Aislamiento fecal murino y trasplante de microbiota

Aquí hemos descrito un protocolo para guiar a otros en la investigación de los mecanismos de la disbiosis en la enfermedad, desde la recolección de muestras fecales hasta el uso del método Swiss roll para estudiar los cambios en el intestino. Para comenzar, rocíe el pecho y los lados del ratón sacrificado con etanol al 70%, y abra cuidadosamente la piel y la cavidad peritoneal para exponer el tracto gastrointestinal. Aísle el ciego y use tijeras quirúrgicas estériles para cortarlo por la mitad.

Exponga brevemente el ciego, y corte 0,5 centímetros proximalmente desde el íleon y 0,5 centímetros distalmente en su unión con el colon. Transfiera el ciego aislado a una placa de Petri estéril. Use una espátula estéril para transferir el contenido de cecal a tubos estériles y almacene las alícuotas en un congelador de 80 grados centígrados.

Vuelva a suspender los gránulos fecales frescos o previamente congelados en solución salina estéril en una proporción de 1 a 20, y el vórtice hasta homogeneizar. Pase el homogeneizado a través de un filtro de nylon de 30 micrómetros de poro para eliminar las partículas grandes. Centrifugar a 79G durante cinco minutos y recoger el sobrenadante para utilizarlo en el trasplante.

Sonda oral 100 microlitros de la suspensión por ratón receptor libre de gérmenes durante tres días consecutivos, seguido de sonda sonda cada tres días durante dos semanas. Coloque suavemente el mouse en restricciones en el soporte del mouse precalentado y deje la cola afuera. Pegue con cuidado la parte superior sin pellizcarla para no estresar el mouse.

Deje que el ratón descanse en el soporte y colóquelo en la plataforma de la máquina del manguito de la cola durante tres a cinco minutos, cubierto por una hoja para aclimatarse. Recopile al menos tres rondas de mediciones de presión sistólica usando pletismografía del manguito de la cola, y promedie las mediciones de todas las rondas para una presión sistólica promedio para cada animal. Recolectar asépticamente el contenido cecal del ratón sacrificado.

Para cosechar los intestinos y otros tejidos, localice el tejido en el ratón y exciéralos con tijeras para examinar el papel de la microbiota intestinal en la salud cardiometabólica. El primer día, disecciona el intestino del ratón desde el lado anal hasta el lado del estómago. Y coloque la totalidad del tracto gastrointestinal aislado en una placa de Petri que contenga PBS.

Tire suavemente del extremo proximal del extremo del estómago y retire la grasa circundante y el tejido conectivo con la mano. Aísle el intestino delgado y haga un zigzag tipo Z con cada longitud. Luego, corte para obtener el duodeno, el yeyuno y el íleon.

Aísle el colon cortando la sección del intestino debajo del ciego. Cortar el duodeno, el yeyuno, el íleon y el colon. Use una jeringa y una aguja con la punta de una bola para enjuagar y lavar cuidadosamente el intestino por dentro con PBS sin desgarrar el intestino.

Coloque la tripa en papel de filtro y etiquete el papel con el nombre de la sección y luego P en la esquina superior izquierda para proximal o D para distal en la esquina inferior izquierda. Corte la tripa longitudinalmente con tijeras de punta de bola. Abra la tripa en el papel de filtro y lave con más PBS según sea necesario.

Intercala la tripa entre dos papeles de filtro y grapa los papeles de filtro en cuatro puntos o esquinas cerca de la tripa. Remojar en una solución tampón neutra de formalina al 10% y agitar con un balancín de plataforma a cinco rpm durante la noche a temperatura ambiente. El segundo día, caliente la agarosa preparada al 2% en agua destilada con una barra de agitación en un vaso de precipitados cubierto con papel de aluminio.

Para recuperar los tejidos, quite el papel de filtro superior y enrolle el intestino desde el lado proximal para que el lado proximal entre primero, y ruede hacia adentro para que el lumen también esté dentro en el portaobjetos. Fije con una aguja de calibre 30 o dos, según sea necesario. Aspire un mililitro de agarosa usando pipetas de transferencia graduadas desechables y vierta la agarosa en una sección intestinal enrollada sobre una superficie plana evitando burbujas de aire en los tejidos.

Después de que la agarosa se enfríe y se solidifique, use una cuchilla de afeitar para recortar la agarosa adicional alrededor de la sección de tejido. Finalmente, coloque las secciones intestinales en el procesamiento de tejidos o en la incrustación de casetes, y sumérjalas en etanol al 70% a cuatro grados centígrados. Aquí se muestra la estimación de la biodiversidad de especies en el contenido cecal obtenido de ratones con dietas normales de sal y dietas altas en sal.

Los cambios en la microbiota intestinal en respuesta al alto contenido de sal incluyeron una disminución de la biodiversidad bacteriana. La escala multidimensional no métrica muestra que las bacterias de la sal normal y los ratones con dieta alta en sal forman grupos separados. El alto contenido de sal se asocia con un aumento de la proporción de Firmicutes a Bacteroidetes.

El trasplante de microbiota fecal de ratones alimentados con alto contenido de sal predispone a los ratones libres de gérmenes a la hipertensión inducida por angiotensina II. La transferencia de microbiota intestinal disbiótica inducida por alto contenido de sal se asoció con un aumento significativo de la presión sistólica en ratones libres de gérmenes en comparación con los ratones que recibieron microbiota intestinal con sal normal. Las imágenes representativas muestran tinción de apolipoproteína A-I en ilia obtenida de ratones que tenían hiperlipidemia sin proteinuria o con proteinuria.

Este protocolo alinea los pasos para lograr un FMT exitoso en consideraciones experimentales clave para donantes humanos y roedores.