Name: Conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Aprende a contar unidades formadoras de colonias en formato de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila. Este método automatizado ofrece una ventaja de cien veces en tiempo respecto a los métodos tradicionales.

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El Dr. Kerwyn Casey Huang, el Dr. Andrés Aranda-Díaz, Ted Cooper y miembros del laboratorio de Ludington dieron valiosos aportes sobre el desarrollo de este protocolo. El financiamiento fue proporcionado por NSF IOS grant 2032985, NIH grant DP5OD017851, una subvención de la Carnegie Institution of Canada y el Carnegie Institute for Science's Endowment.

1. Colonización de moscas
NOTA: Este método es adecuado para el análisis cuantitativo de moscas con un microbioma intestinal cultivable mediante placas de crecimiento de UFC. Un protocolo detallado para la cría de moscas gnotobióticas ha sido publicado previamente12.
<ol><li>Establecer una colonización estable por una especie bacteriana comensal.<ol><li>Preparar un cultivo bacteriano fresco, pellet por centrifugación a 400 x g durante 3 min a temperatura ambiente, y resuspender el pellet celular en PBS a un OD600 de 1.0. Para este protocolo, Lactiplantibacillus plantarum (anteriormente conocido como Lactobacillus plantarum) se cultivó durante la noche a un OD600 de 2.0.</li>
		<li>Pipetear 100 μL sobre el alimento en un vial para moscas (ver Tabla de materiales). Extienda uniformemente y deje que el líquido se absorba durante 15-30 minutos.</li>
		<li>Transfiera 20 moscas libres de gérmenes a este vial utilizando la técnica estándar de volteo de vial a vial34. Cada mosca comerá aproximadamente la misma cantidad de la dosis bacteriana35. Alternativamente, se pueden agregar huevos libres de gérmenes.</li>
		<li>Transfiera las moscas a alimentos frescos estériles diariamente durante 3 días. Haga todo esto en un gabinete de bioseguridad y use una técnica estéril (Figura 1A-1).</li>
	</ol></li>
	<li>Antes de medir la carga de UFC, transfiera las moscas a un vial que contenga agua estéril de agar durante 4 h para eliminar las bacterias transitorias del intestino. Los viales de agua de agar proporcionan una fuente de humedad para la mosca, pero no nutrientes para la mosca o las bacterias en la superficie. Se preparan en los mismos viales estériles para moscas que con los alimentos estándar, pero contienen solo agua desionizada y un 1,5% de agar.</li>
</ol>2. Homogeneización de moscas individualmente en una placa de PCR de 96 pocillos
<ol><li>Prepare los platos batidores de cuentas con anticipación.<ol><li>Vierta perlas de vidrio de 0,5 μm (consulte la Tabla de materiales) en la bandeja de medición de cuentas (impresa en 3D con la ayuda del archivo de codificación suplementario 1 S1-bead-measurer.stl). Extienda las cuentas en la bandeja para que todos los pocillos estén llenos y nivelados, y luego cepille el exceso de cuentas en un tubo cónico para recuperarlas.</li>
		<li>Coloque una placa de PCR semifalda (consulte la Tabla de materiales) boca abajo en la bandeja de medición y alinéela con los pocillos encajándola en la hendidura de la bandeja de medición. Luego, voltéelo rápidamente para transferir las cuentas.</li>
		<li>Retire el exceso de perlas de la superficie de la placa de PCR y cúbrala con papel de aluminio. Inspeccione la placa de PCR para asegurarse de que todos los pocillos contengan perlas. Use una cuchara de pesaje si es necesario para agregar cuentas a un solo pozo. Si la electricidad estática está causando que las perlas se peguen en las superficies de la placa, limpie o rocíe la parte posterior de la bandeja de medición y la placa de PCR con etanol al 70%.</li>
		<li>Cubrir con papel de aluminio. Muchas placas se pueden preparar de esta manera y luego en autoclave y almacenarse para su uso posterior. Cuando esté listo para su uso, agregue 100 μL de PBS a cada pocillo utilizando la pipeta de 96 canales (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Esterilice superficialmente las moscas colonizadas por microbios (ver paso 1) con etanol al 70% antes de la homogeneización.<ol><li>Anestesiar a las moscas con 100% CO2 durante 5 s. Transfiera las moscas anestesiadas del vial a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml utilizando un pequeño embudo (Figura 1A-2). En este estudio, se agregaron típicamente 25 moscas por tubo.</li>
		<li>Rocíe inmediatamente ~ 1 ml de etanol al 70% en el tubo, cierre el tubo y mezcle por inversión durante 10 s. Luego, aspire el etanol con una pipeta P1000, teniendo cuidado de no aspirar moscas. Repita una vez más con etanol, luego dos veces con PBS estéril (Figura 1A-3).</li>
	</ol></li>
	<li>Después del lavado final de PBS, cierre el tubo y, con la tapa hacia abajo, golpee con fuerza varias veces en el banco para que las moscas entren en la tapa.</li>
	<li>Abra el tubo y dispense moscas en los pozos usando fórceps (Figura 1A-4). Coloque una mosca en cada pocillo (Figura 1A-5). Mantenga el plato en hielo mientras carga para mantener a las moscas anestesiadas.</li>
	<li>Selle la placa con una lámina de sellado térmico de enlace térmico (consulte la Tabla de materiales).<ol><li>Primero, retire las perlas perdidas que estén cerca de los pozos, ya que pueden causar fugas en el sello de la lámina. Asegúrese de que el lado opaco de la lámina esté orientado hacia abajo en la placa y el lado brillante hacia arriba hacia el sellador térmico. Presione firmemente el termosellador (consulte la Tabla de materiales) hacia abajo durante 5 s (Figura 1A-6). Bruñir con el aplicador manual (ver Tabla de materiales) para asegurar la lámina. NOTA: Un sellado deficiente es una causa de pérdida de muestra.</li>
	</ol></li>
	<li>Asegure la placa en el agitador de placas. Homogeneizar durante 5 min (Figura 1A-7). Gire la placa de talón durante 30 s en un mini spinner de placas (consulte la Tabla de materiales) a 350 x g para eliminar el líquido de la lámina de sellado.</li>
	<li>Retire la lámina mientras sostiene la placa para no salpicar gotas de homogeneización de mosca fuera de los pozos.</li>
</ol>3. Dilución en serie del homogeneizado de mosca y manchado en placas de UFC
<ol><li>Coloque cuatro placas rectangulares de crecimiento de agar MRS (consulte la Tabla de materiales) en el gabinete de bioseguridad y retire sus tapas. En este protocolo, se utilizó agar MRS para el crecimiento de L. plantarum. Deje que estos platos se sequen durante al menos 10 minutos (20 minutos si están recién vertidos o fríos del almacenamiento). NOTA: Si las placas están húmedas, las gotas de la placa de 96 pocillos correrán juntas y arruinarán los recuentos.</li>
	<li>Prepare tres placas de dilución agregando 100 μL de PBS a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos utilizando un pipetor de 96 canales. Cargue un bastidor de puntas P20 en el pipete de 96 canales.</li>
	<li>Realizar una dilución 1:10 aspirando 11,1 μL de homogeneizado de la placa de muestra preparada en la sección 2 (Figura 1A-8). Asegúrese de dibujar desde el centro de los pozos en lugar del fondo de los pozos porque el homogeneizado de la mosca y las perlas de vidrio obstruirán las pipetas. Las cuentas se hunden y las partículas de la mosca flotan, dejando la capa media casi despejada.</li>
	<li>Dispensar los 11,1 μL en la primera placa de dilución, que ya contiene 100 μL de PBS estéril por pocillo. Mantenga la placa de dilución en el agitador de placas durante 10 s a 600 rpm. Mezclar de nuevo pipeteando hacia arriba y hacia abajo durante cinco ciclos. Transfiera 11,1 μL de la primera placa de dilución a la segunda placa de dilución y repita los pasos de mezcla para las dos placas de dilución siguientes.</li>
	<li>Realice el recubrimiento en serie de dilución como se describe a continuación.<ol><li>Recupere las placas de crecimiento del gabinete de bioseguridad.</li>
		<li>Comenzando con la placa más diluida, detectar 2 μL de cada pocillo en las placas de agar utilizando la pipeta de 96 pocillos (Figura 1A-9).<ol><li>Baje la cabeza de la pipeta lentamente sobre el plato, teniendo cuidado de no apuñalar el agar. Examine la placa cuidadosamente y asegúrese de que se hayan dispensado todas las manchas; si no es así, agregue manualmente 2 μL a la posición apropiada. Verifique que las manchas líquidas penetren rápidamente en el agar y no corran juntas.</li>
			<li>Si las manchas corren juntas, seque un nuevo juego de placas de agar fresco durante un período más largo y vuelva a hacer el manchado. Si hay varios tipos de placas (por ejemplo, diferentes medios o con antibióticos), localícelos también. Dispense cualquier solución restante de nuevo en la placa de dilución y proceda a la siguiente concentración más alta. NOTA: Al detectar diluciones, mezcle la siguiente dilución cinco veces para asegurarse de que el contenido de las puntas de la pipeta se elimine de la dilución anterior. Las placas de dilución pueden almacenarse >8 h a 4 °C sin afectar al recuento de colonias35.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Repita el proceso de recubrimiento como se describe en el paso 3.5 para las placas de dilución restantes, progresando de más diluido a más concentrado hasta la placa con el homogeneizado original.</li>
	<li>Cuando todo el líquido haya sido absorbido por el agar, invierta las placas y colóquelas en la incubadora (Figura 1A-10). Para Lactiplantibacillus y Acetobacter de Drosophila, la temperatura óptima es de 30 °C en medios MRS. Incubar hasta que las colonias hayan alcanzado el tamaño óptimo: las colonias son lo suficientemente grandes como para verlas claramente, pero no tan grandes como para fusionarse o interferir con el crecimiento de las demás (ver los resultados representativos para la cuantificación del tamaño óptimo). NOTA: Las condiciones óptimas de crecimiento dependen de la cepa y deben determinarse empíricamente. Para Lactiplantibacillus de Drosophila, el tiempo óptimo de incubación es de 26 h a 30 h en agar MRS. Para Acetobacter de Drosophila, el tiempo óptimo de incubación es de 30 h a 48 h en MRS dependiendo de la cepa.</li>
	<li>Después de la incubación, conservar las placas a 4 °C si es necesario hasta que estén listas para el recuento.</li>
</ol>4. Cuantificación de las UFC
<ol><li>Cuantifique las UFC fotografiando las placas y luego contando las colonias utilizando un software automatizado, como se detalla a continuación. Si las placas se almacenaron a 4 °C, primero déjelas alcanzar la temperatura ambiente para que no haya condensación en las placas, lo que produce deslumbramiento.</li>
	<li>Organice las placas en una secuencia lógica y manténgalas en ese orden mientras fotografía: facilita el nombre de los archivos. Oriente todas las placas de modo que A1 esté en la esquina superior izquierda de todas las placas. Se recomienda etiquetar la esquina A1 con una identificación única para garantizar que no haya confusión de las fotos. Apile cada serie de dilución en orden.</li>
	<li>Retire la tapa de la placa y coloque la placa en el escenario con A1 orientado en la esquina correcta. Se incluyen diseños para la caja de fotos de la placa (Archivo suplementario 1, Archivo complementario 2), que está optimizada para fotografiar estas placas de bandeja e incluye opciones de iluminación y filtro para obtener imágenes de colonias fluorescentes.</li>
	<li>Imagen de las placas. Utilice la cámara (consulte Tabla de materiales) con ajustes manuales para lograr un nivel de exposición constante entre placas. Se recomienda un ajuste de distancia focal larga para minimizar la distorsión de la perspectiva. Captura la foto con un obturador remoto para minimizar el desenfoque del movimiento de la cámara.</li>
	<li>Transfiera las imágenes a una computadora y cámbieles el nombre, incluido el nombre del experimento, el tipo de medio, el factor de dilución y cualquier otro detalle pertinente. Algunos sistemas operativos (consulte Tabla de materiales) tienen una útil función de cambio de nombre por lotes en el Finder haciendo clic con el botón derecho en una selección de archivos.</li>
</ol>5. Conteo automatizado de colonias usando la suite Count-On-It (Archivo Suplementario 3)
<ol><li>Recorte las imágenes utilizando el complemento Croptacular proporcionado (Archivo de codificación suplementario 2) para ImageJ. Este complemento ayuda a dividir la imagen en una matriz ordenada de subregiones (por ejemplo, 8 x 12 para una placa de 96 pocillos). Las subregiones se contabilizarán individualmente. NOTA: Un complemento separado para contar placas circulares llamado Circus se describe en el Archivo de codificación suplementaria 3 Circus_.ijm.<ol><li>Organice las imágenes que se procesarán para su cuantificación en una carpeta. Elija nombres de archivo que distingan las placas, ya que estos nombres de archivo se convierten en títulos de columna para cada conjunto de recuentos. Dentro de esta carpeta, cree subcarpetas denominadas "recortado" y "recibos".</li>
		<li>Inicie Croptacular y haga clic en Aceptar para comenzar a recortar. NOTA:Se muestran los valores predeterminados y suelen ser suficientes. Dependiendo de la resolución de la imagen, la iluminación, el tamaño del punto, etc., puede ser útil ajustar los parámetros base.</li>
		<li>Si la imagen ya está recta, simplemente presione Espacio. De lo contrario, endereza la imagen dibujando una línea a lo largo de un borde que debería volverse horizontal. Vuelva a dibujar la línea tantas veces como sea necesario si la imagen aún no aparece enderezada.</li>
		<li>A continuación, dibuje un cuadro de límite del área para la cual se debe realizar el conteo. Ajuste el tamaño y la proporción hasta que todas las manchas estén dentro de sus celdas. Arrastre el cursor fuera del cuadro de límite para actualizar la cuadrícula. Cuando la cuadrícula se vea bien, presione Espacio.</li>
		<li>Asegúrese de que la siguiente imagen gire automáticamente al mismo ángulo que la primera; El plugin asume que todas las fotos están alineadas de la misma manera. Si esto es correcto, presione Espacio para continuar. De lo contrario, endereza la imagen como antes. La cuadrícula también recuerda la misma posición que la imagen anterior; ajuste si es necesario y, a continuación, presione Espacio.</li>
	</ol></li>
	<li>Enumere las colonias en las placas utilizando el complemento Count-On-It: Gridiron proporcionado para ImageJ (Archivo de codificación suplementario 4). Las instrucciones detalladas para instalar y usar el complemento se incluyen en el Archivo complementario 3.<ol><li>Inicie Count-On-It > Gridiron. Utilice la misma configuración de cuadrícula que con Croptacular. Los usuarios pueden agrupar por lotes una carpeta completa, analizar una sola imagen o comenzar desde la imagen actual.</li>
		<li>Establezca el umbral en función de un valor de intensidad de píxeles superior e inferior. Haga que el umbral sea lo más estricto posible mientras se seleccionan todas las colonias. Idealmente, habrá algo de espacio entre las colonias seleccionadas, pero el software es capaz de segmentar las manchas hasta cierto punto. Haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo "Acción requerida" cuando el umbral sea satisfactorio.</li>
		<li>Para inspeccionar los resultados, amplíe y observe más de cerca los recuentos de colonias. Al hacer clic en cancelar, se abortará el complemento. Haga clic en Aceptar para continuar.</li>
		<li>En la primera imagen, asegúrese de que se da la opción de continuar o volver al menú de configuración, por ejemplo, para cambiar el tamaño mínimo de la colonia. Para continuar con el proceso por lotes, haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione una carpeta para mantener la tabla de recibos y resultados. Utilice la carpeta "recibos" o cree una nueva carpeta.</li>
		<li>Después de la primera imagen, las siguientes imágenes tendrán por defecto el mismo umbral que la configuración anterior. Haga clic en Aceptar para utilizar esta configuración o ajustarla. Si las fotos son coherentes y la configuración es precisa, haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo "Acción requerida". NOTA: Una vez completadas todas las imágenes del lote, la tabla de resultados se guarda automáticamente en la misma carpeta que los recibos.</li>
		<li>Revise los recibos de recuento producidos por el software y corrija manualmente cualquier error de conteo. El complemento ImageJ es estadísticamente preciso, pero se producen errores. Pruebe los recibos para examinar los valores atípicos e identificar los errores de conteo. El software guarda los datos de CFU como un archivo .csv en la misma carpeta que los recibos.</li>
	</ol></li>
	<li>Analice los datos utilizando el software preferido por el usuario.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las técnicas detalladas presentadas aquí permiten un aumento de >100 veces en el número de muestras que se pueden evaluar en un experimento de conteo de UFC. Esta técnica avanza los métodos existentes para experimentos de microbioma en Drosophila 12,35,36 mediante el uso del formato de placa de 96 pocillos para analizar moscas individuales. Además, aplica un método de recubrimiento puntual más eficiente19,31 y un flujo de trabajo automatizado con una plataforma de fotografía y conteo de colonias. La importancia de este método para Drosophila es estandarizar los experimentos al formato de placa de 96 pocillos, lo que permite el manejo simultáneo de un gran número de réplicas biológicas con automatización para lograr una cuantificación de alto rendimiento de las UFC.
La plataforma de 96 pocillos muestra que el aumento de la frecuencia de transferencia y la "limpieza" de bacterias transitorias causa una reducción significativa tanto en la abundancia media como en la variación entre muestras (Figura 1B, C), lo que demuestra la rigurosidad de este protocolo mejorado. Una limitación de la co-vivienda de moscas es la transferencia horizontal de bacterias entre moscas. Una solución propuesta es mantener las moscas individualmente en un formato de placa de 96 pocillos, como el Whole Animal Feeding Flat38.
Aunque no se observó una reducción significativa en la carga bacteriana cuando las moscas se lavaron en etanol, estas moscas solo se mantuvieron en presencia de bacterias externas durante 3 días. El alojamiento por períodos de tiempo más largos podría permitir que se acumule una mayor carga bacteriana39. Por lo tanto, todavía se recomienda el lavado en etanol.
La transferencia de moscas a la placa de 96 pocillos es el primer paso crítico para configurar el flujo de trabajo (Figura 1A). Una vez que se lavan las moscas, se distribuyen en los pozos una a la vez. Un gráfico de placas es útil en esta etapa para anotar qué condiciones están presentes en cada pozo y agregar cualquier nota como "la mosca se perdió". La homogeneización es otro paso crítico con algunas advertencias importantes. Las bacterias sobreviven al proceso de homogeneización cuando están en presencia de una mosca (Figura 1D, E), y presumiblemente, este principio también es cierto cuando las bacterias están dentro del intestino de la mosca. Sin embargo, las bacterias también mueren cuando se homogeneizan solo en placas batidoras de cuentas, lo que demuestra que la homogeneización puede matar las células bacterianas en ciertas circunstancias, una limitación que puede ser importante si uno está homogeneizando intestinos disecados, por ejemplo. En particular, la pérdida de UFC al homogeneizar depende del número de UFC en la muestra, y la pérdida es mínima cuando se utilizan ~ 105 UFC por pocillo. Se puede lograr una mayor preservación de las UFC deteniendo la homogeneización a mitad de camino y enfriando la placa en hielo.
La homogeneización se realizó durante 5 min en este protocolo basado en experimentos de control donde un número conocido de UFC se mezclaron con una mosca libre de gérmenes, y esto funcionó empíricamente para las bacterias de la mosca. Menos golpes causaron la presencia de partes de moscas más grandes, lo que interfiere con el pipeteo, mientras que los tiempos de homogeneización significativamente más largos de ~ 10 min hicieron que los recuentos de UFC fueran más variables. Se observó que el volumen más pequeño y la forma en ángulo de los pocillos de placa cónica reducen la eficiencia del batido de perlas en comparación con los tubos cilíndricos de 2 ml. Muchas variaciones en este enfoque general son posibles, incluyendo qué cepas bacterianas, qué recipiente de batido de cuentas, qué cuentas y qué genotipo de mosca se utilizan. Los casos de usuarios individuales necesitan usar controles positivos para establecer su enfoque.
El método de recubrimiento puntual se empleó de una manera específica: se detectaron diluciones 1:2 de L. plantarum WF en PBS en placas MRS y se incubaron a 30 °C durante 2 días (se pueden implementar tiempos de incubación más cortos para generar tamaños de colonia más pequeños). El método requiere cierta inversión inicial en equipos, principalmente el batidor de perlas y la pipeta de 96 canales (Figura 2A), que es necesaria tanto para la serie de dilución como para el recubrimiento puntual. Sin embargo, hay opciones menos costosas disponibles, incluido un replicador de placas de 96 pocillos con pines ranurados. La serie de dilución es un paso crítico que afecta la precisión de los resultados del conteo de UFC. En términos de modos de fallo, es posible obstruir las puntas de la pipeta con piezas de mosca o perlas de vidrio y que las puntas de la pipeta no se sellen correctamente en la pipeta o fallen por alguna otra razón. Todos estos problemas resultan en un recuento insuficiente de los pozos afectados y deben ser monitoreados. La mezcla adecuada en cada paso de la serie de dilución también es crucial. Cada dilución debe mezclarse bien, ya sea colocando la placa en un agitador de placas o pipeteando hacia arriba y hacia abajo 15-20 veces, lo que también sirve para enjuagar las puntas. Al manchar desde la placa más diluida hasta la menos diluida, las puntas se pueden reutilizar para toda la serie de dilución. Con diluciones 1:2, el conteo es preciso en un rango de 2-25 colonias, que abarca un orden de magnitud (Figura 2C). Por lo tanto, las diluciones 1:10 ahorran tiempo y materiales. Otra variable que se puede aprovechar es el tiempo de incubación, que se puede ajustar para producir colonias más pequeñas y, así, aumentar el rango de manchas contables al evitar la fusión de colonias adyacentes.
Una foto de calidad de la placa es esencial, ya que se convierte en la fuente de datos sin procesar a partir de los cuales se analizan las UFC y se pueden archivar indefinidamente. El FluoroBox está diseñado para producir fotos de las placas con una intensidad de luz uniforme, lo que minimiza el deslumbramiento en la superficie del agar. Además, el diseño es capaz de fotografiar selectivamente colonias fluorescentes utilizando luces LED de un solo color y filtros fotográficos de colores (Figura 3A). La construcción de una configuración como el FluoroBox, con iluminación controlada y ajustes de cámara, puede aumentar en gran medida la reproducibilidad de las imágenes CFU, lo cual es importante para el análisis automatizado. Las morfologías de las colonias, la intensidad de la fluorescencia y los efectos del tiempo o la densidad en el crecimiento de las colonias son solo algunas de las propiedades que se pueden analizar utilizando las fotografías. La caja de fotos se puede construir sin los filtros de color y las luces de un solo color si no se utilizan bacterias fluorescentes, lo que reduce el costo y la complejidad. Diferentes luces de excitación y filtros de emisión podrían ser sustituidos por los recomendados aquí si un laboratorio utiliza un fluoróforo diferente. Una cámara que está conectada a una tableta a través de WiFi usando una aplicación es útil tanto para la función de obturador automático para evitar temblores como para facilitar la transferencia de datos. Las imágenes se pueden transferir a la tableta y luego a una computadora portátil utilizando un software de transferencia inalámbrica de archivos. Las cámaras recomendadas con estas capacidades se indican en la Tabla de materiales.
Count-On-It es un plug-in escrito en ImageJ. El software automatizado de conteo de CFU segmenta la imagen de la placa en una cuadrícula uniforme de 96 pocillos, cuenta las colonias en cada celda de la cuadrícula y agrupa los resultados en una hoja de cálculo simple. Como siempre hay variación en la posición de la cuadrícula puntual en la placa y en la foto, el usuario debe ajustar manualmente la cuadrícula a la foto utilizando el complemento Croptacular. Esto también ayuda a excluir áreas cerca del borde de la placa, que tienen resplandor. Establecer el umbral es clave para obtener el recuento de UFC más preciso de la imagen. Si el umbral se establece demasiado alto, las colonias se fusionarán; Si el umbral se establece demasiado bajo, las colonias serán excluidas. Una vez establecido el umbral, la macro aplica el desenfoque gaussiano para suavizar los bordes y reducir el aliasing, el filtro de cuenca divide las colonias superpuestas y las manchas se cuentan mediante partículas de análisis. 
A veces, la densidad de colonias es demasiado alta en un lugar en particular. Count-On-It proporciona una manera de lidiar con esto. Para estimar el número de colonias en una celda de cuadrícula con colonias parcialmente fusionadas, primero el área promedio de una mancha circular de toda la placa se toma como C promedio. Luego, el área de la mancha A 1 se divide por el área promedio de una mancha circular A1/Cpromedio. Este número se redondea al entero más cercano, y esa es la estimación de cuántas colonias hay en una mancha. Esta función es una de las razones por las que el umbral puede influir en los resultados del recuento: el área de colonia promedio relativa frente a un área de blob combinada será diferente dependiendo de cómo el umbral afectó a los blobs combinados.
Los métodos presentados tienen varias limitaciones. Estos incluyen la necesidad de equipos para dispensar medios líquidos con precisión desde placas de 96 pocillos. Este equipo, ya sea una pipeta de 96 canales o una herramienta de pin replicador ranurado, puede costar miles de dólares para obtener. Existen alternativas más baratas, pero son menos precisas. El conteo automatizado a través de Count-On-It también presenta algunas limitaciones. Por ejemplo, si dos tipos de colonias en una población mixta se delimitaran basándose únicamente en el tamaño, el recuento de manchas no podría asignar colonias al tipo correcto. En este caso, las manchas con manchas tendrían que eliminarse de los recuentos. Una mayor diferenciación de colonias basada en la morfología sería una extensión valiosa del método que no se implementa actualmente. El uso de medios selectivos que incluyen nutrientes específicos de la cepa y antibióticos simplifica la necesidad de un análisis de imágenes complejo.
El mantenimiento de experimentos con moscas de la fruta en placas de 96 pocillos multiplica el número de muestras y condiciones que se pueden probar en un solo experimento y puede facilitar las pantallas de alto rendimiento en fenotipos de asociación Drosophila-bacteria. Prevemos que este método se puede extender mediante el uso de medios selectivos para diferenciar muchas cepas bacterianas en mezclas complejas. El método no se limita al estudio del microbioma de la mosca. La cuantificación de UFC es común en muchas aplicaciones de la microbiología, desde los recuentos de coliformes en el agua potable hasta la identificación de patógenos. El sistema de recubrimiento CFU presentado aquí permite pantallas de alto rendimiento, así como la adquisición, procesamiento, almacenamiento y entrega automatizados de resultados.

La relación entre la microbiota intestinal y su huésped animal está cada vez más a la vanguardia de los estudios biológicos1, que muestran que la composición de la cepa del microbioma es importante para la fisiología del huésped 2,3,4. El ritmo de descubrimiento ha sido limitado por factores de confusión como la alta variación interindividual natural y la alta diversidad de bacterias colonizadoras 5,6,7. La mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, se ha convertido en un modelo prometedor debido a su microbioma naturalmente de baja diversidad, facilidad de manejo y robusta genética del huésped 8,9,10,11. Las moscas pueden liberarse de gérmenes y volver a asociarse con una microbiota definida12, y se ha demostrado que la flora influye en los rasgos fisiológicos de las moscas13,14. La flora innata consiste en un conjunto limitado de bacterias que son todas cultivables, y los parientes cercanos de estos también son endógenos al intestino de los mamíferos, incluidos los lactobacilos, las proteobacterias y los enterococos15.
El estudio de la influencia del microbioma en los rasgos del huésped requiere la cuantificación del microbioma en términos de qué especies están presentes y sus abundancias absolutas16. Las formas predominantes de analizar el microbioma de la mosca son los recuentos17 de unidades formadoras de colonias (UFC), la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA9 y la qPCR del gen 16S rRNA18. Los recuentos de UFC se pueden obtener sin reactivos costosos, y confirman la viabilidad de las células bacterianas19. Las técnicas 16S, incluida la qPCR, tienen ventajas en que las identidades taxonómicas de los microbios pueden determinarse sin tener en cuenta sus requisitos de crecimiento o morfologías de colonias20.
En el caso de que los experimentos utilicen moscas con un microbioma definido de bacterias conocidas (moscas gnotobióticas), los recuentos de UFC tienen ventajas particulares sobre la secuenciación21. La secuenciación es costosa, ya que requiere extracción de ADN, preparación de bibliotecas basada en PCR y secuenciación de alto rendimiento para obtener abundancias relativas22. Debido al alto costo, los métodos de secuenciación de alto rendimiento generalmente deben realizarse a granel para reducir el precio por muestra23. Se requieren métodos adicionales como la qPCR para obtener abundancias absolutas16. En contraste, los recuentos de UFC son rápidos y baratos y dan el número absoluto de células viables. Drosophila8 y otros modelos de microbiomas pequeños 24, incluyendo el gusano, Caenorhabditis elegans 25,26, y el pez cebra larval, Danio rerio, cultivado gnotabióticamente 27, tienen una gama limitada de bacterias, que tienen características de crecimiento conocidas 28. En estos casos, particularmente con animales gnotobióticos, el conteo de UFC puede diferenciar todas las especies de bacterias dentro de las comunidades intestinales multiespecies21,27,29. Los métodos de conteo de UFC de mayor rendimiento mejorarían aún más la rentabilidad y la velocidad de medición de la composición del microbioma y podrían aplicarse a muchos otros experimentos de microbiología.
El recuento de UFC mediante el recubrimiento de dilución en serie de una suspensión bacteriana en medios de crecimiento a base de agar es un método estándar en todo el campo de la microbiología. Las colonias que crecen en las placas se cuentan manualmente. Las diluciones permiten al investigador seleccionar una densidad de colonias que sea contable (por ejemplo, ~ 100 UFC por placa), lo que significa que las colonias no están creciendo entre sí y se pueden contar en un período de tiempo razonable. La mayoría de los microbiólogos utilizan esencialmente el mismo método de conteo de UFC desarrollado hace 140 años en el laboratorio de Robert Koch, y para muchas aplicaciones, este método sigue siendo adecuado. Sin embargo, surge un problema cuando se busca cuantificar un gran número de muestras. Una sola muestra puede requerir el recubrimiento de 1 a 10 diluciones seriadas de la muestra para obtener UFC contables, por lo que los experimentos que involucran más de unas pocas docenas de muestras se vuelven agotadores. Se han desarrollado varios métodos para aumentar la eficiencia del enumeramiento de UFC. El recubrimiento en espiral automatizado elimina la necesidad de diluciones en serie30, lo que hace que solo se necesite una placa para el conteo de UFC, pero aumenta el tiempo para platear la muestra. El manchado de dilución en serie de placa única (SP-SDS) permite estimaciones de UFC a partir de menos placas por muestra31. Estos métodos son una mejora en el método tradicional de recubrimiento extendido, pero aún requieren el manejo y el recubrimiento de muestras bacterianas individualmente y, por lo tanto, no son ideales para un alto rendimiento. El manejo de muestras en placas de 96 pocillos y el recubrimiento puntual de esas 96 muestras en placas rectangulares de agar mejora en gran medida el rendimiento de las muestras19.
Los microbiomas se componen típicamente de múltiples cepas y especies. Mientras que las especies a menudo se pueden distinguir por la morfología de la colonia o los medios de crecimiento, la fluorescencia se puede emplear para distinguir aún más los diferentes tipos de bacterias y sus rasgos de crecimiento32. Por ejemplo, diferentes genotipos de la misma especie pueden ser marcados con diferentes proteínas fluorescentes codificadas genéticamente. Los métodos de imagen en placa que incorporan fluorescencia permiten a los investigadores aprovechar estas técnicas genéticas en ensayos basados en UFC32. La incorporación de fluorescencia en los métodos de conteo de UFC de alto rendimiento mejoraría aún más su utilidad.
Contar las UFC manualmente se vuelve engorroso cuando hay una gran cantidad de muestras. El conteo automatizado de UFC se puede realizar fotografiando la placa y procesando la imagen utilizando un software especializado33. Sieuwerts et al. combinaron la eficiencia mejorada del recubrimiento puntual con el conteo automatizado de colonias utilizando fotografía digital convencional y el software ImageJ19.
Un método de alto rendimiento para detectar los fenotipos de microbios específicos y asociaciones de huéspedes ayudaría a los estudios de la asamblea de la comunidad del microbioma y el impacto en la salud y el estado físico del huésped. Para los estudios del microbioma de Drosophila , una plataforma de microbiología de alto rendimiento incorporaría el manejo de muestras de moscas en formato de placa de 96 pocillos, lisis de mosca sin lisis bacteriana, la eficiencia del recubrimiento puntual, la capacidad de usar fluorescencia y distinguir múltiples fluoróforos, un entorno de luz controlado para imágenes reproducibles de placas de UFC y un software confiable de conteo automatizado de colonias. Este artículo describe un método optimizado para el ensayo de UFC en moscas gnotobióticas, que es simple, rápido y automatizado. Este protocolo describe un flujo de trabajo novedoso que combina lo mejor de los métodos publicados anteriormente y optimizado para explorar el microbioma intestinal en Drosophila.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Batido de perlas y recubrimiento por puntos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viales para moscas</td><td>Genesee</td><td>32-121</td><td>esterilizable en autoclave</td></tr><tr><td>Tapones para viales Fly</td><td>Genesee</td><td>59-201</td><td>esterilizable en autoclave</td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>3M PA1</td><td></td></tr><tr><td>Termosellador</td><td>Eppendorf</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater 96</td><td>BioSpec</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater Glass Mill Beads, 0,5 mm</td><td>BioSpec&nbsp;</td><td></td><td></td>11079105</tr><tr><td>MPS 1000 Mini PCR Plate Spinner</td><td>Labnet</td><td>LI-CF-P1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin BenchSmart 96 pipeta semiautomática</td><td>Mettler Toledo</td><td>30296705</td><td>Opciones menos costosas disponibles, incluida la herramienta de pasador ranurado de 96 pocillos de VP</td></tr><tr><td>Scientific TempPlate Placa de PCR de 96 pocillos semifaldón, faldón recto, natural</td><td>Scientific USA</td><td>1402-9220</td><td>Debe ser de polipropileno para el sellador térmico</td></tr><tr><td>Lámina de sellado térmico de unión térmica</td><td>4titude</td><td>4ti-0591</td><td>Mantener placa de bandeja estéril</td></tr>, <tr><td>128 x 85 mm, poliestireno, estéril</td><td>SPL Life Sciences</td><td>31001</td><td>Para hacer placas de agar</td></tr> <tr><td>rectangularesPhotobox construction</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&frac14; "-20 X y frac12; &rdquo; Tornillos (x2)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07BP1WR3H</td><td>Para fijar el soporte de la cámara. La marca no es importante. Cualquier perno de 1/4"-20 1/2" funciona.</td></tr><tr><td>y frac14; "-20 x &frac12; &rdquo; Tuerca del conector&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>UPC: 799862376780</td><td>también conocido como tuerca ciega o perno de conector. Esto es para fijar las bandas elásticas en el soporte de la placa. La marca no es importante.</td></tr><tr><td>y frac14; "-20 x y frac34; &rdquo; tornillos (X3)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B003QZSZY4</td><td>Para el soporte de placas. La marca no es importante.</td></tr><tr><td>1/8" x y frac12; &rdquo; lavadora</td><td>Amazon</td><td>UPC: 611982484599</td><td>Arandela para las tuercas ciegas en el exterior de la caja. La marca no es importante. Rocía la pintura negra antes de pegar para mezclarla con el acrílico.</td></tr><tr><td><Alambre > calibre 18 fuerte< / fuerte> - Cable de alimentación de dos conductores - Cable de alimentación <fuerte>18 AWG &ndash; 10 pies< / fuerte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>WP18-2</td><td></td></tr><tr><td>22-10 AWG Tuerca de cable rojo - WN-R2210 &ndash; <fuerte>Cantidad 4</fuerte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>WN-R2210</td><td></td></tr><tr><td>22-18 AWG 3/16 pulgadas Conector Hembra Push On - 22-18 AWG &ndash; <fuerte>Cantidad 3</fuerte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SCFP-2218</td><td></td></tr><tr><td>Conector de puente con abrazadera sin soldadura de 4" - Tiras de luces LED de un solo color de 8 mm - <fuerte>Cantidad 3</fuerte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-2</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador flexible de abrazadera sin soldadura de 4" - Tiras de luces LED de un solo color de 8 mm &ndash; <fuerte>Cantidad 3</fuerte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de cajón de 6"</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07Z331P99</td><td>Cualquier tirador de cajón debería funcionar.</td></tr><tr><td>6" Guías de cajones</td><td>Btibpse</td><td>UPC: 712243424979</td><td>Recorte los topes de goma de cierre suave en los deslizadores de los cajones.</td></tr><tr><td>8-32 x y frac12; &rdquo; Tuercas ciegas (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B00HYLZB98</td><td>Coloca los pernos deslizantes del cajón en el exterior de la caja. La marca no es importante. El nailon no dañará el acrílico. Rocía la pintura negra antes de pegar para mezclarla con el acrílico.</td></tr><tr><td>8-32 x y frac12; &rdquo; Tornillos de nailon (x4)</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B07KX9T7NF</td><td>Para fijar las guías de los cajones. La marca no es importante. Cualquier perno o tornillo de metal que cumpla con las especificaciones funciona. El nailon no dañará el acrílico y te permitirá cortar el perno al ras de la tuerca. Rocía la pintura negra antes de pegar para mezclarla con el acrílico.</td></tr><tr><td>Pegamento Acrílico</td><td>SCIGRIP Ean</td><td>: 7844908489337</td><td>SCIGRIP Weld-On #4 Adhesivo, Pinta y Botella Aplicadora Soldada con Bridas Negras de Aguja</td></tr><tr><td>- Paquete de 10 - 4 Pulgadas de Largo&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CT-B04-10</td><td></td></tr><tr><td>Soporte en L para cámara</td><td>WLPREOE, Vikerer, ASIN sin marca</td><td>: B09X46YKQZ</td><td>El soporte debe estar "invertido" de su configuración prevista para que la cámara quede en el "exterior" de la L. Algunos soportes vienen en dos piezas y permiten esta configuración alternativa, otros no, necesitará uno que se pueda voltear. También debe tener orificios de 1/4" para la fijación. WLPREOE, Vikerer, Sin marca. Número de identificación de serie de Amazon dado como ejemplo.</td></tr><tr><td>Cámara de la serie Canon T para opción de anclaje O</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.</td><td>1894C002</td><td>Las cámaras de la serie Canon Ti son una buena opción y se pueden conectar a un ordenador. Úselo con el lente del kit estándar de 18-55 mm. Se recomiendan las opciones de uso desde la Canon T5 hasta la T7 (modelo actual).</td></tr><tr><td>Tira de luz LED de un solo color de longitud personalizada - Cinta de luz de la serie Eco - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Azul - 2 metros</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BBLU-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Tira de luz LED de un solo color de longitud personalizada - Serie Eco Cinta de luz - 24V - IP20 - 250 lm/ft - Verde y 2 metros</td><td></td><td>Superbrightleds.com STN-BGRE-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>Tira de luz LED de un solo color de longitud personalizada - Cinta de luz de la serie Eco - 24V - IP20 - 250 lm / ft - Blanco natural 4000K &ndash; 2 metros&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>Taladro STN-A40K80-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>con &frac14; ", 1/8" brocas</td><td>Black & Decker</td><td>&lrm; BDCDD12PK</td><td>La marca no es importante.</td></tr><tr><td>Pintura en aerosol negra mate,&nbsp; 2X Ultra-Matte</td><td>Rustoleum</td><td>331182</td><td>Pinta el interior de todo lo FLAT black. La marca no es importante.</td></tr><tr><td>Paredes acrílicas cortadas con láser</td> Sierra <td>azul grande</td><td>www.bigbluesaw.com</td><td>Utilice el PDF adjunto, elimine todos los recortes en la pieza superior excepto el orificio deseado para la cámara&nbsp;</td></tr><tr><td>Fuente de alimentación conmutada LED Mean Well - Serie LPV Fuente de alimentación LED de salida única de 20-100 W - 24 V CC - 20 vatios &nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>LPV-20-24</td><td></td></tr><tr><td>Panasonic ZS100 para conexión wifi a un teléfono, tableta u ordenador</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon, etc.</td><td>Las cámaras Panasonic DMC-ZS100K</td><td>se pueden conectar de forma inalámbrica a un ordenador para la transferencia de datos y las opciones de obturador remoto. Las opciones usadas son buenas.</td></tr><tr><td>Placa de liberación rápida</td><td>Neewer Placa de liberación rápida de aluminio de 50 mm Abrazadera QR de 3/8 de pulgada con ASIN de 1/4 de pulgada</td><td>: B07417F21D</td><td>Agregue esto al soporte para que la cámara se pueda quitar fácilmente para cambiar los filtros de color. Número de identificación de serie de Amazon dado como ejemplo.</td></tr><tr><td>Bandas elásticas, tamaños variados</td><td>BAZIC Products</td><td>Alliance Rubber 26649</td><td>Las bandas elásticas van en el soporte de la placa. La marca no es importante.</td></tr><tr><td>Bases de montaje de bridas de cable atornilladas/adhesivas - base de 3/4 de pulgada <fuerte>Cantidad 4</fuerte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>CTMB-20</td><td></td></tr><tr><td>SPST Interruptor basculante redondo - Sin LED &ndash; <fuerte>Cantidad 3</fuerte></td><td>Superbrightleds.com</td><td>Filtro RRS-SP</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 29 (Rojo) 72 mm&nbsp;</td><td>Tiffen</td><td>72R29</td><td></td></tr><tr><td>Filtro Tiffen 58 (Verde) 72 mm</td><td>Tiffen</td><td>7258</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>https://imagej.net/downloads</td><td>N/A</td><td>Gratis. Sólo citar: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., &hellip; Cardona, A. (2012). Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas. Métodos de la Naturaleza, 9(7), 676-682. doi:10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>MacOSX</td><td>Apple</td><td>N/A</td><td>Tiene una útil función de cambio de nombre por lotes en Finder para cambiar el nombre de un grupo de fotos para facilitar la organización y el análisis en Count-on-it.</td></tr><tr><td>Unix</td><td>BSD</td><td>N/A</td><td>de 64 bits</td></tr><tr><td>Windows</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>de 64 bits</td></tr></tbody></table>

conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma de drosophila

Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome

Los intestinos de los animales son colonizados por microbios comensales, que afectan el desarrollo, la salud y el comportamiento del huésped. La cuantificación precisa de la colonización es esencial para estudiar las complejas interacciones entre el huésped y el microbio, tanto para validar la composición microbiana como para estudiar sus efectos. Drosophila melanogaster, que tiene una baja diversidad microbiana nativa y es económica de criar con una composición microbiana definida, se ha convertido en un organismo modelo para estudiar el microbioma intestinal. El análisis del microbioma de un organismo individual requiere la identificación de qué especies microbianas están presentes y la cuantificación de su abundancia absoluta. Este artículo presenta un método para el análisis de un gran número de microbiomas de moscas individuales. Las moscas se preparan en placas de 96 pocillos, lo que permite el manejo de una gran cantidad de muestras a la vez. La abundancia microbiana se cuantifica colocando hasta 96 homogeneizados de mosca entera en una sola placa de agar en una serie de puntos y luego contando las unidades formadoras de colonias (UFC) que crecen en cada lugar. Este sistema de recubrimiento se combina con una plataforma automatizada de cuantificación de UFC, que incorpora fotografía de las placas, diferenciación de colonias fluorescentes y conteo automatizado de las colonias utilizando un complemento ImageJ. Las ventajas son que (i) este método es lo suficientemente sensible como para detectar diferencias entre los tratamientos, (ii) el método de recubrimiento puntual es tan preciso como los métodos tradicionales de recubrimiento, y (iii) el proceso de conteo automatizado es preciso y más rápido que el conteo manual. El flujo de trabajo presentado aquí permite la cuantificación de alto rendimiento de UFC en un gran número de réplicas y se puede aplicar a otros sistemas de estudio de microbiología, incluidos modelos in vitro y otros modelos de animales pequeños.

Este método cuantifica la abundancia microbiana utilizando un formato de placa de 96 pocillos para unidades formadoras de colonias de placas (UFC) y se aplica al microbioma de Drosophila en muestras de homogeneización de mosca entera. Las CFU se cuentan con un software automatizado de análisis de imágenes que se proporciona aquí.

Conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila

The intestines of animals are colonized by commensal microbes, which impact host development, health, and behavior. Precise quantification of colonization ...

El conteo de unidades formadoras de colonias, o UFC, es una técnica estándar en microbiología, pero es lenta y requiere muchas placas de agar. Nuestra técnica proporciona una ventaja de cien veces sobre los métodos tradicionales de conteo de UFC en ambas placas de agar de tiempo. Hemos aplicado la metodología para medir el microbioma intestinal de modelos de animales pequeños, particularmente moscas de la fruta.Este protocolo es una forma simple, rápida y automatizada de cuantificar las UFC en moscas gnotobióticas. Este protocolo proporciona un flujo de trabajo con instrumentación fabricada por bricolaje para fotografiar las CFU y software personalizado para automatizar su conteo. Este protocolo podría usarse en cualquier experimento de microbiología donde los métodos más eficientes de recubrimiento y conteo de UFC podrían ser útiles.Manejar las moscas de manera eficiente y detectar las placas requiere destreza manual, por lo que esto debe practicarse. El uso del software de conteo automatizado requiere un juicio sobre el umbral, por lo que los recibos deben compararse con los recuentos manuales para identificar los mejores parámetros para su experimento. Para comenzar, vierta perlas de vidrio de 0,5 micras en la bandeja de medición de cuentas.Extienda las cuentas en la bandeja para que todos los pozos estén llenos y nivelados. Luego, cepille el exceso de cuentas en un tubo cónico. Ahora, coloque una placa de PCR semifalda boca abajo en la bandeja de medición y alinéela con los pocillos encajándola en la hendidura de la bandeja de medición.Luego, voltéelo rápidamente para transferir las cuentas. Retire el exceso de perlas de la superficie de la placa de PCR. Asegúrese de que todos los pozos contengan cuentas.Si es necesario, use una cuchara de pesaje para agregar cuentas a un solo pozo. Luego, cubra la placa con papel de aluminio y autoclave. Antes de usar la placa, agregue 100 microlitros de PBS a cada pocillo inmediatamente antes de agregar las moscas usando el pipeter de 96 canales.Para esterilizar la superficie de las moscas anestesiadas, transfiera las moscas del vial a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros utilizando un pequeño embudo. Rocíe inmediatamente un mililitro de etanol al 70% en el tubo, cierre el tubo y mezcle por inversión durante 10 segundos. Luego, aspire el etanol con una pipeta P-1000 evitando aspirar moscas.Después del lavado final de PBS, cierre el tubo y golpee con fuerza en el banco varias veces con la tapa hacia abajo para que las moscas entren en la tapa. Después de abrir el tubo, dispense moscas en los pozos usando fórceps y coloque una mosca en cada pozo. Mantenga las moscas anestesiadas manteniendo el plato en hielo mientras se carga.Retire las perlas perdidas cerca de los pozos, ya que pueden romper el sello de la lámina y causar fugas. Asegúrese de que el lado opaco de la lámina de sellado esté orientado hacia abajo en la placa y el lado brillante mire hacia el sellador térmico. Presione firmemente el sellador térmico durante cinco segundos y bruñir con el aplicador manual para asegurar la lámina.Homogeneizar las moscas durante cinco minutos. Asegúrese de que las moscas estén completamente homogeneizadas y que la solución se vuelva coloreada. Para eliminar el líquido de la lámina de sellado, gire hacia abajo la placa de talón durante 30 segundos en un mini spinner de placas a 350 G.Retire la lámina mientras sostiene la placa para evitar salpicaduras de gotas de homogeneizado de mosca.Coloque tres placas rectangulares de cultivo de agar MRS con sus tapas abiertas en el gabinete de bioseguridad para que se sequen durante al menos 10 minutos. Prepare dos placas de dilución agregando 100 microlitros de PBS a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos usando un pipeter de 96 canales. Cargue un bastidor de puntas P-20 en el pipeter de 96 canales.Haga una dilución 1:10 aspirando 11.1 microlitros de homogeneizado de la placa de muestra. Ahora, dispense en la primera placa de dilución que contiene 100 microlitros de PBS estéril por pozo. Mantenga la placa de dilución en el agitador de placas durante 10 segundos a 600 RPM.Mezclar de nuevo pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. Transfiera 11,1 microlitros de la primera placa de dilución a la segunda placa de dilución y repita los pasos de mezcla para cualquier dilución adicional. Para las placas de manchado, cargue dos microlitros de cada pocillo en el pipeter de 96 canales.Baje la cabeza del pipeter lentamente sobre el plato, evitando apuñalar el agar, y asegúrese de que se hayan dispensado todas las manchas. Luego, verifique que las manchas líquidas penetren rápidamente en el agar y no corran juntas. Repita el proceso de recubrimiento para las placas de dilución restantes como se describe en el manuscrito.Una vez que el líquido haya sido completamente absorbido por el agar, invertir las placas e incubarlas hasta que las colonias hayan alcanzado el tamaño óptimo. Organiza las placas lógicamente y mantenlas en un orden específico mientras fotografías. Orientarlos de modo que A1 esté en la esquina superior izquierda para todas las placas.Después de quitar la tapa de la placa, coloque la placa en el escenario con A1 orientado en la esquina correcta. Imagen de las placas. Transfiera las imágenes a un equipo y cámbieles el nombre, incluido el nombre del experimento, el tipo de medio, el factor de dilución y otros detalles pertinentes.Organice las imágenes que se procesarán para su cuantificación en una carpeta. Los nombres de archivo que distinguen las placas se convierten en títulos de columna para cada conjunto de recuentos en la hoja de cálculo de salida. Cree las subcarpetas denominadas Recortado y Recibos en la carpeta.Estas carpetas recibirán los archivos de salida. Ahora inicie el complemento Croptacular desde ImageJ y haga clic en Aceptar para comenzar a recortar. Aparecerá un cuadro de diálogo para elegir la carpeta de origen.Haga clic en Aceptar. Seleccione la carpeta de origen y haga clic en Abrir. A continuación, haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo para elegir el directorio de destino. Seleccione la carpeta de destino y pulse Abrir.Si la imagen ya está recta, simplemente presione Espacio. De lo contrario, endereza la imagen dibujando una línea a lo largo de un borde que debería volverse horizontal. Vuelva a dibujar la línea tantas veces como sea necesario si la imagen no aparece recta.A continuación, dibuje un cuadro límite para el área de conteo y ajuste su tamaño y proporción hasta que todos los puntos estén dentro de sus celdas. Arrastre el cursor fuera del cuadro de límite para actualizar la cuadrícula. Cuando la cuadrícula se vea bien, presione Espacio.Dado que el complemento asume que todas las fotos están alineadas de manera idéntica, asegúrese de que la siguiente imagen gire automáticamente al mismo ángulo que la primera. Si esto es correcto, presione Espacio para continuar. De lo contrario, endereza la imagen como antes.La cuadrícula también recuerda la misma posición que la imagen anterior. Ajuste si es necesario y pulse Espacio. Inicie Count-On-It y seleccione Gridiron.Establezca la intensidad de la colonia umbral en función de un valor de intensidad de píxeles superior e inferior. Haga que el umbral sea lo más estricto posible, mientras se seleccionan todas las colonias. Haga clic en Aceptar en el cuadro de diálogo Acción requerida cuando el umbral sea satisfactorio y, a continuación, haga clic en Aceptar para continuar.En la primera imagen, se da la opción de continuar o volver al menú de configuración. Para continuar con el proceso por lotes, haga clic en Aceptar. A continuación, seleccione una carpeta para mantener la tabla de recibos y resultados. Utilice la carpeta Recibos creada anteriormente.Después de la primera imagen, las siguientes imágenes tendrán de forma predeterminada el mismo umbral que la configuración anterior. Haga clic en Aceptar para utilizar esta configuración o ajustarla. Revise los recibos de recuento producidos por el software y corrija manualmente cualquier error de conteo.El complemento ImageJ es estadísticamente preciso, pero se producen errores. Pruebe los recibos para examinar los valores atípicos e identificar los errores de conteo. El software guarda los datos de CFU como un archivo CSV en la misma carpeta que los recibos.Para las moscas colonizadas con Lactobacillus plantarum, hubo una disminución significativa en las bacterias para las moscas que se transfirieron diariamente a alimentos estériles, se transfirieron diariamente, se mantuvieron en alimentos estériles cuatro horas antes del análisis, o se transfirieron diariamente y se mantuvieron en agar estéril cuatro horas antes del análisis en comparación con las moscas que nunca se transfirieron a alimentos estériles después de la inoculación. Se observaron resultados similares en moscas alimentadas con Acetobacter indonesiensis, donde las moscas transferidas, posttransferidas y eliminadas mostraron una reducción significativa en las UFC, pero el lavado no tuvo un efecto medible, lo que sugiere que la reducción de las UFC se debió a la eliminación de bacterias del intestino en lugar de la cutícula. El recuento de UFC en puntos con 2 a 25 colonias por punto no mostró diferencias en comparación con el método tradicional.Las manchas con un promedio de 35 colonias mostraron UFC más bajas que las placas de propagación de control. Esta reducción podría deberse a que las colonias se superponen en lugares densos. En las fotos de la placa, la intensidad de la colonia fue un 300% mayor que el fondo.Las colonias positivas para mCherry de Lactobacillus plantarum mostraron una intensidad roja 1.000% mayor que las colonias mCherry-negativas. Las colonias positivas para GFP de Acetobacter indonesiensis mostraron una intensidad verde 200% mayor que las colonias negativas para GFP. El complemento Count-On-It para ImageJ automatiza el conteo de CFU a partir de las fotos de la placa.Las colonias se detectan con precisión, con recuentos comparables al conteo manual. Los recibos de recuento se pueden usar para identificar conteos erróneos. El cambio de umbrales de tamaño y longitudes de onda de fluorescencia permite contar diferentes morfologías de colonias por separado.Es esencial asegurarse de que la placa esté bien sellada antes de que se cuenten las cuentas. También es importante diseñar controles positivos para calibrar sus mediciones. También utilizamos esta técnica para estudiar poblaciones in vitro de bacterias en placas de 96 pocillos, lo que nos permite estudiar comunidades mixtas de bacterias.Esta técnica permite enfoques de detección de alto rendimiento para medir la colonización intestinal, así como la variación biológica en la colonización.

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Investigación

JoVE Journal

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Biología

Para comprender un enlace entre la respuesta inmunitaria y el comportamiento, se describe un método para medir el comportamiento locomotor...

Medición cuantitativa de la respuesta inmune y del sueño en<em&gt; Drosophila</em

La microbiota de Drosophila influye en el desarrollo, la inmunidad y la fisiología del animal. Este video describe un método para cuantificar las bacterias de las moscas mediante la determinación de las unidades formadoras de colonias a partir de preparaciones de cuerpo entero. El protocolo presentado muestra la técnica con moscas, criadas en condiciones gnotobióticas utilizando cuatro especies bacterianas.

Conteo de Unidades Formadoras de Colonias (UFC): Cuantificación de Bacterias a partir de Cuerpos de Moscas

Fuente: Dodge, R., et al. Conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila . J. Vis. Exp. (2023)Este video demuestra la cuantificación de las unidades formadoras de colonias (UFC) de bacterias asociadas al intestino en moscas Drosophila utilizando un enfoque de dilución y siembra en serie. Las muestras de moscas homogeneizadas que contienen bacterias intestinales se diluyen en serie, se siembran en agar y se incuban para...

Cuantificación de unidades formadoras de colonias de bacterias asociadas al intestino en moscas Drosophila

En este video, demostramos una técnica para medir la carga bacteriana de E. coli después de inyectar E. coli en el tórax de Drosophila melanogaster.

Medición de la carga bacteriana de E. coli en Drosophila melanogaster después de una infección por E. coli

Drosophila melanogaster es un organismo modelo excepcional para estudiar el sistema inmune innato y las consecuencias fisiológicas de la infección y la enfermedad. Este protocolo describe cómo administrar infecciones bacterianas robustas y cuantitativamente repetibles a D. melanogaster, y cómo medir posteriormente la gravedad de la infección y cuantificar la respuesta inmunitaria del huésped.

La infección bacteriana sistémica y Defensa Inmune fenotipos en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Se presenta un método para la cría de Drosophila melanogaster en condiciones axénicas y gnotobióticos. Volar embriones se dechorionated en hipoclorito de sodio, de manera aséptica a la dieta estéril, y se ha criado en contenedores cerrados. La inoculación de la dieta y los embriones con bacterias conduce a asociaciones gnotobióticos, y la presencia bacteriana se confirmó mediante siembra de todo el cuerpo homogeneizados de Drosophila.

La cría de la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Bajo axénicos y Condiciones gnotobióticos

Los fenotipos de crecimiento de levadura se miden con precisión a través de imágenes de lapso de tiempo altamente paralelas de células inmovilizadas que crecen en microcolonías. Simultáneamente, se puede monitorear la tolerancia al estrés, la expresión proteica y la localización de proteínas, generando conjuntos de datos integrados para estudiar cómo las diferencias ambientales y genéticas, así como la heterogeneidad de la expresión génica entre las células isogénicas, modulan el crecimiento.

Imágenes en vivo de alto rendimiento de microcolonias para medir la heterogeneidad en crecimiento y expresión génica

El ensayo de alimentación de microplacas ofrece un método económico y de alto rendimiento para cuantificar el consumo de alimentos líquidos en Drosophila. Un dispositivo impreso en 3D conecta una microplaca de 96 pozos en la que las moscas se alojan a una microplaca de 1536 pozos de la que las moscas consumen una solución de alimentación con un tinte trazador. La disminución del volumen de la solución se mide espectrofotométricamente.

Un ensayo de alimentador de microplacas de alto rendimiento para la cuantificación del consumo en Drosophila

Caenorhabditis elegans es un modelo poderoso para examinar los determinantes moleculares que impulsan las interacciones entre el huésped y el microbioma. Presentamos una línea de alto rendimiento que perfila los niveles de colonización del microbioma intestinal de un solo animal junto con aspectos clave de la fisiología de C. elegans.

Aplicación de la vermimetría de flujo para la cuantificación y el análisis del microbioma intestinal de Caenorhabditis elegans

La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.

Ensayo de la unidad formadora de microcolonias para la evaluación de la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis

Las líneas celulares son útiles en estudios sobre organismos intracelulares que no pueden cultivarse fuera de sus células huésped. Aunque las líneas infectadas por Wolbachia han permitido muchos descubrimientos, la heterogeneidad dentro de estas líneas puede conducir a resultados experimentales variables. Presentamos un protocolo para la generación de clones unicelulares y cultivos continuos a partir de células JW18 infectadas con Wolbachia.

Generación de cultivos monoclonales a partir de la línea celular Drosophila melanogaster JW18 infectada por Wolbachia

Aprende a contar unidades formadoras de colonias en formato de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila. Este método automatizado ofrece una ventaja de cien veces en tiempo respecto a los métodos tradicionales.

Conteo rápido de unidades formadoras de colonias en formato de placa de 96 pocillos aplicado al microbioma de Drosophila

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