Name: In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende a evaluar la respuesta inmune celular usando el adyuvante nanoemulsión Ophiopogonin D con células L929. Este protocolo detallado permite estudiar la eficacia de nuevos adyuvantes vacunales sin toxicidad.

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Este estudio fue apoyado por la subvención No. 2021YFC2302603 del Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China, subvenciones No. 31670938, 32070924, 82041045 y 32000651 del Programa de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China, subvenciones No. 2014jcyjA0107 y No. 2019jcyjA-msxmx0159 del Programa de Proyectos de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing, subvención No. CYS21519 del Proyecto de Investigación e Innovación de Postgrado de Chongqing, subvención No. 2020XBK24 de los proyectos especiales de la Universidad Médica del Ejército, y subvención No. 202090031021 del Programa Nacional de Innovación y Emprendimiento para estudiantes universitarios.

Todos los experimentos celulares se realizaron en un laboratorio de ingeniería celular equipado con quirófanos básicos, salas de amortiguación, salas de cultivo estéril y salas de identificación y análisis. El entorno y las condiciones de trabajo estaban libres de contaminación microbiana y otros factores nocivos. Los experimentos con animales se llevaron a cabo con base en las Directrices para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de los Animales de Laboratorio de la Tercera Universidad Médica Militar.
1. Autoclave y preparación de materiales
<ol><li>Preparar los reactivos y consumibles, como solución salina tamponada con fosfato (PBS), tijeras, pinzas y malla abrasiva, mediante esterilización por calor húmedo en autoclave a 121 °C durante 20 min.</li>
	<li>Para conocer los reactivos y equipos necesarios, consulte la Tabla de materiales. Para la fórmula de la nanoemulsión en blanco (BNE), consulte la Tabla 1.</li>
</ol>2. Ensayo de citotoxicidad L929
<ol><li>Encienda el baño maría y ajuste la temperatura a 37 °C. Recoger un tubo de células L929 congeladas de nitrógeno líquido y descongelar rápidamente en un baño de agua a 37 °C.</li>
	<li>Pipetear las células en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml rápidamente después de la descongelación, agregar 2 ml de DMEM y mezclar bien.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 129 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Luego, agregue 2 ml de DMEM para resuspender las células y centrifugar las muestras nuevamente a 129 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Desechar el sobrenadante, añadir 6 ml de medio completo DMEM (que contenga un 10% de FBS) para su resuspensión, y transferir a un matraz de cultivo T25 en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 para cultivar durante 48 h.</li>
	<li>Desechar el medio de cultivo en el matraz de cultivo y lavar las células dos veces con 2 ml de PBS. Luego, agregue 1 ml de tripsina al 0,25% para digerir las células durante 1-2 minutos a 37 ° C.</li>
	<li>Cuando se observa el redondeo de las células, agregue 4 ml de medio completo DMEM para terminar la digestión inmediatamente y mezclar bien. Luego, aspire las células en un tubo de centrífuga estéril de 15 ml y centrifugar a 129 x g durante 5 min.</li>
	<li>Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 1 ml de medio completo DMEM. Utilice una suspensión de células de 20 μL para el recuento de células utilizando placas de recuento de células y diluya las células restantes a 1 x 105 células/ml con medio completo DMEM.</li>
	<li>Agregue 100 μL de agua ultrapura a la periferia de una placa de 96 pocillos y agregue 100 μL de diluyente celular solo a los pocillos internos. Colocar la placa en la incubadora para el cultivo adherente durante 4 h a 37 °C.</li>
	<li>Después de que las células se adhieran, agregue OP-D y NOD por separado en medio completo DMEM a un volumen final de 200 μL / pocillo (las concentraciones finales de cada fármaco son 480 μg / ml, 240 μg / ml, 120 μg / ml, 60 μg / ml y 30 μg / ml). Para cada concentración, use tres pocillos como réplicas. Luego, coloque las células nuevamente en la incubadora y cultive durante otras 24 h.</li>
	<li>Diluir CCK-8 al 10% con medio completo DMEM y añadir diluciones de 100 μL/pocillo que contengan las soluciones adyuvantes y celulares a la placa de 96 pocillos. Coloque la placa de nuevo en la incubadora e incube durante otras 2-3 h.</li>
	<li>Mezcle con frecuencia mientras se coloca la solución celular para evitar la falta de homogeneidad debido a la precipitación celular. Agite suavemente la placa varias veces antes y después de agregar el CCK-8 para mezclar bien el medio y la solución de CCK-8.</li>
	<li>Mida la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de microplacas. Configure un pozo de puesta a cero con solo medio y CCK-8 para un valor de absorbancia de referencia. Calcule valores de absorbancia precisos restando el valor de absorbancia a cero del valor de absorbancia obtenido al trazar.</li>
	<li>Confirme que no hay burbujas presentes en ningún pozo antes de realizar la prueba con el lector de microplacas, ya que las burbujas interferirán con el ensayo.</li>
</ol>3. Estimulación de esplenocitos
<ol><li>Inmunizar ratones BALB/c de 6 a 8 semanas de edad con 30 μg de antígeno proteico más 30 μg de adyuvante mediante una inyección intramuscular (200 μL) el día 0, el día 7 y el día 14 de acuerdo con los siguientes grupos experimentales: (1) grupo PBS, (2) grupo antígeno (Ag), (3) antígeno + grupo OP-D (Ag/OP-D), (4) antígeno + grupo BNE (Ag/BNE), (5) grupo antígeno + NOD (Ag/NOD) y (6) antígeno + grupo AlPO4 (Ag/Al).</li>
	<li>Sala de preparación: El día 24 después de la inmunización primaria, retirar los ratones de la sala de animales y sacrificarlos mediante una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al 1%. Coloque los ratones en un plato de vidrio y sumérjase en alcohol al 75% durante 5 minutos.</li>
	<li>Coloque los tubos de centrífuga en una rejilla de tubos de centrífuga, numere las placas de Petri desechables y agregue 5 ml de PBS a cada placa de Petri con una pipeta de 10 ml.</li>
	<li>Haga una incisión de 6-8 cm con tijeras en el medio del lado ventral izquierdo del ratón, abra la piel, exponga la pared abdominal y localice la larga franja roja del bazo.</li>
	<li>Levante el peritoneo en el lado inferior del bazo con fórceps, córtelo y gírelo hacia arriba para exponer el bazo. Levante el bazo con fórceps, separe el tejido conectivo debajo del bazo con tijeras oftálmicas y retire el bazo.</li>
	<li>Coloque el bazo en una placa de Petri que contenga 5 ml de PBS y molino con un tamiz (malla 200, 70 μm) y una barra de molienda. Después de moler, transfiera el líquido a un tubo de centrífuga de 15 ml con un gotero de codo de acuerdo con la numeración.</li>
	<li>Centrifugar el líquido a 453 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, agregue 3 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos a cada tubo, resuspenda las células y lisar a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Agregue 10-12 ml de PBS a cada tubo, mezcle el tubo boca abajo y centrifugar a 453 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, agregue 10 ml de PBS a cada tubo de centrífuga y vuelva a suspender las células.</li>
	<li>Tome 20 μL de cada muestra en un pocillo de la placa de conteo de células y registre el número de células vivas utilizando un contador de células automatizado.</li>
	<li>Centrifugar las muestras a 453 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. Resuspender las células, diluir a 2,5 x 106 células/ml con medio RF-10 (información de formulación en la Tabla 2) y añadir a una placa de 96 pocillos a 100 μL/pocillo.</li>
	<li>Diluir el antígeno con RF-10 medio a 10 μg/ml, añadir 100 μL a cada pocillo e incubar durante 3 días a 37 °C enCO2 al 5%.</li>
	<li>Aspirar la suspensión celular obtenida de cada grupo de células en tubos de centrífuga de 1,5 ml, centrifugar a 453 x g durante 20 min y aspirar el sobrenadante en un tubo de centrífuga limpio.</li>
	<li>Realice la detección de contenido IFN-γ e IL-17A estrictamente de acuerdo con las instrucciones del kit ELISA. Los métodos y procedimientos son los siguientes.</li>
	<li>Preparar 1x solución de trabajo tampón de lavado (suministrada con el kit), solución de concentración de gradiente estándar (solución patrón diluida de citoquinas a 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,3 pg/ml y 15,6 pg/ml en el tampón de dilución R [1x] suministrado con el kit), solución de trabajo de anticuerpos biotinilados (solución diluida de anticuerpos biotinilados a 1:100 utilizando el tampón de dilución R [1x] suministrado con el kit para formar la solución de trabajo), y solución de trabajo de estreptavidina-HRP según sea necesario.</li>
	<li>Añadir 100 μL/pocillo de solución patrón de citoquinas diluidas en el pocillo patrón, 100 μL/pocillo de muestra en el pocillo de muestra (el tampón de dilución R [1x] suministrado con el kit se utiliza para la dilución de la muestra) y 100 μL/pocillo de tampón de dilución R (1x) en el pocillo de control en blanco.</li>
	<li>Añadir solución de trabajo de anticuerpos biotinilados a 50 μL/pocillo. Mezclar bien, cubrir con una membrana de sellado e incubar a 37 °C durante 90 min.</li>
	<li>Retire el líquido de los pocillos y agregue 1x solución de trabajo tampón de lavado a 300 μL / pocillo. Deseche el líquido de los pozos después de 1 min. Repita este proceso 4 veces dejando que el líquido se seque en papel de filtro cada vez.</li>
	<li>Añadir 100 μL/pocillo de solución de trabajo de estreptavidina-HRP. Cubrir e incubar las muestras a 37 °C durante 30 min. Centrifugar las muestras a 453 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante. NOTA: La solución de lavado que queda en el pozo de reacción durante el proceso de lavado debe ser golpeada a fondo hasta que no se pueda ver ninguna marca de agua en el papel de filtro.</li>
	<li>Añadir TMB a 100 μL/pocillo, incubar las placas a 37 °C durante 5-30 min en la oscuridad y juzgar la reacción de terminación según la profundidad de color en el pozo (azul oscuro). Por lo general, 10-20 minutos para el desarrollo del color puede lograr buenos resultados.</li>
	<li>Terminar la reacción rápidamente añadiendo solución de parada a 100 μL/pocillo. Detecte el valor de absorbancia a 450 nm dentro de los 10 minutos posteriores a la terminación. NOTA: Equilibre el reactivo a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarlo.</li>
</ol>4. Ensayo ELISpot
<ol><li>Realice la inmunización de los ratones y la recolección de esplenocitos exactamente como se describe en los pasos 3.1-3.10 anteriores. Realice los ensayos para IFN-γ e IL-17A en estricta conformidad con las instrucciones del kit. Los métodos y procedimientos son los siguientes.</li>
	<li>Retire la placa del envase sellado, lave 4 veces con PBS estéril (200 μL/pocillo) y añada 1640 medios de cultivo completos (200 μL/pocillo) para equilibrarla a temperatura ambiente durante 2 h.</li>
	<li>Retirar el medio y diluir la suspensión de esplenocitos con medio RF-10 a 2 x 105 células/ml, añadiendo 50 μL de células y antígeno por pocillo (concentración final: 10 μg/ml).</li>
	<li>Colocar la placa en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2 durante 48 h. No mueva la placa durante este tiempo y tome medidas para evitar la evaporación (por ejemplo, envuelva la placa con papel de aluminio).</li>
	<li>Diluir el anticuerpo de detección (BVD6-24G2-biotina) a 1 μg/ml (1:1.000) en solución salina tamponada con fosfato (0,5 ml:100 ml) que contiene 0,5% de suero bovino fetal (PBS-0,5% FBS). Añadir 100 μL/pocillo a la placa, e incubar a temperatura ambiente durante 2 h después de la filtración a través de una membrana de 0,22 μm.</li>
	<li>Decantar el líquido en los pocillos, añadir 1x tampón de lavado a 200 μL/pocillo y lavar 5x. Dejar actuar durante 30-60 s cada vez, y por última vez, dejar secar en papel secante.</li>
	<li>Diluir la estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (1:1.000) en PBS-0,5% FBS y añadir 100 μL/pocillo. Incubar el plato durante 1 h a temperatura ambiente. Lave el plato como en el paso 4.6.</li>
	<li>Añadir 100 μL/pocillo de solución de sustrato TMB lista para usar y desarrollar hasta que aparezca una mancha clara. Detenga el desarrollo del color lavando extensamente en agua desionizada (enjuague 5x-6x repetidamente). Si es necesario, retire la alcantarilla (el plástico blando debajo de la placa) y enjuague la parte inferior de la membrana.</li>
	<li>Examine y cuente las manchas en un lector ELISpot o microscopio de disección después de que la placa se haya secado.</li>
</ol>5. Aceptación por los países en desarrollo
<ol><li>Eutanasia en ratones BALB/c normales mediante una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de pentobarbital sódico al 1%. Remoje los ratones en alcohol al 75% durante 5 minutos.</li>
	<li>Corte una incisión de 6-8 cm debajo del abdomen del ratón con tijeras, y sujete los dos extremos de la abertura para separarla en diferentes direcciones y exponer las patas del ratón. Separe el fémur del ratón del cuerpo del ratón y la tibia de la articulación, y mantenga los huesos intactos en ambos extremos.</li>
	<li>Retire el tejido residual y el cartílago de las articulaciones articulares en ambos extremos del fémur con tijeras y fórceps. Remoje los fémures en alcohol al 75% durante 5 minutos, y luego sumérjase en una solución estéril de PBS para lavar el alcohol de la superficie.</li>
	<li>Corte los extremos de los fémures con tijeras y enjuague la médula ósea en una placa de Petri estéril con solución estéril de PBS seguida de aspiración con una jeringa de 1 ml. Repita el lavado 3x-5x.</li>
	<li>Filtrar mediante un tamiz celular (malla 200, 70 μm) y recoger los BMDC en un tubo centrífugo de 15 ml. Centrifugar las muestras a 290 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante, agregue 4 ml de tampón de lisis de glóbulos rojos, resuspenda y lisar a temperatura ambiente durante 5 min.</li>
	<li>Añadir 10 ml de solución estéril de PBS para neutralizar el lisado, centrifugar a 290 x g durante 5 min, y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 1 ml de DMEM que contiene 1% de solución de penicilina-estreptomicina y 10% FBS y contar. Luego, agregue GM-CSF (20 ng / ml) más IL-4 (10 ng / ml) al medio, ajuste la concentración celular a 5 x 105 / ml e inocule las células en cubreobjetos.</li>
	<li>Añadir la suspensión celular a una placa de 6 pocillos a 2 mL/pocillo y colocar la placa en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2 durante 48 h. Cambie el medio completamente después de 2 días y cambie la mitad del medio después de 4 días.</li>
	<li>Seleccione cinco pocillos con células en buen estado (células grandes y radiotransparentes con protuberancias dendríticas en la superficie celular) utilizando un microscopio invertido con un aumento de 100x para el experimento en el séptimo día de cultivo. Deseche el sobrenadante, agregue 2 ml de soluciones de GFP, OP-D + GFP y NOD + GFP diluidas con medio completo DMEM (concentración final de GFP: 20 μg / ml; concentración final adyuvante: 10 μg / ml) a cada pocillo e incube las placas a 37 ° C durante 30 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Lave las placas 3 veces con PBS, agregue 1 ml de paraformaldehído al 4% a cada pocillo e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos. Retire el paraformaldehído después de la fijación, incubar las células con faloidina y DAPI a una concentración final de 10 μg / ml durante 10 minutos para la tinción, y luego lavar 3 veces con PBS.</li>
	<li>Agregue 1 ml de PBS a cada pocillo y observe la captación de antígenos usando CLSM, como se describe a continuación.<ol><li>Abra el software CLSM, haga clic en Sistema ZEN y espere a que se complete la inicialización del hardware.</li>
		<li>Haga clic en los accesos directos GFP y DAPI en la pestaña localizar para encontrar el área que se puede observar. Apague la luz fluorescente y la luz transmitida.</li>
		<li>Haga clic en Configuración inteligente en el menú de adquisición para abrir la biblioteca de tintes y agregue tres tintes fluorescentes: EGFP, faloidina y DAPI. Haga clic en Mejor señal > Aceptar. Haga clic en el canal EGFP en la pestaña canales y haga clic en Live para seleccionar el campo de visión correcto en la interfaz derecha.</li>
		<li>Seleccione 1 UA para el agujero de alfiler, gire el tornillo de enfoque fino para ajustar la distancia focal y seleccione el plano focal adecuado. Haga clic en Indicador de rango y ajuste la combinación de potencia láser y ganancia maestra para que solo aparezcan puntos rojos esporádicos en la imagen.</li>
		<li>Ajuste los canales de faloidina y DAPI con los mismos parámetros sin cambiar la potencia del láser.</li>
		<li>Seleccione Detener en vivo y haga clic en Modo de adquisición para cambiar los parámetros de disparo: Tamaño de cuadro: 1024 píxeles x 1024 píxeles; Velocidad de escaneo: 7; Promedio: 2x. Haga clic en Ajustar y seleccione Dividir para ver todas las imágenes tomadas. Guarde las imágenes.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Activación de macrófagos
<ol><li>Sumerja los ratones C57BL / 6 en alcohol al 75% después de la eutanasia y colóquelos boca arriba en una placa de Petri de vidrio en orden numerado.</li>
	<li>Pase los ratones a través de la ventana de transferencia a la sala de operaciones estéril y colóquelos en la mesa de operaciones durante 5 minutos.</li>
	<li>Usando una jeringa, aspire 10 ml de solución salina, incline los ratones hacia abajo a aproximadamente 45 ° e inyecte en el centro de la cavidad abdominal. Extraiga aproximadamente 5 ml de suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 ml por cada 10 ml y repita la inyección 3 veces.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular a 129 x g durante 5 min para obtener macrófagos primarios peritoneales de ratón. Resuspender las células, ajustar la concentración celular a 2 x 106 células/ml con medio completo RPMI 1640 (que contiene 10% de FBS) e inocular la suspensión celular en una placa de 24 pocillos para asegurar un número constante de células por pocillo (1 ml/pocillo).</li>
	<li>Cultivo a 37 °C enCO2 al 5% durante la noche (aproximadamente 16-20 h), seguido de incubación con PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD y Ag/Al (concentración final de Ag: 5 μg/mL; concentración final adyuvante: 10 μg/mL; volumen total: 2 mL) durante 24 h. Detectar los niveles de IL-1β, IL-6 y TNF-α en el sobrenadante de cultivo con kits ELISA utilizando los métodos y procedimientos descritos en los pasos 3.12-3.19.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros o personales en competencia que podrían haber influido en el trabajo reportado en este documento.

Las vacunas de subunidades proporcionan una excelente seguridad pero una inmunogenicidad deficiente. La estrategia principal para mejorar la inmunogenicidad es adsorber físicamente o acoplar antígenos con adyuvantes e incorporarlos a los sistemas de administración de fármacos para promover la absorción y presentación por parte de las DC. Las saponinas vegetales naturales como la saponina quillaia y sus derivados son altamente tóxicas y no son adecuadas para el desarrollo de vacunas humanas17. Por ...

Las vacunas son un medio importante para prevenir y tratar las enfermedades infecciosas y no transmisibles. La adición adecuada de adyuvantes y vehículos de administración a las formulaciones de vacunas es beneficiosa para mejorar la inmunogenicidad de los antígenos y generar respuestas inmunes duraderas1. Además del alumbre adyuvante clásico (sal de aluminio), hay seis tipos de adyuvantes para vacunas que se comercializan actualmente: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 y Matrix-M5. Generalmente, cuando el cuerpo humano se encuentra con un ataque viral, la primera y segunda línea de defensa (piel, mucosa y macrófagos) toman la delantera en la eliminación del virus, y finalmente, se activa la tercera línea de defensa, que involucra los órganos inmunes y las células inmunes. El aluminio y las sales de aluminio han sido los adyuvantes más utilizados para las vacunas humanas desde principios de la década de 1920, provocando una respuesta inmune innata efectiva6. Sin embargo, se ha propuesto que la activación de las células presentadoras de antígeno (APC) por adyuvantes clásicos, que estimula a las células inmunes para generar conjuntos específicos de citoquinas y quimiocinas, es el mecanismo por el cual funcionan los adyuvantes y puede ser una de las razones por las cuales los adyuvantes ejercen solo efectos transitorios sobre respuestas inmunes específicas7. La presencia de adyuvantes autorizados limitados para uso humano es un factor restrictivo para el desarrollo de vacunas que provoquen respuestas inmunes efectivas8.
Actualmente, un número creciente de estudios adyuvantes están demostrando la capacidad de inducir una fuerte respuesta inmune celular en ratones. Se ha demostrado que QS-21 induce una respuesta inmune equilibrada de T-helper 1 (Th1) y T-helper 2 (Th2), produce niveles más altos de títulos de anticuerpos y prolonga la protección como adyuvante, pero su fuerte toxicidad y propiedades hemolíticas limitan su desarrollo como adyuvante clínico independiente 9,10. OP-D (ruscogenina-O-α-L-ramnopiranosia1-(1→2)-β-D-xilopiranosil-(1→3)-β-D-fucopiranósido) es una de las saponinas esteroides aisladas de la raíz de la planta medicinal china Ophiopogon japonicas4. Además, es el principal componente farmacológicamente activo (Shen Mai San) que se encuentra en Radix Ophiopogonis y se sabe que tiene ciertas propiedades farmacológicas11. Además, es un miembro de la familia Liliaceae y es ampliamente utilizado por sus efectos inhibitorios y protectores en la inflamación celular y la lesión miocárdica. Por ejemplo, OP-D mejora las lesiones similares a la dermatitis atópica inducida por DNCB y las células inflamatorias HaCaT del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en ratones BALB/c12. Es importante destacar que OP-D promueve la protección antioxidante del sistema cardiovascular y protege el corazón contra la lesión autofágica inducida por doxorrubicina al reducir la generación de especies reactivas de oxígeno e interrumpir el daño de la membrana mitocondrial. Los experimentos han demostrado que tomar OP-D con monodesósido ayuda a mejorar la salud inmunológica, aumentar el recuento de glóbulos blancos y la síntesis de ADN, y hacer que los anticuerpos duren más13. Anteriormente se ha encontrado que la OP-D tiene un efecto adyuvante14.
Las nanoemulsiones son nanoformulaciones de aceite en agua compuestas por una combinación de tensioactivos, aceite, cosurfactantes y agua12,15. Estos diseños de nanovacunas permiten encapsular antígenos y adyuvantes juntos para mejorar la estimulación inmune, proteger los antígenos y promover la maduración de las células dendríticas (DC)16. Para el desarrollo de estos nuevos adyuvantes obtenidos del cribado, es importante encontrar métodos apropiados para evaluar sus capacidades de respuesta celular.
El propósito de este protocolo es evaluar sistemáticamente si los adyuvantes pueden mejorar la fagocitosis y la expresión de células inmunes en cultivo celular in vitro y elaborar los principales métodos experimentales. El experimento se divide en cuatro subsecciones: (1) la toxicidad de OP-D y NOD para las células L929 se determina mediante el ensayo del kit de conteo de células-8 (CCK-8); (2) los niveles de citoquinas de IFN-γ endocrino e IL-17A y el número de células correspondiente en ratones inmunizados se detectan mediante estimulación de esplenocitos y ensayos ELISpot; (3) la capacidad de presentación de antígenos de las CD después de la estimulación adyuvante se observa mediante microscopía confocal; y (4) se detectan los tres tipos de citocinas, IL-1β, IL-6 y TNF-α, en los sobrenadantes obtenidos de macrófagos peritoneales (PM) en ratones normales cocultivados con adyuvantes.

<table><tbody><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>GIBCO, EE. UU.</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>placas de filtro de 96 pocillos</td><td>Millipore. Billerica, MA</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>AlPO4</td><td>General Chemical Company, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>null Contador de células automatizado</td><td>Countstar, China</td><td>IC1000</td><td></td></tr><tr><td>ratones BALB/c y ratones C57BL/6</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td>nulo</td><td></td></tr><tr><td>triglicérido caprílico/cáprico (GTCC)</td><td>Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Pekín, China</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Kits CCK-8</td><td>Dojindo, Japón</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Placa de recuento de células</td><td>Costar, Corning, EE. UU.</td><td>CO010101</td><td></td></tr><tr><td>Tamiz de células</td><td>biosharp, China</td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5810 R</td><td>Eppendorf, Alemania&nbsp;</td><td></td><td></td>5811000398</tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM básico (1x) medio</td><td>GIBCO, EE. UU.</td><td>C11885500BT</td><td></td></tr><tr><td>DSZ5000X Microscopio invertido</td><td>Nikon, Japón</td><td>DSZ5000X</td><td></td></tr><tr><td>EL-35 (Cremophor-35)</td><td>Mumbai, India</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>ELISpot classic</td><td>AID, Alemania</td><td>ELR06</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>GIBCO, EE. UU.</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>Lector de microplacas con todas las funciones Thermo</td><td>Fisher Scientific, EE. UU.</td><td>VL0000D2</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td><td>P42212</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen, EE. UU</td>. <td></td> 35050061 <td></td></tr><tr><td>Granulocitos Macrófagos Factor estimulante de colonias GM-CSF</td><td>, R& D Systems, EE. UU.</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>HF 90/240 Incubator</td><td>Heal Force, Suiza</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech, EE. UU.</td><td>042149</td><td></td></tr><tr><td>línea celular L929</td><td>FENGHUISHENGWU, China</td> <td>&nbsp; NCTC clon 929 (RRID:CVCL_0462)</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía confocal de escaneo láser</td><td>Zeiss, Alemania</td><td>LSM 980</td><td></td></tr><tr><td>MONTANE 85 PPI</td><td>SEPPIC, Francia</td><td>L12910</td><td></td></tr><tr><td>MONTANOX 80 PPI</td><td>SEPPIC, Francia</td><td>36372K</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IFN-&gamma; Kit ELISA</td><td>Dakewe, China</td><td>1210002</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IFN-&gamma; Kit ELISPOT prerrevestido</td><td>Dakewe, China</td><td>DKW22-2000-096</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IL-17A Kit ELISA</td><td>Dakewe, China</td><td>1211702</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IL-17A ELISpotPLUS Kit</td><td>ebiosciences, Estados Unidos</td><td>3521-4HPW-2</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IL-1&beta; Kit de ELISA</td><td>Dakewe, China</td><td>1210122</td><td></td></tr><tr><td>Ratón IL-6 Kit de ELISA</td><td>Dakewe, China</td><td>1210602</td><td></td></tr><tr><td>Ratón TNF-&alpha; Kit ELISA</td><td>Dakewe, China</td><td>1217202 Aminoácidos</td><td></td></tr><tr><td>no esenciales (100x)</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Ophiopogonin-D</td><td>Chengdu Purui Technology Co. Ltd</td><td>945619-74-9</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Solarbio, China</td><td>CA1620</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato Solución salina tamponada</td><td>ZSGB-BIO, China</td><td>ZLI-9062</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de lisis de glóbulos rojos</td><td>Solarbio, China</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio</td><td>Hyclone (Life Technology), EE. UU.</td><td>SH30809.01</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Invitrogen, EE. UU.</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Escualeno</td><td>Sigma, EE. UU</td>. <td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>&beta;- Mercaptoetanol</td><td>Invitrogen, Estados Unidos</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión ophiopogonin d

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Como ingrediente principal de las vacunas, los adyuvantes pueden inducir o mejorar directamente las respuestas inmunes potentes, generalizadas, innatas y adaptativas asociadas con los antígenos. Se ha encontrado que la ofiopogonina D (OP-D), un componente purificado extraído de la planta Ophiopogon japonicus, es útil como adyuvante de la vacuna. Los problemas de la baja solubilidad y toxicidad de OP-D se pueden superar eficazmente mediante el uso de un método de emulsificación de baja energía para preparar la nanoemulsión de ofiopogonina D (NOD). En este artículo, se examinan una serie de protocolos in vitro para la evaluación de la actividad celular. Los efectos citotóxicos de L929 se determinaron mediante un ensayo de kit de conteo celular-8. Luego, los niveles de citoquinas secretadas y el número de células inmunes correspondientes después de la estimulación y el cultivo de esplenocitos de ratones inmunizados se detectaron mediante métodos ELISA y ELISpot. Además, la capacidad de absorción de antígenos en células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC), que se aislaron de ratones C57BL / 6 y maduraron después de la incubación con GM-CSF más IL-4, se observó mediante microscopía confocal de barrido láser (CLSM). Es importante destacar que la activación de los macrófagos se confirmó midiendo los niveles de IL-1β, IL-6 y citoquinas del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) mediante kits ELISA después de cocultivar macrófagos peritoneales (PM) de ratones en blanco con el adyuvante durante 24 h. Se espera que este protocolo proporcione a otros investigadores enfoques experimentales directos y efectivos para evaluar la eficacia de la respuesta celular de los nuevos adyuvantes de vacunas.

La evaluación de la actividad celular de los adyuvantes OP-D y NOD se completó in vitro de acuerdo con el protocolo. Los fibroblastos L929 son un modelo de cribado útil para los ensayos de toxicidad in vitro de la NOD (Figura 1). La cuantificación de los niveles de citoquinas inflamatorias en el bazo puede ayudar a los investigadores a comprender mejor la respuesta inmune (Figura 2). La monitorización de CTL con ELISpot es el estándar de oro pa...

El protocolo presenta métodos detallados para evaluar si el adyuvante de bioemulsión ofiopogonina D promueve respuestas inmunes celulares efectivas.

In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Este protocolo puede proporcionar a otros investigadores enfoques experimentales directos y efectivos y los pasos detallados para evaluar la eficacia de la respuesta celular de los nuevos adyuvantes de vacunas. No solo puede proporcionar a los investigadores métodos específicos de evaluación celular para adyuvantes, sino que también puede descomponer métodos de extracción como la enfermedad BM. Estos protocolos no solo demuestran que no hay toxicidad y una alta entrega celular, sino que también proporcionan procedimientos detallados para el campo de evaluación adyuvante.Para comenzar, encienda el baño de agua y ajuste la temperatura a 37 grados centígrados. Luego, después de recolectar un tubo de células L929 congeladas de nitrógeno líquido, descongele rápidamente en el baño de agua. Después de pipetear las células en un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros, agregue dos mililitros de DMEM y mezcle bien.Centrifugar las muestras a 129 x g durante cinco minutos. Y después de desechar el sobrenadante, agregue dos mililitros de DMEM para resuspender las células. Centrifugar las muestras de nuevo.Y después de desechar el sobrenadante, agregue seis mililitros de medio completo DMEM para la resuspensión, y transfiera a un matraz de cultivo de T25 centímetros cuadrados en una incubadora de 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono para cultivar durante 48 horas. El día 24 después de la inmunización primaria, retire los ratones de la habitación del animal, colóquelos en un plato de vidrio y sumérjalos en alcohol al 75% durante cinco minutos. Coloque los tubos de la centrífuga en una rejilla para tubos de centrífuga, numere las placas de Petri desechables y agregue cinco mililitros de PBS a cada placa de Petri con una pipeta de 10 mililitros.Haga una incisión de seis a ocho centímetros con tijeras en el centro del lado ventral izquierdo del ratón. Abra la piel para exponer la pared abdominal y localizar la larga franja roja del bazo. Luego, levante el peritoneo en el lado inferior del bazo con fórceps.Ábrelo y gíralo hacia arriba para exponer el bazo. Levante el bazo con fórceps. Separe el tejido conectivo debajo del bazo con tijeras oftálmicas y retire el bazo.Coloque el bazo en una placa de Petri que contenga cinco mililitros de PBS y muele con un tamiz y un émbolo de jeringa. Después de moler, transfiera el líquido a un tubo de centrífuga de 15 mililitros con una pipeta de acuerdo con la numeración. A continuación, centrifugar el líquido a 453 x g durante cinco minutos.Y después de desechar el sobrenadante, agregue tres mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos a cada tubo. Resuspender las células y lisar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego agregue de 10 a 12 mililitros de PBS a cada tubo.Y después de mezclar y centrifugar a 453 x g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y agregue 10 mililitros de PBS a cada tubo de centrífuga y resuspenda las celdas. Tome 20 microlitros de cada muestra en un pocillo de la placa de conteo de células y registre el número de células vivas utilizando un contador de células automatizado. A continuación, centrifugar las muestras a 453 x g durante cinco minutos.Y después de desechar el sobrenadante, diluir a 2.5 x 10 a la sexta celdas por mililitro con medio RF10 y agregar a una placa de 96 pocillos a 100 microlitros por pozo. Corte una incisión de seis a ocho centímetros debajo del abdomen del ratón con tijeras y sujete los dos extremos de la abertura para separarla en diferentes direcciones y exponer las patas del ratón. Separe el fémur del ratón del cuerpo del ratón y la tibia de la articulación.Y mantenga los huesos intactos en ambos extremos. A continuación, retire el tejido residual y el cartílago de las articulaciones articulares en ambos extremos del fémur con tijeras y fórceps. Remoje los fémures en alcohol al 75% durante cinco minutos y luego sumerja en una solución estéril de PBS para lavar el alcohol de la superficie.Luego corte los extremos de los fémures con tijeras y enjuague la médula ósea en una placa de Petri estéril con solución estéril de PBS, seguida de aspiración con una jeringa de un mililitro. Repita el lavado de tres a cinco veces. A continuación, filtre mediante un tamiz celular y recoja las células dendríticas derivadas de la médula ósea en un tubo de centrífuga de 15 mililitros.Después de centrifugar las muestras a 290 x g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y agregue cuatro mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos, resuspenda y lise a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agregue 10 mililitros de solución estéril de PBS para neutralizar el lisado, y después de centrifugar a 290 x g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de DMEM que contenga 1% de solución de penicilina-estreptomicina y 10% de suero bovino fetal y recuento.Luego agregue el factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos más interleucina-4 al medio. Ajuste la concentración celular a 5 x 10 al quinto por mililitro e inocule las células en cubreobjetos. Después de agregar la suspensión celular a una placa de seis pocillos a dos mililitros por pozo, coloque la placa en una incubadora humidificada a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 48 horas.Cambie el medio completamente después de dos días y cambie la mitad del medio después de cuatro días. Sumerja los ratones en alcohol al 75% después de la eutanasia y colóquelos boca arriba en una placa de Petri de vidrio en orden numerado. Pase los ratones a través de la ventana de transferencia a la sala de operaciones estéril y colóquelos en la mesa de operaciones durante cinco minutos.Usando la jeringa, aspire 10 mililitros de solución salina. Incline los ratones hacia abajo a aproximadamente 45 grados e inyecte en el centro de la cavidad abdominal. Extraiga aproximadamente cinco mililitros de suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mililitros por cada 10 mililitros y repita la inyección tres veces.Centrifugar la suspensión celular a 129 x g durante cinco minutos para obtener macrófagos primarios peritoneales de ratón. Los fibroblastos L929 son un modelo de cribado útil para las pruebas de toxicidad in vitro de NOD. La cuantificación de los niveles de citoquinas inflamatorias en el bazo puede ayudar a los investigadores a comprender mejor la respuesta inmune.La monitorización de linfocitos T citotóxicos con inmunospot ligado a enzimas es el estándar de oro para evaluar la inmunidad de las células T específicas del antígeno en ensayos clínicos y para detectar vacunas candidatas. El aumento de la captación de un antígeno por las células dendríticas puede provocar respuestas inmunes adaptativas mejoradas. Los macrófagos desempeñan un papel importante en la presentación de antígenos a las células T, así como en la inducción de otras células presentadoras de antígenos para expresar moléculas coestimuladoras, iniciando así respuestas inmunes adaptativas.El aislamiento de las células bajo la proporción de fármaco a la acción celular es de suma importancia.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un método para evaluar la respuesta inmune de anticuerpos a una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión en ratones pre-inmunizados. La inmunización mejora la respuesta de los anticuerpos, como se confirma mediante la determinación de los títulos de anticuerpos IgG.

Medición de los niveles de inmunoglobulina G frente a una vacuna de prueba en un suero de ratón

Este video muestra la producción de vacunas tumorales con nanoemulsión. Los depósitos estables de los depósitos de petróleo que transportan péptidos sintéticos y adyuvantes se producen mediante nanoemulsión de baja energía, lo que ofrece una gran promesa para la inmunoterapia tumoral.

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Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.

Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

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Aquí, se presenta un protocolo simple para producir nanopartículas de ARNm basadas en polímeros de poli(beta aminoéster), fáciles de adaptar cambiando el ARNm encapsulado. También se describe el flujo de trabajo para sintetizar los polímeros, las nanopartículas y su caracterización esencial in vitro. También se agrega una prueba de concepto con respecto a la inmunización.

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Aquí, presentamos métodos detallados para la preparación y evaluación de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo.

Preparación, características, toxicidad y evaluación de la eficacia de la vacuna nasal autoensamblada para tumores de nanoemulsión in vitro e in vivo

Para diseñar racionalmente adyuvantes eficientes, desarrollamos la emulsión de Pickering estabilizada con nanopartículas de ácido poliláctico-co-glicólico (PNPE). El PNPE poseía una suavidad única y una interfaz hidrófoba para un potente contacto celular y ofrecía una carga de antígenos de alto contenido, mejorando la afinidad celular del sistema de administración a las células presentadoras de antígenos e induciendo una internalización eficiente de los antígenos.

Afinidad celular de la emulsión estabilizada por partículas para aumentar la internalización del antígeno

El presente protocolo prepara y evalúa las propiedades físicas, la respuesta inmune y el efecto protector in vivo de una nueva vacuna adyuvante de nanoemulsión.

Evaluación de la respuesta inmune de una vacuna adyuvante de nanoemulsión contra la infección por Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)

En este protocolo, desarrollamos un ácido retinoico (AR) encapsulado en nanoemulsión catiónica para ser utilizado como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de antígeno. Al agregar el AR aprobado por la FDA a la nanoemulsión, se promovió la sIgA específica del antígeno en la vagina y el intestino delgado después de la inyección intramuscular de la nanoemulsión.

Ácido retinoico encapsulado en nanoemulsión catiónica como adyuvante para promover respuestas sistémicas y mucosas específicas de OVA

La migración de los linfocitos T se produce durante la recalada de los órganos linfoides, la salida de la vasculatura, y entrar en los tejidos periféricos. Aquí se describe un protocolo que se puede utilizar para analizar la migración de los linfocitos...

Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro</em

Aprende a evaluar la respuesta inmune celular usando el adyuvante nanoemulsión Ophiopogonin D con células L929. Este protocolo detallado permite estudiar la eficacia de nuevos adyuvantes vacunales sin toxicidad.

In vitro Evaluación de la actividad celular del adyuvante de la vacuna de nanoemulsión Ophiopogonin D

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