Construcción de péptidos cíclicos penetrantes de células para mejorar la penetración de barreras biológicas

Un obstáculo serio para el tratamiento del cáncer es el acceso limitado de la terapéutica a las células tumorales más profundas debido a las barreras fisiológicas. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos transportadores moleculares capaces de tratar las barreras biológicas es muy deseado para mejorar la eficiencia de la administración de fármacos. El propósito de este procedimiento es sintetizar los péptidos cíclicos que penetran en las células para mejorar la penetración de célula a célula.

La ventaja de este método es que la ciclación peptídica se puede lograr fácilmente a través de reacciones de sustitución con cisteínas y resina sin necesidad de catalizadores metálicos. La incorporación de enlaces cruzados aromáticos mejora la hidrofobicidad global de los péptidos en comparación con los enlaces cruzados hidrofílicos lactámicos o triazoles, mejorando así su permeabilidad. Para comenzar, ensamble el aparato manual de síntesis de péptidos en la campana extractora.

Coloque las llaves de paso de tres vías en el colector de vacío y conéctelas al nitrógeno. Asegúrese de tapar las entradas no utilizadas. Coloque una columna de polipropileno de 10 mililitros en las llaves de paso de tres vías y drene la mezcla de reacción o los disolventes de la columna de polipropileno con una bombilla de pipeta de goma o una aspiradora a través de una trampa de residuos.

Para preparar la resina para la síntesis de péptidos, agregue de 4 a 5 mililitros de DMF a la cantidad requerida de resina y transfiérala a la columna de polipropileno con un suave burbujeo de nitrógeno durante 30 minutos para hinchar la resina adecuadamente. Escurrir el DMF y añadir de 4 a 5 mililitros de 50% de morfolina/DMF a la resina. Burbujee suavemente nitrógeno durante 30 minutos para eliminar el grupo Fmoc N-terminal y luego drene la mezcla.

Lave bien la resina tres veces agregando de 4 a 5 mililitros de DMF a la columna y burbujeando con nitrógeno durante al menos 1 minuto cada vez. De la misma manera, lave la resina con diclorometano tres veces y DMF tres veces. A continuación, disuelva 648.8 miligramos de arginina protegida con Fmoc y PBF y 372.6 miligramos de HATU en 5 mililitros de DMF en un tubo de centrífuga.

Agregue 348.4 microlitros de DIPEA para activar la reacción de acoplamiento y transfiera la mezcla de reacción a la columna de polipropileno con resina. Agite suavemente la mezcla con burbujeo de nitrógeno durante 1 a 2 horas, y luego repita la reacción de acoplamiento una vez. Drene la mezcla de reacción y lave la resina secuencialmente con DMF, diclorometano y nuevamente DMF tres veces cada una durante al menos 1 minuto cada vez.

Retire el grupo protector Fmoc y lave la resina siguiendo el procedimiento mostrado anteriormente antes de proceder a acoplar el siguiente aminoácido. A continuación, acople la beta-alanina como espaciador para el etiquetado FITC utilizando el mismo proceso que se muestra para el acoplamiento de aminoácidos, y luego agregue una mezcla de FITC, DIPEA y DMF a la columna de polipropileno en la oscuridad para realizar el etiquetado FITC de péptidos en la resina. La reacción tomaría casi 8 horas.

Para realizar la ciclación del péptido lineal, agregue una mezcla de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano y diclorometano a la columna de polipropileno durante 2 minutos para eliminar selectivamente el grupo de cisteína que protege el tritilo. Drene la mezcla y repita el procedimiento hasta que la solución amarillenta se vuelva incolora para eliminar completamente el grupo protector de tritilo. Realizar lavados secuenciales de la resina con DMF y diclorometano al menos tres veces y disolver 4,4'bis-bromometil-bifenilo en DMF con DIPEA.

Agregue la solución a la columna y reaccione durante 4 horas. Lave la resina con 4 a 5 mililitros de metanol dos veces durante cinco minutos cada una, y séquela con un flujo continuo de nitrógeno. Para péptidos que contienen cisteína, trate la resina con un cóctel de escisión efectivo de ácido trifluoroacético, triisopropilsilano y agua o ácido trifluoroacético, triisopropilsilano, 1, 2-etanedithiol y agua.

Trate la resina unida a péptidos durante 2 a 3 horas para escindir el péptido, y luego retire el ácido trifluoroacético cuidadosamente con una corriente de nitrógeno. Para obtener los péptidos crudos, agregue de 4 a 5 mililitros de éter dietílico a la preparación de péptidos escindidos para precipitar los péptidos crudos y centrifugar a 10, 000 x g durante 4 minutos. Deseche cuidadosamente el sobrenadante y seque al aire el péptido durante 3 minutos en una campana extractora efectiva.

Disuelva el péptido crudo a pequeña escala en 800 microlitros de acetonitrilo y luego analícelo utilizando cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa y cromatografía líquida-espectrometría de masas. Inocular 100, 000 células HeLa en 2 mililitros de DMEM en una cámara de 12 pocillos con un inserto de placa de cultivo de tejido, e incubar durante 24 horas en una incubadora humidificada de 37 grados centígrados que contiene 5% de dióxido de carbono. Retire el medio e incube las células en las cámaras con 1 mililitro de 10 micromolares FITC-R8 o FITC-sR8-4 en DMEM libre de FBS durante 1 hora.

Después de eso, retire el medio que contiene los péptidos y lave las células tres veces con 1 mililitro de PBS. Agregue 1 mililitro de DMEM fresco libre de FBS a las cámaras, y luego incube conjuntamente las células HeLa en la cámara con el inserto de placa de cultivo de tejidos, con las células HeLa en los cubreobjetos redondos en la parte inferior durante 2 horas. Fije las células HeLa en los cubreobjetos redondos con glutaraldehído al 2,5% durante 15 minutos, y luego tiñe las células con DAPI durante 15 minutos.

Finalmente, observe las células HeLa en los cubreobjetos bajo un microscopio de fluorescencia. Aquí se presenta un diagrama esquemático de la síntesis del péptido R8 lineal marcado con FITC y el péptido R8 grapado marcado con FITC. Los espectros HPLC y MS del péptido lineal R8 y el péptido R8 grapado se muestran en esta figura.

El tiempo de retención del péptido grapado fue sustancialmente más largo que el del análogo lineal, lo que indica una hidrofobicidad general mejorada del péptido después de la ciclación con la reticulación hidrofóbica. Esta imagen gráfica representa la estabilidad del péptido lineal y el péptido grapado en presencia de 25% FBS. El R8 cíclico permanece 77.3% intacto después de la incubación con FBS durante 4 horas, mientras que su contraparte lineal se degradó en su mayoría, lo que sugiere una mayor estabilidad proteolítica del péptido R8 cíclico.

Aquí se muestran imágenes de microscopía de fluorescencia de células vivas de células HeLa y células 4T1 después de 1 hora de incubación con 3 péptidos R8 lineales marcados con FITC micromolar y péptido R8 grapado marcado con FITC. Se puede observar que las células tratadas con R8 cíclico con reticulación aromática exhibieron mayor fluorescencia intracelular que las tratadas con su contraparte lineal. Se obtuvieron resultados similares con el análisis de citometría de flujo.

Para investigar más a fondo si el R8 cíclico confiere una mayor penetración de célula a célula, se utilizaron modelos transwell para simular la permeabilidad de barrera de los péptidos de una capa celular a otra. El R8 cíclico mostró claramente una mayor penetración de transbarrera que el péptido lineal R8, como lo indica un aumento significativo en la fluorescencia intracelular. La desprotección completa del grupo tritilo de cisteína y resina es importante para el siguiente paso de ciclación.

Además, la eficiencia de ciclación también depende de las secuencias específicas y las longitudes de los péptidos debido a los efectos estéricos. En tal caso, sería útil utilizar una resina con menor capacidad de carga o ciclar los péptidos bajo concentraciones diluidas en fase de solución. Estos péptidos cíclicos mostraron una mayor permeabilidad de célula a célula en comparación con sus contrapartes lineales.

Creemos que son muy prometedores para conquistar las barreras biológicas y se utilizarán para una molécula para otras aplicaciones en el campo de la administración de fármacos.