccionando el tipo de aminoácido, como Fmoc-AA-OH o Fmoc-AAA-OH, y así sucesivamente. Se requieren algunos aminoácidos especiales con impedimento estérico y péptidos con secuencias de aminoácidos más largas para extender adecuadamente el tiempo de reacción para el acoplamiento.
<ol><li>Para un solo paso de acoplamiento, tome como ejemplo el acoplamiento del residuo de Cys (sintetice escamas de resina de 300 mg). Preparar una solución de mezcla que incluya Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) y HATU (5 eq, 206 mg) o Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 eq, 292 mg) y HOBT (5 eq, 106 mg) en un tubo de polipropileno y disolverla en 3 mL de DMF.</li>
	<li>Añadir 173 μL de DIPEA (10 eq) o 154 μL de DIC (10 eq) a la solución de Cys para activar el aminoácido. Deje que la mezcla se active previamente durante 1 minuto. Añadir la mezcla a la columna con resina, y burbujear conN2 durante 2 h. NOTA: El tiempo de reacción específico requerido debe estandarizarse para detectar ninhidrina al 5%.</li>
	<li>Después del acoplamiento, agregue 1 ml de DMF a una pequeña cantidad de resina y agregue 200 μL de ninhidrina al 5% a un tubo de vidrio calentado a 130 ° C durante 3 minutos. Observe el cambio de resina a incolora para confirmar la ausencia de un grupo amino libre antes del paso de desprotección.</li>
	<li>Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.</li>
	<li>Agregue 10 ml de la solución de desprotección a la columna, burbujee con N2 durante 30 min o 5 min 2x, agregue solución nueva y repita los procedimientos de desprotección 2x.</li>
	<li>Repita los siguientes pasos: desprotección del grupo Fmoc; detección de desprotección de resina; lavado de la resina; acoplamiento del aminoácido; Detección de la reacción de acoplamiento. Repita el paso de acoplamiento hasta que se sinteticen todos los péptidos. NOTA: Use la prueba de Kaiser para controlar si cada paso de la desprotección está completo o si cada paso del acoplamiento de aminoácidos es completo. Alternativamente, una pequeña cantidad de péptido puede ser escindido de la resina y comprobado por LC-MS para un acoplamiento exitoso.</li>
</ol>5. Bisalquilación entre Met y Cys (Figura 3)
<ol><li>Construya un péptido lineal con Met y Cys repitiendo los pasos 4.1-4.6. Añadir 10 ml de metanol anhidro a la columna con resina para deshidratación y secar conN2 para el siguiente uso (repetir 2x) después del acoplamiento peptídico lineal.</li>
	<li>Pesar 100 mg de la resina obtenida en el paso anterior en una columna (depósito de 20 mL) y lavar la resina con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) antes de la etapa de acoplamiento.</li>
	<li>Prepare una solución para eliminar el grupo de protección Cys trt(trityl). Preparar un volumen suficiente (100 ml) de mezcla TFA/TIS/DCM (3:5:92) en un recipiente de vidrio para eliminar el grupo protectiove.</li>
	<li>Añadir 5-10 ml de la solución de TFA/TIS/DCM (3:5:92) a la columna para retirar el grupo de protección durante 10 min. Repita seis veces con N2 burbujeando hasta que el color amarillo desaparezca por completo.</li>
	<li>Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.</li>
	<li>Prepare una solución para reaccionar con Cys desprotegido. Preparar un volumen suficiente (50 ml) de solución de mezcla (DMF) incluyendo enlazador dihalogenado (2 eq) y DIPEA (4 eq) para reaccionar con Cys desprotegido.</li>
	<li>Añadir 5-10 ml de la solución de reacción a la columna para reaccionar con Cys desprotegido durante al menos 3 h con burbujeo deN2 . Deshidratar con metanol anhidro y secar conN2 para el siguiente uso.</li>
	<li>Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) 5x.</li>
	<li>Prepare una solución para la ciclación peptídica: prepare un volumen suficiente (20 ml) de mezcla de TTAP (TTA: TIS:H 2O = 95: 2.5: 2.5) en un recipiente de vidrio en la campana extractora para la ciclación de péptidos.</li>
	<li>Añadir 5-10 ml de la solución de mezcla de TFA al tubo de polipropileno y escindir la resina bajo el cóctel de TFA durante 3 h. PRECAUCIÓN: El TFA es altamente corrosivo e irritante; El proceso de escisión peptídica debe realizarse en una campana extractora.</li>
	<li>Realice los pasos 7.1-7.5 para obtener una solución peptídica lineal mediante purificación en fase líquida en fase inversa (HPLC). Liofilizar la solución para el próximo uso.</li>
</ol>6. Ciclación de la sal de propargil sulfonio (Figura 4)
<ol><li>Construya un péptido lineal con Met y Cys repitiendo los pasos 4.1-4.6. Añadir 10 ml de metanol anhidro a la columna con la resina para deshidratar y secar conN2 para el siguiente uso (repetir dos veces) después del acoplamiento peptídico lineal.</li>
	<li>Pesar 100 mg de la resina obtenida en el paso anterior en una columna (depósito de 20 mL) y lavar la resina con DCM (5-10 mL) y DMF (5-10 mL) antes de la etapa de acoplamiento.</li>
	<li>Realice los pasos 7.1-7.5 para obtener una solución peptídica lineal por HPLC y liofilique la muestra, como se mencionó, para su próximo uso.</li>
	<li>Preparar una solución acuosa de HCOOH al 1% (en volumen) y bromuro de propargil al 1,0 mM (5 eq) y añadir a la solución peptídica Met (0,2 mM, 1 eq; 0,2 ml de MeCN/H2O[1:1, v/v]).</li>
	<li>A continuación, agitar la reacción de acoplamiento de Met y bromuro de propargil a temperatura ambiente durante 12 h.</li>
	<li>Después de la reacción, disolver el producto en un tubo de polipropileno en acetonitrilo y filtrarlo a través de una membrana de filtro de 0,22 μm. Luego, purifique la solución por HPLC de fase inversa inmediatamente y liofilifíquela en polvo para el próximo uso.</li>
	<li>En el último paso, añadir el péptido con bromuro de propargil a un tubo de polipropileno, mantener el pH de la solución de reacción a 8,0 añadiendo (NH4)2solución de CO3 y agitar la mezcla de reacción a 37 °C durante 12 h. Este paso obtiene el péptido cíclico de la sal de propargil sulfonio.</li>
	<li>Recoger la última mezcla de reacción: disolverla en un tubo de polipropileno en acetonitrilo y filtrarla a través de una membrana filtrante de 0,22 μm. Luego, purifique la solución por HPLC de fase inversa inmediatamente y liofilifíquela en polvo para el próximo uso.</li>
</ol>7. Purificación de péptidos cíclicos
<ol><li>Construya sustratos peptídicos lineales en resina Rink-amide MBHA repitiendo los pasos 4.1-4.6. Añadir 10 ml de metanol anhidro a la columna con resina para deshidratación y secar conN2 para el siguiente uso (repetir dos veces) después del acoplamiento peptídico lineal.</li>
	<li>Prepare un volumen suficiente de cóctel de escote (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2.5:2.5) en la campana extractora. Añadir 1-5 ml de solución de mezcla de TFA al tubo de polipropileno y escindir la resina bajo el cóctel de TFA durante 3 h.</li>
	<li>A continuación, seque secuencialmente la resina bajo un vapor deN2 en la columna. Alternativamente, use un dispositivo de filtro para filtrar la resina y recolectar la solución peptídica. Luego, agregue 20 ml de éter a la solución peptídica para precipitar el péptido, centrifugar a 3,500 x g durante 5 minutos y repetir dos veces. Recoja el precipitado de péptido crudo y séquelo bajo una corriente de N2 para el siguiente paso.</li>
	<li>Disuelva 200 mg de péptido crudo en un tubo de polipropileno en 4 ml de solución de acetonitrilo-agua y fíjelo a través de un filtro de 0,22 μm. Transfiera el péptido a un inserto de vial de HPLC. Coloque el inserto en el muestreador automático de un sistema HPLC semipreparativo de fase inversa equipado con una columna C18 de 5 μm, 4,6 mm x 250 mm y un bucle de inyección de 1 ml.</li>
	<li>Purificar y aislar el péptido utilizando un programa de gradiente de 5% -95% de acetonitrilo en agua con 0,1% de TFA durante 30 minutos mientras monitorea los espectros de HPLC usando UV a 254 nm. Confirme el peso molecular del péptido mediante LC-MS, recoja la solución del péptido y liofilifíquela en polvo para el próximo uso.</li>
</ol>

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<li>Hu, K., Sun, C., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+versatile+on-tether+modification+of+chiral-center-induced+helical+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).</li>
<li>Kramer, J. R., Deming, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+chemoselective+tagging+and+functionalization+of+methionine+containing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides.</a> Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).</li>
<li>Shi, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+stapling+of+unprotected+peptides+via+chemoselective+methionine+bisalkylation%2Fdealkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation.</a> Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).</li>
<li>Merrifield, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+synthesis.+Nobel+lecture%2C+8+December+1984%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984.</a> Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).</li>
<li>Wang, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sulfonium+tethered+peptide+ligand+rapidly+and+selectively+modifies+protein+cysteine+in+vicinity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity.</a> Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).</li>
<li>Hou, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sulfonium+triggered+thiol-yne+reaction+for+cysteine+modification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification.</a> The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).</li>
<li>Reguera, L., Rivera, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicomponent+reaction+toolbox+for+peptide+macrocyclization+and+stapling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling.</a> Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El enfoque sintético descrito en este documento proporciona un método para sintetizar péptidos cíclicos utilizando Cys y Met en la secuencia peptídica, en la que los péptidos lineales básicos se construyen mediante técnicas comunes de síntesis de péptidos en fase sólida. Para la bisalquilación de péptidos cíclicos entre Cys y Met, toda la ruta sintética se puede dividir en tres procesos principales: la desprotección de Cys en la resina, el acoplamiento del enlazador y la ciclación entre Cys y Met en una solución de escis...

Las interacciones proteína-proteína (IBP)1 desempeñan un papel fundamental en la investigación y el desarrollo de fármacos. La construcción de péptidos estabilizados con una conformación fija por medios químicos es uno de los métodos más importantes para desarrollar motivos miméticos de IBP2. Hasta la fecha, varios péptidos cíclicos que se dirigen a los IBP han sido desarrollados para uso clínico3. La mayoría de los péptidos están restringidos a una conformación de α hélice para disminuir la entropía conformacional y mejorar la estabilidad metabólica, la afinidad de unión al objetivo y la permeabilidad celular 4,5. En las últimas 2 décadas, las cadenas laterales de Cys6,7, lisina 8,9, triptófano 10, arginina 11 y Met 12,13 se han insertado en aminoácidos no naturales para fijar el péptido en una conformación cíclica. Tales péptidos cíclicos pueden dirigirse a un espacio químico único o sitios especiales, desencadenando así una reacción covalente para formar la unión covalente proteína-péptido14,15,16,17. En un informe reciente de Yu et al., una cloroacetamida se ancló en el dominio de los ligandos peptídicos, asegurando una reacción de conjugación covalente con excelente especificidad proteica18. Además, Walensky et al.19 incorporaron ojivas electrofílicas, como la acrilamida y el fluoruro de arilo sulfonilo (ArSO2F), a péptidos para formar inhibidores covalentes peptídicos estabilizados y mejorar el efecto antitumoral de los inhibidores peptídicos. Por lo tanto, es muy importante introducir un grupo funcional adicional para modificar covalentemente los ligandos proteína-péptido20. Estos grupos no solo reaccionan con proteínas en la cadena lateral, sino que también estabilizan la estructura secundaria del péptido21. Sin embargo, la aplicación de proteínas modificadas covalentemente inducidas por ligandos peptídicos es limitada debido a la complicada ruta sintética y a la unión no específica de los grupos químicos22,23. Por lo tanto, se requieren urgentemente estrategias efectivas para la síntesis de péptidos cíclicos.
Inspirado en las múltiples estrategias de péptidos cíclicos 2,24,25,26, este protocolo intenta desarrollar un método simple y eficiente para estabilizar péptidos. Además, observamos que el grupo de cadena lateral de un péptido estable podría reaccionar covalentemente con una proteína diana cuando estaba espacialmente cerca de los ligandos peptídicos. La falta de Met modificado químicamente fue cubierta por el grupo de Deming en 2013 mediante el desarrollo de un nuevo método para producir metionina27 peptídica modificada selectivamente. Basándose en estos antecedentes, Shi et al. se centraron en el desarrollo del cierre de anillo de cadenas laterales para formar un centro de sal de sulfonio. Cuando el ligando peptídico se combina con la proteína diana, el grupo de la sal de sulfonio reacciona covalentemente con la proteína Cys espacialmente cercana. En los últimos años, Shi et al. han diseñado un nuevo método para estabilizar el péptido cíclico28. La sal de sulfonio en el péptido cíclico se redujo mediante un agente reductor con un grupo sulfhidrilo que se redujo reversiblemente a Met. Sin embargo, la reacción tuvo una baja eficiencia, lo que fue perjudicial para los estudios de aplicación biológica posteriores. En el estudio actual, se diseñó una reacción de cierre de anillo Met-Cys y bromuro de propargilo-Cys, con una sola sal de sulfonio restante en la cadena lateral del péptido cíclico. La sal de sulfonio actuó como una nueva ojiva que reaccionó covalentemente con la proteína Cys en proximidad espacial. Brevemente, un péptido mutado Cys y Met fue ciclado por alquilación intramolecular, lo que resultó en la generación de un centro de sulfonio en la correa. En este proceso, la formación de un puente de cadena lateral fue crítica para los péptidos cíclicos. En general, este protocolo describe una ciclación peptídica detallada a base de sulfonio que se logra utilizando condiciones de reacción y operaciones simples. El objetivo es desarrollar un método potencial para otras aplicaciones biológicas amplias.

<table><tbody><tr><td>Energía del ácido 1,3-bis(bromometil)-benceno</td><td></td><td>D0215</td><td></td></tr><tr><td>Energía</td><td>del ácido 1,3-dimetilbarbitúrico</td><td>A46873</td><td></td></tr><tr><td>1H RMN y HSQC</td><td>Bruker</td><td>&nbsp; AVANCE-III 400</td><td></td></tr><tr><td>1-Hidroxibenzotriazol hidrato</td><td>Energía</td><td>E020543</td><td></td></tr><tr><td>2-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HATU)</td><td>Energía</td><td>A1797</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptopiridina</td><td>Energía</td><td>Y31130</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 6-aminocaproico</td><td>Energía</td><td>A010678</td><td></td></tr><tr><td>Anhídrido</td> <td>acéticoEnergía</td><td>A01021454</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de amonio</td><td>Energía</td><td>12980</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano (DCM)</td><td>Energía</td><td>W330229</td><td></td></tr><tr><td>Digital Calefacción Enfriamiento Baño seco</td><td>&nbsp; Thermo Scientific</td><td>88880029</td><td></td></tr><tr><td>Diisopropiletilamina (DIPEA)</td><td>Energía</td><td>W320014</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil formamida (DMF)</td><td>Energía</td><td>B020051</td><td></td></tr><tr><td>Ditiothreitol</td><td>Energía</td><td>A10027</td><td></td></tr><tr><td>Masa de ionización por electrospray</td><td>SHIMADZU2020</td><td>&nbsp; LC-MS2020</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotecnología Ltd</td><td>R30101</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg (Pbf)-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotecnología Ltd</td><td>R30201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys (Trt)-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotech Ltd</td><td>R30501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln (Trt)-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotech Ltd</td><td>R30601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu (OtBu)-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotech Ltd</td><td>R30701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Boc)-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotecnología Ltd</td><td>R30902</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotecnología Ltd</td><td>R31001</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys (Boc)-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31301</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser(tBu)-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotecnología Ltd</td><td>R31601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotecnología Ltd</td><td>R31701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Trp (Boc)-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31801</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(tBu)-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotech Ltd</td><td>R31901</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Péptido de Nanjing Biotech Ltd</td><td>R32001</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Energía</td><td>W810042</td><td></td></tr><tr><td>Líquido de alto rendimiento Cromatografía</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-2030</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>Morpholine</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Diisopropilcarbodiimida</td><td>Energía</td><td>B010023</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo</td> <td>de ninhidrinaEnergy</td><td>N7285</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de propargilo</td>, <td>Energy</td><td>W320293</td><td></td></tr><tr><td>Rink, Amida de Rink, resina MBHA,</td><td>Péptido de Nanjing, Biotech Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placas de recolección de muestras de extracción en fase sólida (SPE)</td><td>&nbsp; Thermo Scientific</td><td>60300-403</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis (trifenilfosfina) paladio</td><td>Energy</td><td>T1350</td><td></td></tr><tr><td>Llaves de paso de tres vías</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Energy</td><td>B010737</td><td></td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>J& K</td><td>101398</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropilsilano (TIS)</td><td>Energía</td><td>T1533</td><td></td></tr></tbody></table>

construcción de péptidos cíclicos usando un centro de sulfonio en la correa

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

En los últimos años, los péptidos cíclicos han atraído cada vez más atención en el campo del descubrimiento de fármacos debido a sus excelentes actividades biológicas y, como consecuencia, ahora se utilizan clínicamente. Por lo tanto, es fundamental buscar estrategias efectivas para sintetizar péptidos cíclicos para promover su aplicación en el campo del descubrimiento de fármacos. Este documento informa un protocolo detallado para la síntesis eficiente de péptidos cíclicos utilizando bisalquilación en resina o intramolecular (intermolecular). Usando este protocolo, los péptidos lineales se sintetizaron aprovechando la síntesis de péptidos en fase sólida con cisteína (Cys) y metionina (Met) acopladas simultáneamente en la resina. Además, los péptidos cíclicos se sintetizaron a través de la bisalquilación entre Met y Cys utilizando una correa sintonizable y un centro de sulfonio en la correa. Toda la ruta sintética se puede dividir en tres procesos principales: la desprotección de Cys en la resina, el acoplamiento del enlazador y la ciclación entre Cys y Met en una solución de escisión de ácido trifluoroacético (TFA). Además, inspirado por la reactividad del centro de sulfonio, se unió un grupo propargil al Met para desencadenar la adición de tiol-yne y formar un péptido cíclico. Después de eso, los péptidos crudos se secaron y disolvieron en acetonitrilo, se separaron y luego se purificaron mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El peso molecular del péptido cíclico se confirmó mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), y la estabilidad de la combinación de péptidos cíclicos con el reductor se confirmó aún más mediante HPLC. Además, el cambio químico en el péptido cíclico se analizó mediante espectros de resonancia magnética nuclear 1H (RMN 1H). En general, este protocolo tenía como objetivo establecer una estrategia efectiva para sintetizar péptidos cíclicos.

Todos los péptidos lineales se sintetizaron en resina Rink-amide MBHA mediante síntesis manual estándar de fase sólida Fmoc. Se construyó un modelo de hexapéptido cíclico (Ac (ciclo-I)-WMAAAC-NH2) como se describe en la Figura 5A. En particular, se generó un nuevo centro quiral en la correa por alquilación Met, con los dos epímeros del péptido cíclico (Ia, Ib) confirmados por HPLC de fase inversa. Además, la conversión y la proporción de epímeros se determinaron utilizando la inte...

Este protocolo presenta la síntesis de péptidos cíclicos a través de la bisalquilación entre cisteína y metionina y la reacción fácil tiol-yne desencadenada por el centro de propargil sulfonio.

Construcción de péptidos cíclicos usando un centro de sulfonio en la correa

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

En este protocolo, se construyó la sal de sulfonio que podía actuar como una nueva mano que reaccionaba con la proteína cisteína en la proximidad especial. La ventaja de esta técnica era que esta reacción era rápida y eficiente, y libre de catalizador Met y desarrolló un método simple y eficiente para estabilizar péptidos. Para comenzar, prepare la solución de desprotección N-terminal de 9-fluorinil-metiloxicarbonilo de piperidina al 20% o morfolina al 50% y DMF en un vaso o matraz de 500 mililitros.Luego, agregue 10 mililitros de la solución de desprotección a la columna y burbujee nitrógeno en la solución durante 30 minutos o dos veces durante cinco minutos. Escurrir la solución con una bomba de vacío y lavar la resina secuencialmente cinco veces con diclorometano y N, N-dimetilformamida. Para detectar la resina como una solución de color amarillo oscuro, agregue un mililitro de N, N-dimetilformamida a una pequeña cantidad de resina y agregue 200 microlitros de ninhidrina al 5% a un tubo de vidrio.Caliéntalo a 130 grados centígrados durante tres minutos para evaluar los cambios en el color de la resina. Para el acoplamiento de péptidos, prepare una solución de mezcla como se describe en el manuscrito en un tubo de polipropileno y disuélvala en tres mililitros de N, N-dimetilformamida. Luego, agregue 173 microlitros de N, N-diisopropiletilamina o 154 microlitros de N, N'diisopropilcarbodiimida a la solución para inactivar el aminoácido.A continuación, agregue la mezcla a la columna con resina y burbujee con nitrógeno durante dos horas. Después del acoplamiento, agregue un mililitro de N, N-dimetilformamida a una pequeña cantidad de resina y agregue 200 microlitros de ninhidrina al 5% a un tubo de vidrio. Calentarlo a 130 grados centígrados durante tres minutos mientras la resina cambia a incolora, lo que confirma la ausencia de un grupo amino libre antes del paso de desprotección.Después de drenar la solución, lave la resina como se demostró anteriormente y agregue 10 mililitros de la solución de desprotección a la columna. Luego, burbujee con nitrógeno durante 30 minutos o dos veces durante cinco minutos. Y de nuevo, agregue una solución nueva.Agregue 10 mililitros de metanol anhidro a la columna con resina para deshidratar y seque con nitrógeno para el próximo uso. Pesar 100 miligramos de la resina en una columna y lavar la resina con diclorometano y N, N-dimetilformamida antes de la etapa de acoplamiento. Preparar una solución para eliminar el grupo de protección de tritil-L-cisteína añadiendo ácido trifluoroacético, triisopropilsilano y mezcla de diclorometano en un vaso o matraz de 100 mililitros para eliminar el grupo protector.Agregue de cinco a 10 mililitros de la solución preparada a la columna para eliminar el grupo de protección durante 10 minutos. Repita seis veces con nitrógeno burbujeante hasta que el color amarillo desaparezca por completo. Después de drenar la solución con una bomba de vacío, lave la resina como se demostró anteriormente.A continuación, preparar una solución para reaccionar con cisteína desprotegida añadiendo enlazador dihalogenado y N, N-diisopropiletilamina en un vaso de precipitados de 50 mililitros o matraz con N, N-dimetilformamida. Agregue de cinco a 10 mililitros de la solución de reacción a la columna para reaccionar con cisteína protegida durante al menos tres horas con burbujeo de nitrógeno. Nuevamente, drene la solución con una bomba de vacío y lave la resina secuencialmente como se demostró anteriormente.Para preparar la solución de ciclación peptídica, agregue la mezcla de ácido trifluoroacético en un vaso de precipitados o matraz de 20 mililitros en la campana extractora para la ciclación peptídica. Luego, agregue de cinco a 10 mililitros de la solución de mezcla al tubo de polipropileno y divida la resina bajo el cóctel de ácido trifluoroacético durante tres horas. Después de deshidratar y lavar la resina antes de que se demuestre previamente el paso de acoplamiento, prepare una solución acuosa de ácido fórmico al 1% y un bromuro de propargil milimolar y agréguelo a la solución de péptido de metionina.A continuación, agite la reacción de acoplamiento de metionina y bromuro de propargil a temperatura ambiente durante 12 horas. Después de la reacción, disuelva el producto en un tubo de polipropileno y acetonitrilo y fílelo a través de una membrana filtrante de 0,22 micrómetros. Luego, purifique la solución por HPLC de fase inversa inmediatamente y séquela por congelación en polvo para el próximo uso.Los péptidos cíclicos sintetizados utilizando bis-alquilación entre cisteína y metionina se caracterizaron por el espectro de HPLC y LCMS, lo que muestra que los epímeros exhibieron distintos tiempos de retención e idénticos pesos moleculares. Las trazas de HPLC de los epímeros y su producto conjugado demostraron la conversión dependiente del tiempo entre el péptido cíclico y su producto. El peso molecular de los péptidos cíclicos sintetizados mediante una reacción de tipo tiol-yne se determinó mediante LCMS y el péptido se aisló y purificó mediante HPLC.Los péptidos se caracterizaron además por RMN de protones y espectros heteronucleares simples de coherencia cuántica, revelando el cambio químico. Se obtuvieron espectros de RMN de protones de la conversión dependiente del tiempo entre péptido cíclico y ditiothreitol y óxido de deuterio para explorar la estabilidad del péptido debido a la apertura del anillo de sulfonio. Los resultados mostraron que no se formaron productos de adición o apertura de anillo después de 24 horas.Este procedimiento estableció una estrategia efectiva para sintetizar péptidos cíclicos. La reacción dice que la selectividad también mejoró al formar una confirmación que estabiliza el péptido de ciclización, lo que indica que los péptidos cíclicos eran prometedores catalizadores de fármacos.

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