Name: Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: Aprende a realizar microinyecciones ventriculares de lipopolisacárido en larvas de Danio rerio para evaluar neuroinflamación y neurotoxicidad. Este método permite estudiar respuestas inflamatorias cerebrales y probar fármacos antiinflamatorios.

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Este estudio fue apoyado por subvenciones del Fondo de Desarrollo Científico y Tecnológico (FDCT) de la RAE de Macao (Ref. FDCT0058/2019/A1 y 0016/2019/AKP), Comité de Investigación, Universidad de Macao (MYRG2020-00183-ICMS y CPG2022-00023-ICMS), y Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 81803398).

Las líneas de pez cebra de tipo salvaje AB y pez cebra transgénico elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP y mpo: EGFP se obtuvieron del Instituto de Ciencias Médicas Chinas (ICMS). La aprobación ética (UMARE-030-2017) para los experimentos con animales fue otorgada por el Comité de Ética de Investigación Animal de la Universidad de Macao, y el protocolo sigue las pautas institucionales de cuidado animal.
1. Cría de embriones y larvas de pez cebra
<ol><li>Generar embriones de pez cebra (200-300 embriones por apareamiento) por apareamiento natural por pares como se informó anteriormente28.</li>
	<li>Preparar el caldo mediano de agua de huevo (E3) (60×) disolviendo 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl 2·2H 2 O, y 9,78 g de MgCl 2·6H2O enddH2Oa un volumen final de 2 L yajustar el pH a7,2 usando NaOH y HCl. Para preparar la concentración de trabajo del medio E3 (1×), diluir el material 60 veces en ddH2O. Almacenar a 28,5 °C cuando no esté en uso.</li>
	<li>Utilice una pipeta de transferencia de plástico para transferir los embriones de pez cebra a un plato que contenga medio E3. Criar los embriones a 28,5 °C en una incubadora y controlar su desarrollo y salud. Retire los embriones muertos y reemplace el medio E3 sucio con un medio fresco diariamente.</li>
	<li>Para experimentos de imágenes de pez cebra, use una pipeta de transferencia de plástico para recolectar embriones de 0-2 h después de la fertilización (hpf) (alrededor de 200 huevos) en aproximadamente 15 ml de medio E3 de 1× que contenga 0.003% de N-feniltiourea (PTU). NOTA: La PTU puede inhibir la formación de melanóforos durante la embriogénesis29. El tratamiento de embriones con PTU durante la embriogénesis puede mejorar la detección de señales en microscopía o la expresión de fluorescencia30.</li>
	<li>Mantener los embriones de pez cebra en las condiciones anteriores hasta que los embriones alcancen la etapa larvaria de desarrollo deseada.</li>
</ol>2. Preparación para la microinyección
<ol><li>Prepárese para la inyección tirando de los capilares de vidrio con un extractor de micropipetas (consulte la Tabla de materiales), siguiendo el protocolo de cinco pasos para la extracción del tubo capilar de vidrio (Tabla 1).</li>
	<li>Abra la punta de la aguja (capilares de vidrio de pared delgada [3.5 in] con filamento, OD 1.14 mm) al tamaño apropiado en un ángulo usando pinzas (Figura 2A).</li>
	<li>Llene la aguja con 0,1 ml de aceite mineral para asegurarse de que no haya burbujas.</li>
	<li>Retire el tapón de rosca de la aguja de acero del aparato de microinyección. Alinee el orificio de la aguja de vidrio con la aguja de acero y luego apriete la tapa de rosca. Monte el aparato de microinyección de aguja cargado en un micromanipulador (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Ajuste la posición del aparato de microinyección para que el micromanipulador pueda mover el aparato de forma flexible bajo el microscopio. Descargue un cierto volumen de aceite de parafina para hacer que la aguja de acero ingrese al tubo de vidrio capilar.</li>
	<li>Deje caer la solución inyectable (como 1× PBS o 5 mg/ml de LPS) en un portaobjetos de vidrio esterilizado con etanol al 70% y ajuste el aparato de microinyección para que la punta se inserte en la gota líquida. Cargue ~2 μL de solución inyectable en la aguja.</li>
	<li>Configure el micromanipulador (ajustes de ajuste fino de arriba, abajo, izquierda y derecha) de modo que la punta de la aguja del aparato de microinyección esté en el mismo campo de visión que las larvas con gran aumento (Figura 2B).</li>
</ol>3. Montaje de pez cebra para microinyecciones
NOTA: El desarrollo del cerebro del pez cebra ocurre dentro de 3 dpf y madura a 5 dpf con un sistema nervioso central bien desarrollado31,32. Por lo tanto, las larvas de 5 dpf ya son adecuadas para estudiar el daño neuronal mediado por LPS, así como las respuestas conductuales e inflamatorias.
<ol><li>Inyecte las larvas de pez cebra dentro de aproximadamente 30 minutos de alcanzar la etapa de interés, para mantener la consistencia del tiempo de inyección.</li>
	<li>Para anestesiar las larvas de pez cebra, combine tricaine con agua limpia del tanque de peces (concentración final de 0.02% p/v tricaína).</li>
	<li>Derretir una solución de agarosa al 2% enddH2Ousando un microondas. Vierta la agarosa fundida en un plato de plástico. El plato de plástico recubierto de agarosa al 2% se puede almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.</li>
	<li>Use una pipeta de transferencia de plástico para transportar las larvas anestesiadas al centro del plato de plástico recubierto de agarosa al 2%. Oriente las larvas montadas con el cerebro hacia arriba para el acceso de la aguja.</li>
</ol>4. Inyección del ventrículo cerebral
<ol><li>Ajuste el aumento del microscopio para que la estructura ventricular cerebral del pez cebra se muestre claramente en el campo de visión (Figura 2B).</li>
	<li>Coloque la aguja cuidadosamente por encima del tectum cerebral (Figura 2C).</li>
	<li>Perfore la piel del cerebro del pez cebra con la punta de la aguja lentamente usando el micromanipulador.</li>
	<li>Presione el pedal para expulsar 1 nL de 1x PBS o diferentes concentraciones de LPS (1.0, 2.5 y 5.0 mg/mL) (consulte la Tabla de materiales). Las imágenes exitosas de inyección de ventrículo en las que se inyectó ventrículo cerebral con 1 nL de colorante azul de Evans al 1% (diluido en PBS) se muestran como ejemplo (Figura 2D). Transfiera las larvas al medio E3 limpio inmediatamente después de la inyección. Después de 24 h, recolecte las larvas para obtener imágenes microscópicas, ensayos de comportamiento locomotor y determinación de otros indicadores.</li>
</ol>5. Imágenes
<ol><li>Prepare una solución de agarosa baja en fusión al 1,5% en medio E3 y caliéntela en un microondas para formar un líquido transparente.</li>
	<li>Use una pipeta de transferencia de plástico limpio para transportar las larvas a un portaobjetos de vidrio y elimine la mayor cantidad de agua posible.</li>
	<li>Use una pipeta de transferencia de plástico para agregar una gota de agarosa baja en fusión al 1.5% a las larvas. NOTA: Enfríe la agarosa de bajo punto de fusión en la pipeta durante un tiempo antes de agregarla para no dañar las larvas.</li>
	<li>Use una aguja de jeringa de 1 ml para orientar las larvas. Espere hasta que la agarosa se enfríe y se solidifique antes de comenzar a tomar imágenes.</li>
	<li>Observe y fotografíe la región neuronal en todo el cerebro del pez cebra Tg(ETvmat2:EGFP) y Tg(elavl3:mCherry), así como el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra Tg(mpo:EGFP) bajo un microscopio estéreo de fluorescencia (ver Tabla de materiales). NOTA: Los ajustes del microscopio de fluorescencia utilizados para obtener imágenes se muestran a continuación. Tg(ETvmat2:EGFP) cerebro de pez cebra (longitud de onda de excitación: 450-490 nm, longitud de onda de emisión: 500-550 nm, aumento visual: 100x); Tg(elavl3:mCherry) cerebro de pez cebra (longitud de onda de excitación: 541-551 nm, longitud de onda de emisión: 590 nm, aumento visual: 100x); Tg(mpo:EFGP) cerebro de pez cebra (longitud de onda de excitación: 450-490 nm, longitud de onda de emisión: 500-550 nm, aumento visual: 63x).</li>
	<li>Mida y analice la intensidad de fluorescencia y la longitud de la región de la neurona Ra en el pez cebra Tg (ETvmat2: EGFP) y la intensidad de fluorescencia de las neuronas cerebrales del pez cebra Tg (elavl3: mCherry) utilizando el software ImageJ. Cuente manualmente los neutrófilos en la región cerebral del pez cebra Tg(mpo: EFGP).</li>
</ol>6. Determinación de marcadores de expresión génica
<ol><li>A las 24 h después de la inyección ventricular cerebral LPS, proceder con la determinación de los marcadores de expresión génica. Para ello, anestesia las larvas de pez cebra con tricaína al 0,02% (como se menciona en el paso 3.2).</li>
	<li>Use dos jeringas de 1 ml para separar las porciones de la cabeza de las larvas (40 larvas por grupo) sin las regiones del ojo y el saco vitelino (Figura 2E).</li>
	<li>Extraer ARN de las porciones de la cabeza larvaria.<ol><li>Para la extracción de ARN, homogeneice la porción de la cabeza con 200 μL de reactivo de extracción de ARN (consulte la Tabla de materiales) utilizando un molinillo de tejidos (consulte la Tabla de materiales) a una velocidad de rotación de 11,000 rpm durante 5 s.</li>
		<li>Realizar la extracción de ARN utilizando el método cloroformo-isopropanol. Para ello, agregue 40 μL de cloroformo, agite los tubos vigorosamente e incubarlos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Transfiera la fase acuosa a un tubo nuevo (aproximadamente 100 μL) y agregue 100 μL de isopropanol. Incubar durante 10 min y luego centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C. Retire el sobrenadante.</li>
		<li>Agregue 200 μL de etanol al 75% para lavar el pellet de ARN. Vortex las muestras brevemente y luego centrifugar a 7500 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y lave de nuevo el pellet de ARN.</li>
		<li>Seque al aire el pellet de ARN durante 5-10 minutos, luego agregue 30 μL de agua libre de RNasa para disolver el pellet de ARN. Compruebe la pureza (relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm) y la integridad del ARN utilizando un espectrofotómetro de microvolumen (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Sintetizar ADNc a partir del ARN extraído en el paso 6.3, utilizando transcriptasa inversa con cebadores aleatorios (ver Tabla de materiales).<ol><li>Agregue 1 μL de cebadores aleatorios, 1 μL de dNTP, 1 μg de ARN y agua destilada (volumen total a 12 μL) a un tubo libre de nucleasa. Calentar la mezcla a 65 °C durante 5 min y enfriar rápidamente en hielo.</li>
		<li>Agregue 1 μL de DTT 0.1 M, 1 μL de inhibidor de RNasa, 4 μL de tampón de primera cadena 5× y 1 μL de transcriptasa inversa M-MLV (volumen total: 20 μL) al tubo. Mezclar suavemente e incubar el tubo a 25 °C durante 2 min, seguido de 42 °C durante 50 min. Inactivar la reacción calentando a 70 °C durante 15 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar PCR en tiempo real en un sistema de qPCR (ver Tabla de materiales) utilizando un kit RT-qPCR disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) para determinar la expresión de los genes diana (IL-1β, IL-6 y TNF-α). La mezcla de reacción (20 μL) contenía 10 μL de verde SYBR, 0,4 μL de colorante de referencia ROX, 0,8 μL de cada uno de los cebadores directos e inversos, 6 μL deddH2Oy 2 μL de ADNc plantilla (1 μg). Realizar amplificación por PCR en las condiciones: 95 °C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 34 s, y con una etapa de disociación de 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 60 s y 95 °C durante 15 s.</li>
	<li>Normalizar los niveles de ARNm de los genes diana a los de un gen de mantenimiento, el factor de elongación 1 α (Ef1α). Calcular los niveles de expresión para cada gen diana mediante el método 2−ΔΔCT33. Las secuencias de cebadores de cada gen se describen en la Tabla 2.</li>
	<li>Para la determinación del óxido nítrico, homogeneizar la porción de la cabeza (obtenida en el paso 6.2) en 100 μL de PBS frío utilizando un molinillo de tejido. Centrifugar el PBS resultante y la suspensión de la porción de cabeza a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. Recoja los lisados y realice el ensayo de concentración de nitritos34 utilizando un kit disponible comercialmente (ver Tabla de materiales).</li>
</ol>7. Ensayo de comportamiento de locomotora de pez cebra
<ol><li>A las 24 h después de la inyección ventricular cerebral LPS, transfiera las larvas de pez cebra a los pocillos de una microplaca cuadrada de 96 pocillos individualmente. Añadir 300 μL de medio E3 a cada pocillo e incubar las larvas durante 4 h para aclimatarse a la placa de ensayo.</li>
	<li>Transfiera la microplaca cargada de larvas a la caja de seguimiento del pez cebra (consulte la Tabla de materiales). Encienda la fuente de luz y luego incube las larvas en la caja de prueba durante 30 minutos para aclimatar el ambiente.</li>
	<li>Monitoree y registre el comportamiento del pez cebra utilizando un sistema automatizado de seguimiento de video. Registre 12 sesiones (5 min cada una, total 1 h) para cada pez cebra. Defina la distancia total (consiste en distancias inactivas, pequeñas y grandes) como la distancia (en mm) que cada pez movió durante un período de seguimiento de 60 minutos.</li>
</ol>8. Análisis estadístico
<ol><li>Realice análisis estadísticos utilizando software de análisis estándar (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Realizar análisis estadísticos de las diferencias entre dos grupos utilizando ANOVA unidireccional ordinario. Calcule el coeficiente de correlación de Pearson para evaluar la fuerza de las correlaciones. El p < 0,05 se consideró significativo en todos los análisis.</li>
</ol>

Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.

Una cantidad creciente de datos epidemiológicos y experimentales implican infecciones bacterianas y virales crónicas como posibles factores de riesgo para enfermedades neurodegenerativas36. La infección desencadena la activación de procesos inflamatorios y respuestas inmunes del huésped37. Incluso si la respuesta actúa como un mecanismo de defensa, la inflamación sobreactivada es perjudicial para la neurogénesis, y el ambiente inflamatorio no permite la supervivencia de las...

La neuroinflamación ha sido descrita como un factor antineurogénico crucial implicado en la patogénesis de varias enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central (SNC)1. Después de los insultos patológicos, la neuroinflamación puede resultar en diversas consecuencias adversas, incluyendo la inhibición de la neurogénesis y la inducción de la muerte celular neuronal 2,3. En el proceso subyacente a la respuesta a la inducción de inflamación, múltiples citoquinas inflamatorias (como TNF-α, IL-1β e IL-6) son secretadas en el espacio extracelular y actúan como componentes cruciales en la muerte neuronal y la supresión de la neurogénesis 4,5,6.
La microinyección de mediadores de la inflamación (como IL-1β, L-arginina y endotoxinas) en el cerebro puede causar reducción de células neuronales y neuroinflamación 7,8,9. El lipopolisacárido (LPS, Figura 1), una endotoxina patógena presente en la pared celular de las bacterias gramnegativas, puede inducir neuroinflamación, exacerbar la neurodegeneración y reducir la neurogénesis en animales10. La inyección de LPS directamente en el SNC del cerebro del ratón aumentó los niveles de óxido nítrico, citoquinas proinflamatorias y otros reguladores11. Además, la inyección estereotáxica de LPS en el entorno cerebral local puede inducir una producción excesiva de moléculas neurotóxicas, lo que resulta en una función neuronal deteriorada y el posterior desarrollo de enfermedades neurodegenerativas 10,12,13,14,15. En el campo de la neurociencia, las observaciones microscópicas vivas y temporales-curso de los procesos celulares y biológicos en organismos vivos son cruciales para comprender los mecanismos subyacentes a la patogénesis y la acción farmacológica16. Sin embargo, la imagen en vivo de modelos de ratón de neuroinflamación y neurotoxicidad está fundamentalmente limitada por la limitada profundidad de penetración óptica de la microscopía, lo que impide la imagen funcional y la observación en vivo de los procesos de desarrollo17,18,19. Por lo tanto, el desarrollo de modelos alternativos de neuroinflamación es de gran interés para facilitar el estudio del desarrollo patológico, y el mecanismo subyacente a la neuroinflamación y la neurodegeneración, mediante imágenes en vivo.
El pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un modelo prometedor para estudiar la neuroinflamación y la neurodegeneración debido a su sistema inmune innato conservado evolutivamente, transparencia óptica, gran tamaño de embrague embrionario, trazabilidad genética e idoneidad para imágenes in vivo 19,20,21,22,23 . Los protocolos anteriores han inyectado directamente LPS en la yema y el ventrículo del cerebro posterior de larvas de pez cebra sin evaluación mecanicista, o simplemente han agregado LPS al agua de los peces (medio de cultivo) para inducir una respuesta inmune sistémica letal24,25,26,27. Aquí, desarrollamos un protocolo para la microinyección de LPS en los ventrículos cerebrales, para desencadenar una respuesta inmune innata o neurotoxicidad en los 5 días posteriores a la fertilización (dpf) de larvas de pez cebra. Esta respuesta se evidencia por la pérdida de células neuronales, el déficit de comportamiento locomotor, el aumento de la liberación de óxido de nitrito, la activación de la expresión génica inflamatoria y el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra a las 24 h después de la inyección.

<table><tbody><tr><td>Agarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6361</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa, baja temperatura de gelificación</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Nanoject III Inyector de nanolitros programable</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>Microscopios estereoscópicos de fluorescencia</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Software Prisma</td><td>GraphPad Software</td><td>Ver. 7.04</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos de Escherichia coli O111:B4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3024</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador manual</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Mx3005P Sistema qPCR</td><td>Agilent Technologies</td><td>Mx3005P</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Nanovue plus</td><td>Biochrom</td><td>80-2140-46</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de concentración de nitrito</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>S0021M</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de pipetas horizontal programable</td><td>World Precision Instruments</td><td>PMP-102</td><td></td></tr><tr><td>PTU (N-feniltiourea)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Cebadores aleatorios</td><td>Takara</td><td>3802</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq II kit</td><td>Biología precisa</td><td>AG11701</td><td></td></tr><tr><td>La 3ª generación Tgrinder</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y30</td><td></td>Capilares de</tr><tr><td>vidrio de pared fina (4") con filamento, diámetro exterior 1,5 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína (éster etílico de ácido benzoico de 3 aminoácidos)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>TRNzol Reactivo universal</td><td>Tiangen</td><td>DP424</td><td></td></tr><tr><td>Caja de seguimiento de pez cebra</td><td>Tecnología de comportamiento</td><td></td><td></td> ViewPoint</tr></tbody></table>

microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity

La neuroinflamación es un jugador clave en diversos trastornos neurológicos, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. Por lo tanto, es de gran interés investigar y desarrollar modelos alternativos de neuroinflamación in vivo para comprender el papel de la neuroinflamación en la neurodegeneración. En este estudio, se desarrolló y validó un modelo larval de pez cebra de neuroinflamación mediado por microinyección ventricular de lipopolisacárido (LPS) para inducir una respuesta inmune y neurotoxicidad. Las líneas transgénicas de pez cebra elavl3: mCherry, ETvmat2: GFP y mpo: EGFP se utilizaron para la cuantificación en tiempo real de la viabilidad de las neuronas cerebrales mediante imágenes fluorescentes en vivo integradas con análisis de intensidad de fluorescencia. El comportamiento locomotor de las larvas de pez cebra se registró automáticamente utilizando una grabadora de seguimiento de video. Se investigó el contenido de óxido nítrico (NO) y los niveles de expresión de ARNm de citoquinas inflamatorias, incluyendo interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β (IL-1β) y factor de necrosis tumoral humana α (TNF-α) para evaluar la respuesta inmune inducida por LPS en la cabeza larval del pez cebra. A las 24 h después de la inyección ventricular cerebral de LPS, se observó pérdida de neuronas y deficiencia de locomoción en larvas de pez cebra. Además, la neuroinflamación inducida por LPS aumentó la liberación de NO y la expresión de ARNm de IL-6, IL-1β y TNF-α en la cabeza de larvas de pez cebra de 6 días después de la fertilización (dpf), y resultó en el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro del pez cebra. En este estudio, la inyección de pez cebra con LPS a una concentración de 2.5-5 mg / ml a 5 dpf se determinó como la condición óptima para este ensayo de neuroinflamación farmacológica. Este protocolo presenta una metodología nueva, rápida y eficiente para la microinyección de LPS en el ventrículo cerebral para inducir neuroinflamación y neurotoxicidad mediada por LPS en una larva de pez cebra, que es útil para estudiar la neuroinflamación y también podría usarse como un ensayo de detección de drogas in vivo de alto rendimiento.

El flujo de trabajo descrito aquí presenta una metodología nueva, rápida y eficiente para inducir neuroinflamación y neurotoxicidad mediada por LPS en larvas de pez cebra. En este protocolo descrito, se inyectaron 5 dpf de pez cebra con LPS (Figura 1) en ventrículos cerebrales utilizando un microinyector (Figura 2A-C). La inyección exitosa en el sitio del ventrículo cerebral se verificó utilizando tinción azul de Evans al 1% (<s...

Este protocolo demuestra la microinyección de lipopolisacárido en la región ventricular cerebral en un modelo larvario de pez cebra para estudiar la respuesta neuroinflamatoria resultante y la neurotoxicidad.

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

Neuroinflammation is a key player in various neurological disorders, including neurodegenerative diseases. Therefore, it is of great interest to research ...

La neuroinflamación es un jugador clave en diversos trastornos neurológicos. Por lo tanto, es de gran interés investigar y desarrollar modelos alternativos de neuroinflamación in vivo para facilitar los estudios del desarrollo patológico. La técnica descrita aquí es una excelente herramienta para comprender mejor los cambios patológicos en el cerebro a través de imágenes in vivo, y para evaluar rápida y eficientemente posibles medicamentos antineuroinflamatorios.Prepárese para la inyección tirando de los capilares de vidrio con un extractor de micropipeta siguiendo el protocolo de cinco pasos para la extracción del tubo capilar de vidrio. Abra la punta de la aguja al tamaño apropiado en ángulo con fórceps. Llene la aguja con 0,1 mililitros de aceite mineral para asegurarse de que no haya burbujas.Retire el tapón de rosca de la aguja de acero del aparato de microinyección. Alinee el orificio de la aguja de vidrio con la aguja de acero, luego apriete la tapa de rosca. Monte el aparato de microinyección de aguja cargado en un micromanipulador.Ajuste la posición del aparato de microinyección para que el micromanipulador pueda mover el aparato de forma flexible bajo el microscopio. Descargue un volumen apropiado de aceite de parafina requerido para hacer que la aguja de acero ingrese al tubo de vidrio capilar. Deje caer la solución inyectable que consiste en PBS o lipopolisacárido en un portaobjetos de vidrio esterilizado con etanol al 70% y ajuste el aparato de microinyección para que la punta se inserte en la gota líquida.Cargue aproximadamente dos microlitros de solución inyectable en la aguja. Configure el micromanipulador de modo que la punta de la aguja del aparato de microinyección esté en el mismo campo de visión que las larvas con gran aumento. Derrita una solución de agarosa al 2% en agua destilada doble usando un microondas.Vierta la agarosa fundida en un plato de plástico. Use una pipeta de transferencia de plástico para transportar las larvas anestesiadas al centro de un plato de plástico recubierto de agarosa al 2%. Oriente las larvas montadas con el cerebro hacia arriba para el acceso de la aguja.Ajuste el aumento del microscopio para que la estructura ventricular cerebral del pez cebra se muestre claramente en el campo de visión. Coloque la aguja cuidadosamente por encima del tectum cerebral. Limpie el área del cerebro con etanol al 70% y perfore la piel del cerebro del pez cebra con la punta de la aguja lentamente usando el micromanipulador.Presione el pedal para expulsar un nanolitro de 1X PBS o diferentes concentraciones de lipopolisacárido. Transfiera las larvas a un medio E3 limpio inmediatamente después de la inyección. Después de 24 horas, recoja las larvas para obtener imágenes microscópicas, ensayos de comportamiento locomotor y determinación de otros indicadores.Prepare una solución de agarosa baja en fusión al 1,5% en medio E3 y caliéntela en un microondas para formar un líquido transparente. Use una pipeta de transferencia de plástico limpio para transportar las larvas a un portaobjetos de vidrio y elimine la mayor cantidad de agua posible. Use una pipeta de transferencia de plástico para agregar una gota de agarosa baja en fusión al 1,5% a las larvas.Use una aguja de jeringa de un mililitro para orientar las larvas. Espere hasta que la agarosa se enfríe y se solidifique antes de comenzar a tomar imágenes. A las 24 horas después de la inyección ventricular cerebral de lipopolisacárido, proceda a determinar los marcadores de expresión génica.Use dos jeringas de un mililitro para separar las porciones de la cabeza de las larvas sin las regiones del ojo y el saco vitelino. Homogeneice la porción de la cabeza con 200 microlitros de reactivo de extracción de ARN utilizando un molinillo de tejidos a 11, 000 rotaciones por minuto durante cinco segundos, luego realice la extracción de ARN utilizando el método de isopropanol de cloroformo. Seque al aire el pellet de ARN durante cinco a 10 minutos, luego agregue 30 microlitros de agua libre de ARNasa para disolver el pellet de ARN.Sintetizar ADNc usando transcriptasa inversa con cebadores aleatorios como se describe en el manuscrito de texto. A continuación, realice la PCR en tiempo real en un sistema de qPCR utilizando un kit RT-qPCR disponible comercialmente para determinar la expresión de los genes diana. A las 24 horas después de la inyección ventricular cerebral de lipopolisacárido, transfiera las larvas de pez cebra a los pocillos de una microplaca cuadrada de 96 pocillos individualmente.Agregue 300 microlitros de medio E3 a cada pocillo y luego incube las larvas durante cuatro horas para aclimatarse a la placa de prueba. Transfiera la microplaca cargada de larvas a la caja de seguimiento del pez cebra. Encienda la fuente de luz e incube las larvas en la caja de prueba durante 30 minutos para aclimatarse al medio ambiente.Monitoree y registre el comportamiento del pez cebra utilizando un sistema automatizado de seguimiento de video. Registre 12 sesiones de cinco minutos cada una para larvas individuales de pez cebra y defina la distancia total como se describe en el texto manuscrito. Después del tratamiento durante 24 horas, de uno a cinco miligramos por mililitro de inyección cerebral ventricular de lipopolisacárido indujo una pérdida significativa de neuronas AR en el cerebro de TgEtvmat2: GFP larva de pez cebra en comparación con los grupos control y simulado.La línea transgénica elavl3:mCherry zebrafish demostró cambios significativos en la densidad integrada de fluorescencia de las neuronas cerebrales larvales cuando se inyectó con 2,5 a cinco miligramos por mililitro de lipopolisacárido, mientras que la inyección de lipopolisacárido de un miligramo por mililitro no mostró ningún efecto. Además, cinco miligramos por mililitro de lipopolisacárido indujeron una deficiencia de locomoción y disminuyeron la distancia total del movimiento del pez cebra durante un período de seguimiento de 60 minutos. La producción de óxido nitroso y la expresión de ARNm de citoquinas proinflamatorias en la cabeza de larvas de pez cebra aumentaron en 2,5 a cinco miligramos por mililitro de tratamiento con lipopolisacáridos en comparación con la expresión en los grupos control y simulado.La inyección de uno a cinco miligramos por mililitro de lipopolisacárido demostró el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro larvario del pez cebra, lo que resultó en un aumento significativo en el número de neutrófilos en la región cerebral del pez cebra Tgmpo: eGFP. El tamaño de apertura de las agujas y la cantidad de fuerza de inyección para la microinyección junto con la separación de la cabeza de los ojos y el cuerpo del pez cebra es crucial para este procedimiento.

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Neurociencia

El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la...

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

Este video muestra un método para cuantificar la infección fúngica en larvas de pez cebra. Las esporas de hongos se microinyectan en el ventrículo posterior del cerebro de las larvas y las larvas se incuban para permitir el desarrollo de la infección. Las larvas infectadas se recolectan a intervalos definidos y el progreso de la infección se evalúa mediante la enumeración de las unidades formadoras de colonias.

Una técnica para cuantificar la infección fúngica en larvas de pez cebra

El video muestra una técnica de dispositivo de herida y atrapamiento de pez cebra para observar la infección por patógenos fúngicos marcados con fluorescencia en larvas de pez cebra. La infección inicial atrae a los macrófagos y, a medida que la infección persiste, el reclutamiento de neutrófilos progresa en el lugar de la inyección.

Una técnica zWEDGI para visualizar larvas de pez cebra infectadas con patógenos fúngicos

El video muestra la microinyección de lipopolisacáridos (LPS) en el cerebro de larvas de pez cebra para inducir neuroinflamación. Las larvas se colocan en una placa revestida de agarosa, la aguja se inserta en los ventrículos cerebrales y se inyecta el LPS. El LPS inyectado desencadena una respuesta inmunitaria que conduce a la neuroinflamación.

Inducción de neuroinflamación en larvas de pez cebra con una inyección de lipopolisacárido

Aquí, presentamos un protocolo para la generación y obtención de imágenes de una infección bacteriana localizada en la vesícula ótica del pez cebra.

Imagen no invasiva de la respuesta inmune innata en un modelo de larvas de pez cebra de<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infección

Este protocolo describe la síntesis, caracterización y la inyección de péptidos monomérico amiloide-β42 para generar toxicidad amiloide en pez cebra adulto para establecer un modelo de la enfermedad de Alzheimer, seguido por análisis histológicos y la detección de agregaciones.

Toxicidad del amiloide β42 de modelado y la neurodegeneración en cerebro de pez cebra adulto

Presentamos un protocolo para aislar a las neuronas, macrófagos y microglia del cerebro de pez cebra larvas bajo condiciones fisiológicas y patológicas. Al aislamiento, el RNA se extrae de estas células a analizar su perfil de expresión génica. Este protocolo permite la colección de ARN de alta calidad para realizar análisis posteriores como qPCR y transcriptómica.

Aislamiento y extracción de ARN de las neuronas, macrófagos y Microglia de cerebros de larvas de pez cebra

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la lesión cerebral, los déficits locomotores y la neuroinflamación después del sangrado en el cerebro en larvas de pez cebra, en el contexto de hemorragia intracerebral humana (ICH).

El uso de larvas de pez cebra para estudiar las consecuencias patológicas de accidente cerebrovascular hemorrágico

Aquí, describimos la síntesis de liposomas cargados de drogas y su microinyección en peces cebra larvales con el propósito de dirigir la administración de fármacos a células de linaje de macrófagos.

Dirigirse a los medicamentos a los macrófagos de peces cebra sellos larvarios mediante la inyección de liposomas con drogas

Para modelar cómo las señales inflamatorias influyen en el neurodesarrollo en organismos genéticamente susceptibles, presentamos un protocolo para microinyectar IL-6 en el conducto de Cuvier (vena cardinal común) de larvas de pez cebra, permitiendo la inducción controlada de la inflamación y la evaluación de su impacto en el desarrollo en el contexto del complejo de esclerosis tuberosa (TSC).

Microinyección de interleucina-6 en el torrente sanguíneo de larvas de pez cebra con TSC para estudiar comportamientos similares a trastornos neuropsiquiátricos

Aprende a realizar microinyecciones ventriculares de lipopolisacárido en larvas de Danio rerio para evaluar neuroinflamación y neurotoxicidad. Este método permite estudiar respuestas inflamatorias cerebrales y probar fármacos antiinflamatorios.

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad (Video) | JoVE Journal

Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

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