Name: Un ensayo de unión a proteínas de superficie celular basado en citometría de flujo para evaluar la selectividad y la especificidad de un aptámero anticanceroso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Aprende a realizar un ensayo de citometría de flujo para evaluar la especificidad de aptámeros anticancerosos en receptores de superficie celular. Este método permite confirmar la selectividad del aptámero en células cancerosas.

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Los autores reconocen la financiación de SEED del Instituto de Salud Mental y Física y Traducción Clínica (IMPACT), el programa "Alfred Deakin Postdoctoral Research Fellowship" en la Universidad de Deakin y la "Beca del Programa de Capacitación en Investigación del Gobierno de Australia".

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<li>Amraee, M., Oloomi, M., Yavari, A., Bouzari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+aptamer+identification+and+characterization+for+E.+coli+O157+detection+using+cell+based+SELEX+method%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">DNA aptamer identification and characterization for E. coli O157 detection using cell based SELEX method.</a> Analytical Biochemistry. 536, 36-44 (2017).</li>
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</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

El desafío clave con el desarrollo de nuevos aptámeros es la falta de directrices estándar que se aplican a los diferentes pasos de este proceso. McKeague et al. han demostrado recientemente algunos de los desafíos asociados, que conducen a presentaciones poco claras de los datos en las publicaciones y al fracaso de replicar la investigación. Propusieron directrices fundamentales necesarias para su consideración en la caracterización de aptámeros19. Un ensayo de unión de aptámeros es un paso críti...

El cáncer sigue siendo una de las principales causas de mortalidad en todo el mundo1. A pesar de la mejora significativa en el tratamiento del cáncer en las últimas décadas, el desarrollo de medicamentos contra el cáncer sigue siendo un tema muy debatido. Esto se debe a que la quimioterapia, como pilar del tratamiento del cáncer, se acompaña de efectos secundarios graves que limitan el cumplimiento del tratamiento por parte del paciente. Además, la resistencia al tratamiento del cáncer inducida por la quimioterapia ha restringido su aplicación como la única opción de intervención médica. La aplicación de anticuerpos monoclonales (mAbs) introdujo una respuesta mejorada a los tratamientos contra el cáncer2. La razón del uso de mAbs fue mejorar la eficacia de los quimioterapéuticos y minimizar sus reacciones adversas. Sin embargo, la administración de mAbs también se convirtió en un desafío. Esto no solo se debió a las reacciones inmunológicas inducidas por mAb, sino también a los costosos costos de producción dependientes de los animales y a las difíciles condiciones de almacenamiento3. La introducción de aptámeros en la década de 19904 generó nuevas esperanzas en el tratamiento del cáncer, ya que la aplicación de aptámeros podría abordar los desafíos asociados con los mAbs.
Los aptámeros son secuencias cortas de ácidos nucleicos que se producen específicamente para un determinado objetivo. La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es un método común en la producción de aptámeros. En SELEX, la proteína de interés se incuba con una biblioteca de secuencias aleatorias de nucleótidos, y a través de una serie de ciclos iterativos, se purifica el aptámero específico para esa proteína. Los aptámeros tienen una selectividad y especificidad objetivo similares a los mAbs, y por lo tanto el desarrollo de fármacos en este campo muestra aplicaciones futuras prometedoras. Los aptámeros específicos para biomarcadores de cáncer podrían aplicarse como fármacos individuales y herramientas de diagnóstico del cáncer 5,6,7. Debido a su estructura de tamaño nanométrico, estos aptámeros también podrían actuar como portadores de fármacos para administrar agentes citotóxicos específicamente al tumor8. Esto aumentaría la eficacia de la administración dirigida de fármacos y disminuiría las reacciones adversas asociadas a la quimioterapia y fuera del objetivo. Además, estos nanomedicamentos tienen una alta penetración tisular, lo que los convierte en un candidato deseable para la administración y el tratamiento de fármacos para tumores profundos. Los aptámeros también pueden diseñarse para dirigirse a los transportadores expresados en la barrera hematoencefálica (BBB) para mejorar la administración de fármacos a los tumores cerebrales9. Un buen ejemplo de tal aptámero son los aptámeros bifuncionales, dirigidos al receptor de transferrina (TfR)10 para mejorar la administración del fármaco a través de la barrera hematoencefálica, y la entrega de una carga útil de fármaco citotóxico a las células tumorales11.
A pesar de todas las ventajas de los aptámeros, el desarrollo de fármacos en este campo aún no ha producido un medicamento contra el cáncer comercializado y exitoso. Una razón para esto podría ser la falta de métodos estándar y reproducibles que puedan ser seguidos globalmente por los investigadores en el campo. En este artículo, se demuestra un protocolo paso a paso de un aptámero que se une a una proteína nativa expresada en la superficie celular. Este protocolo es un paso previo en la evaluación preclínica de los aptámeros anticancerosos. El ensayo se realiza para mostrar la selectividad y especificidad del aptámero purificado recogido de SELEX o una secuencia de aptámeros publicada para confirmar la selectividad y la especificidad. Este ensayo basado en citometría de flujo es un ensayo rápido, confiable y sensible que muestra con precisión la selectividad y especificidad del aptámero, donde el aptámero se está probando contra proteínas en la superficie celular12,13,14. Este método se demuestra utilizando la unión de un aptámero específico para EpCAM que se muestra en este documento15. La EpCAM, como glicoproteína transmembrana, desempeña un papel en la señalización, progresión, migración y metástasis de las células tumorales16,17. Para mostrar la selectividad y especificidad de este aptámero, se utilizaron células cancerosas EpCAM positivas y negativas. El aptámero específico de EpCAM previamente desarrollado, TEPP (5'-GC GCG GTAC CGC GC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3′), y un aptámero de control negativo, TENN (5'-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3), se utilizaron como aptámeros de unión a EpCAM y no vinculantes, respectivamente10. El extremo 3' de TEPP y TENN se etiquetó con un fluoróforo TYE665.
TEPP es un aptámero bifuncional que se dirige a EpCAM por un extremo y TfR por el otro. Esto ha hecho de TEPP un candidato adecuado para la administración de fármacos a los tumores cerebrales EpCAM+ . Usando su extremo específico de TfR, TEPP atraviesa la barrera hematoencefálica y, utilizando el extremo específico de EpCAM, encuentra el tumor y entrega su carga (por ejemplo, medicamentos citotóxicos) al tumor. TENN tiene una longitud y estructura 2D similares a TEPP, pero no tiene afinidad con la EpCAM o TfR, y por lo tanto es un aptámero de control negativo adecuado. Usando TEPP y TENN, la prueba de la unión de un aptámero a la proteína diana mediante citometría de flujo se muestra en este documento. Este protocolo se aplica al desarrollo de aptámeros específicos de células. También es aplicable a otros análisis complementarios y de confirmación de las secuencias de aptámeros disponibles en la literatura. El protocolo también puede ser utilizado por aquellos nuevos en el campo de los aptámeros que están buscando usar un aptámero previamente publicado para sus fines de investigación y desarrollo (R&D). En este trabajo, se estudian dos secuencias de aptámeros disponibles en la literatura.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL con tapa incorporada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6649</td><td></td></tr><tr><td>15 mL CellStar con tapón de rosca azul, tubo inferior cónico</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>pipetas serológicas de 5 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Flow Becton Dickinson Citómetro Becton Dickinson</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva V9.0</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A Albúmina</td> sérica bovina <td></td></tr><tr><td>(BSA), polvo liofilizado</td><td>Sigma-AldrichTM</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro de línea brillante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle Modificado (DMEM) Medios de alta glucosa en polvo</td><td>Life Technologies</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfato (DPBS)</td><td>Life Technologies</td><td>21300025</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo, LLC 10.8.1</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A Suero</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovino (FBS)</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ACS-4500</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 150i CO2 Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Heraeus Megafuge 16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Colección de cultivos tipo americano</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca, PS, 96 pocillos, F-bottom (pozo de chimenea), Black</td><td>Greiner Bio One</td><td>655076</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Termociclador</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Life Technologies 18912014</td><td></td><td></td></tr><tr><td>agua ultrapura libre de pirógenos y RNasas</td><td>Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T75 Matraz de cultivo celular</td><td>Cellstar</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>TENN</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GC GCG TGCA CGC GC TA ACG GA TTCCTTT TCC GT-3</td></tr><tr><td>TEPP</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>5&prime;-GC GCG GTAC CGC TA ACG GA GGTTGCG TCC GT-3&prime;</td></tr><tr><td>ARN de transferencia (ARNt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8508-5X1ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr></tbody></table>

un ensayo de unión a proteínas de superficie celular basado en citometría de flujo para evaluar la selectividad y la especificidad de un aptámero anticanceroso

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Un desafío clave en el desarrollo de un aptámero anticanceroso es determinar eficientemente la selectividad y especificidad del aptámero desarrollado para la proteína diana. Debido a sus varias ventajas sobre los anticuerpos monoclonales, el desarrollo de aptámeros ha ganado una enorme popularidad entre los investigadores del cáncer. La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) es el método más común para desarrollar aptámeros específicos para proteínas de interés. Después de SELEX, un ensayo de unión rápido y eficiente acelera el proceso de identificación, confirmando la selectividad y especificidad del aptámero. 
Este documento explica un ensayo de unión citométrico de flujo paso a paso de un aptámero específico para la molécula de adhesión celular epitelial (EpCAM). La glicoproteína transmembrana EpCAM se sobreexpresa en la mayoría de los carcinomas y desempeña un papel en el inicio, la progresión y la metástasis del cáncer. Por lo tanto, es un candidato valioso para la administración de fármacos dirigidos a los tumores. Para evaluar la selectividad y especificidad del aptámero a la EpCAM unida a la membrana, se requieren células positivas y negativas para EpCAM. Además, se requiere un aptámero EpCAM no vinculante con una longitud y estructura bidimensional (2D) similares al aptámero de unión a EpCAM. El ensayo de unión incluye diferentes tampones (tampón de bloqueo, tampón de lavado, tampón de incubación y tampón FACS) y pasos de incubación. 
El aptámero se incuba con las líneas celulares. Después de los pasos de incubación y lavado, las células se evaluarán mediante un ensayo de citometría de flujo sensible. El análisis de los resultados muestra la unión del aptámero específico de EpCAM a las células positivas para EpCAM y no a las células negativas para EpCAM. En las células positivas para EpCAM, esto se representa como un cambio de banda en la unión del aptámero EpCAM a la derecha en comparación con el control del aptámero no vinculante. En las células negativas para EpCAM, las bandas correspondientes de aptámeros de unión y no unión a EpCAM se superponen. Esto demuestra la selectividad y especificidad del aptámero EpCAM. Si bien este protocolo se centra en el aptámero EpCAM, el protocolo es aplicable a otros aptámeros publicados.

Un aspecto importante del descubrimiento y desarrollo de nuevos fármacos es asegurar la selectividad y especificidad del candidato a fármaco. Esto significa que el candidato a fármaco debe ser capaz de discriminar entre diferentes células y sólo afectar a la población celular de interés (selectividad). La selectividad se estudia utilizando líneas celulares que difieren en términos de expresión de la proteína de interés. En este estudio, las líneas celulares MDA-MB-231 y HEK 293T fueron elegidas como células EpCAM positiv...

Un paso necesario en el desarrollo de aptámeros anticancerosos es probar su unión al objetivo. Demostramos un ensayo basado en citometría de flujo para estudiar esta unión, enfatizando la importancia de incluir un aptámero de control negativo y células cancerosas que sean positivas o negativas para esa proteína en particular.

Un ensayo de unión a proteínas de superficie celular basado en citometría de flujo para evaluar la selectividad y la especificidad de un aptámero anticanceroso

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Este protocolo ayudará a los investigadores nuevos en el trabajo con aptámeros a poder usarlos en sus proyectos y también a comprender los pequeños pasos individuales que se requieren para completar el protocolo. Los aptámeros son muy versátiles, y este protocolo demuestra lo fáciles y simples que son en un ensayo de inmunofenotipado. Los aptámeros se pueden utilizar tanto para aplicaciones diagnósticas como terapéuticas.Este protocolo es el primer paso dado para confirmar su especificidad y sensibilidad. Si bien este ensayo en particular demuestra la tinción de un receptor de superficie celular, los aptámeros se pueden usar muy fácilmente para la citometría de flujo multiparamétrica, proporcionando un alto nivel de conocimiento fenotípico. Los aspectos importantes de trabajar con aptámeros son asegurarse de que estén plegados correctamente antes de su uso, y también que las condiciones de tampón y fuerza iónica sean las mismas que cuando fueron seleccionados.Después de recoger y desechar el medio en el matraz, añadir tres mililitros de PBS y extenderlo sobre las células. Después de añadir un mililitro de 0,25% de tripsina-EDTA a cada matraz, incubar durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados y visualizar el desprendimiento de células bajo un microscopio. A continuación, agregue un mililitro de medio completo a las células y pipetear las células hacia arriba y hacia abajo para hacer una suspensión de una sola celda.Pipetear las células en un tubo apropiado y centrifugar a 200 G durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda las células en un mililitro de medio fresco y cuente las células usando tinción de azul de tripano diluyendo cierto volumen de suspensión celular con azul de tripano. Distribuir aproximadamente 15 microlitros de la mezcla entre un hemocitómetro y un vidrio de cubierta para contar las células.Recopile el número requerido de células, asegurándose de tener cien mil células por muestra de prueba. Luego incubar las células a 37 grados centígrados durante dos horas para permitir la estabilización de la proteína de interés en la membrana celular después del desprendimiento enzimático. Después de las dos horas de incubación, centrifugar las células a 500 G durante cinco minutos.Después de desechar el sobrenadante, resuspenda las células en 500 microlitros de tampón de bloqueo. Incubar las células a cuatro grados centígrados durante 30 minutos con mezcla intermitente. Durante esta incubación de 30 minutos, realice el plegamiento del aptámero preparando el doble de las concentraciones de aptámeros que se describen en el manuscrito.A continuación, mezcle e incube los aptámeros con la máquina termocicladora de acuerdo con las condiciones de plegado requeridas, asegurándose de proteger los aptámeros de la luz. Después de la incubación de 30 minutos, centrifugar las células como se demostró anteriormente y eliminar el sobrenadante. Luego agregue un mililitro de tampón de lavado y centrifugar las celdas nuevamente.Después de retirar el sobrenadante, resuspenda las células en un volumen adecuado del tampón de unión. A continuación, pipetear 50 microlitros de las células resuspendidas en cada pocillo de una placa negra helada de 96 pocillos. Luego pipetear 50 microlitros de los aptámeros sobre un volumen de células de 50 microlitros, mezclar e incubar en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 30 minutos.Después de centrifugar y retirar el sobrenadante, vuelva a suspender cuidadosamente el pellet en tampón de lavado y vuelva a centrifugar a 500 G durante cinco minutos. Luego vuelva a suspender en 100 microlitros de tampón de lavado para el análisis citométrico de flujo mientras repite el paso de lavado dos veces. Primero, encienda el citómetro de flujo y luego la computadora.A continuación, abra el software de análisis de citometría de flujo, inicie sesión en el programa y, en la pestaña del citómetro, ejecute el inicio del fluido. Para crear un nuevo experimento, en la pestaña experimento, haga clic en nueva carpeta y asigne al experimento de barra diagonal el nombre adecuado. Haga clic en la nueva carpeta para resaltarla.A continuación, en la pestaña experimento de nuevo, haga clic en nuevo experimento y asigne al experimento el nombre adecuado. Para agregar la primera muestra de barra, en la pestaña experimento, haga clic en nueva muestra y asigne el nombre apropiado a la muestra. Para agregar una muestra de tubo, resalte la muestra y, en la pestaña experimento, haga clic en nuevo tubo.A continuación, agregue el número apropiado de tubos y el nombre. Para preparar los gráficos necesarios, en una pestaña de hoja de cálculo, abra una nueva hoja de cálculo. Una vez que aparezca la nueva ventana de la hoja de cálculo, prepare un gráfico de borrado de puntos de dispersión lateral versus dispersión directa para seleccionar la población de interés.Prepare un gráfico de borrado de puntos de la altura de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión hacia adelante para seleccionar la población de una sola celda. A continuación, prepare un histograma del número de eventos contra el fluoróforo de interés. Asegúrese de que el panel de adquisición para controlar la adquisición de muestras, el inspector y el citómetro para ajustar los parámetros de voltaje, así como la hoja de trabajo con todos los gráficos, estén abiertos antes de comenzar la citometría de flujo.Primero, ejecute las células no tratadas. Asegúrese de que la flecha que apunta al tubo sea verde. Si esta flecha no es verde, haga clic en la flecha para que sea verde.Con una pipeta, transfiera cada muestra de la placa negra de 96 pocillos a un tubo de citometría de flujo. En el panel de adquisiciones, elija un número adecuado de eventos para registrar, cambie el caudal a bajo y haga clic en Adquirir datos. Ajuste el voltaje para los parámetros FSC y SCC, asegurando que la población de celdas esté centralizada dentro del diagrama de puntos y que ninguna celda toque ninguno de los ejes del gráfico para evitar perder las celdas de interés.Defina la primera puerta identificando y seleccionando la población de interés en una gráfica de densidad dispersa hacia adelante y hacia los lados, excluyendo los escombros, que constituyen la población con la señal de dispersión hacia adelante más baja. Defina la segunda puerta excluyendo las poblaciones de células dobles, ya que las células dobletes afectan considerablemente los resultados y las conclusiones. Aumente la velocidad de adquisición a media o alta para analizar las muestras más rápido, pero no exceda más de 200 a 300 eventos por segundo.A continuación, haga clic en grabar datos. Después de ajustar el voltaje y la activación y registrar los datos, saque la muestra y haga clic en Next Tube (Siguiente tubo). Inserte la siguiente muestra y repita los datos de grabación para todas las muestras de control y prueba.Una vez recopilados todos los datos, lave el citómetro de flujo haciendo funcionar tres tubos de lejía al 50%, FACSRinse y agua ultrapura, cada uno durante cinco minutos a un caudal alto. Luego, en el menú desplegable del citómetro, haga clic en Apagado de fluidos. Exporte el resultado como archivos fsc a una unidad USB para transferir.Analícelos utilizando el software de análisis presionando el botón nuevo para crear un nuevo documento y una ventana para manejar el análisis, y arrastre los archivos de muestra a la nueva ventana. Haga doble clic para abrir la muestra sin teñir. Para bloquear la población de una sola célula, elija la población P1 y haga doble clic en la población P1 para crear un gráfico FSCH versus FSCA.Haga doble clic en las celdas individuales cerradas para crear un histograma de eventos contra el fluorocromo utilizado. En la ventana original, seleccione P1 y celdas individuales y arrástrelas a todas las muestras para que todas las muestras ahora contengan el mismo gating. A continuación, haga clic en el botón del editor de diseño para abrir la ventana de diseños y arrastre dos muestras una sobre la otra para crear un histograma de superposición.En las células MDA-MB-231 positivas para EpCAM, la superposición de los histogramas que representan las células tratadas con TEPP y TENN muestra que las células tratadas con TEPP se desplazan hacia la derecha, en comparación con las células tratadas con TENC, lo que demuestra que la unión del aptámero TEPP se produce a la proteína de interés. En el control negativo, las células HEK 293T que superponen histogramas de TEPP y TENN no reflejan ningún cambio, lo que indica que en las células que expresan EpCAM TEPP es el aptámero EpCAM unido a su receptor. Y además, no se observó unión en células EpCAM negativas, lo que confirma la selectividad y especificidad del aptámero desarrollado.Asegúrese de que los aptámeros estén protegidos de la luz, que los aptámeros y las células se mezclen en la placa y que se establezcan los voltajes correctos en el citómetro de flujo. Esto depende en gran medida de futuras aplicaciones para los aptámeros. Por ejemplo, estamos enfocados en la administración de medicamentos.Así que el siguiente paso para nosotros sería evaluar si los aptámeros se internalizan mediante microscopía fluorescente. Este protocolo ha demostrado lo fácil que es para los aptámeros reemplazar los anticuerpos monoclonales y policlonales en los ensayos de inmunofenotipado.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

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Un ensayo de unión a proteínas de superficie celular basado en citometría de flujo para evaluar la selectividad y la especificidad de un aptámero anticanceroso (Video) | JoVE Journal

Un ensayo de unión a proteínas de superficie celular basado en citometría de flujo para evaluar la selectividad y la especificidad de un aptámero anticanceroso

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