Microinyecciones ventriculares cerebrales de lipopolisacárido en larvas de pez cebra para evaluar la neuroinflamación y la neurotoxicidad

La neuroinflamación es un jugador clave en diversos trastornos neurológicos. Por lo tanto, es de gran interés investigar y desarrollar modelos alternativos de neuroinflamación in vivo para facilitar los estudios del desarrollo patológico. La técnica descrita aquí es una excelente herramienta para comprender mejor los cambios patológicos en el cerebro a través de imágenes in vivo, y para evaluar rápida y eficientemente posibles medicamentos antineuroinflamatorios.

Prepárese para la inyección tirando de los capilares de vidrio con un extractor de micropipeta siguiendo el protocolo de cinco pasos para la extracción del tubo capilar de vidrio. Abra la punta de la aguja al tamaño apropiado en ángulo con fórceps. Llene la aguja con 0,1 mililitros de aceite mineral para asegurarse de que no haya burbujas.

Retire el tapón de rosca de la aguja de acero del aparato de microinyección. Alinee el orificio de la aguja de vidrio con la aguja de acero, luego apriete la tapa de rosca. Monte el aparato de microinyección de aguja cargado en un micromanipulador.

Ajuste la posición del aparato de microinyección para que el micromanipulador pueda mover el aparato de forma flexible bajo el microscopio. Descargue un volumen apropiado de aceite de parafina requerido para hacer que la aguja de acero ingrese al tubo de vidrio capilar. Deje caer la solución inyectable que consiste en PBS o lipopolisacárido en un portaobjetos de vidrio esterilizado con etanol al 70% y ajuste el aparato de microinyección para que la punta se inserte en la gota líquida.

Cargue aproximadamente dos microlitros de solución inyectable en la aguja. Configure el micromanipulador de modo que la punta de la aguja del aparato de microinyección esté en el mismo campo de visión que las larvas con gran aumento. Derrita una solución de agarosa al 2% en agua destilada doble usando un microondas.

Vierta la agarosa fundida en un plato de plástico. Use una pipeta de transferencia de plástico para transportar las larvas anestesiadas al centro de un plato de plástico recubierto de agarosa al 2%. Oriente las larvas montadas con el cerebro hacia arriba para el acceso de la aguja.

Ajuste el aumento del microscopio para que la estructura ventricular cerebral del pez cebra se muestre claramente en el campo de visión. Coloque la aguja cuidadosamente por encima del tectum cerebral. Limpie el área del cerebro con etanol al 70% y perfore la piel del cerebro del pez cebra con la punta de la aguja lentamente usando el micromanipulador.

Presione el pedal para expulsar un nanolitro de 1X PBS o diferentes concentraciones de lipopolisacárido. Transfiera las larvas a un medio E3 limpio inmediatamente después de la inyección. Después de 24 horas, recoja las larvas para obtener imágenes microscópicas, ensayos de comportamiento locomotor y determinación de otros indicadores.

Prepare una solución de agarosa baja en fusión al 1,5% en medio E3 y caliéntela en un microondas para formar un líquido transparente. Use una pipeta de transferencia de plástico limpio para transportar las larvas a un portaobjetos de vidrio y elimine la mayor cantidad de agua posible. Use una pipeta de transferencia de plástico para agregar una gota de agarosa baja en fusión al 1,5% a las larvas.

Use una aguja de jeringa de un mililitro para orientar las larvas. Espere hasta que la agarosa se enfríe y se solidifique antes de comenzar a tomar imágenes. A las 24 horas después de la inyección ventricular cerebral de lipopolisacárido, proceda a determinar los marcadores de expresión génica.

Use dos jeringas de un mililitro para separar las porciones de la cabeza de las larvas sin las regiones del ojo y el saco vitelino. Homogeneice la porción de la cabeza con 200 microlitros de reactivo de extracción de ARN utilizando un molinillo de tejidos a 11, 000 rotaciones por minuto durante cinco segundos, luego realice la extracción de ARN utilizando el método de isopropanol de cloroformo. Seque al aire el pellet de ARN durante cinco a 10 minutos, luego agregue 30 microlitros de agua libre de ARNasa para disolver el pellet de ARN.

Sintetizar ADNc usando transcriptasa inversa con cebadores aleatorios como se describe en el manuscrito de texto. A continuación, realice la PCR en tiempo real en un sistema de qPCR utilizando un kit RT-qPCR disponible comercialmente para determinar la expresión de los genes diana. A las 24 horas después de la inyección ventricular cerebral de lipopolisacárido, transfiera las larvas de pez cebra a los pocillos de una microplaca cuadrada de 96 pocillos individualmente.

Agregue 300 microlitros de medio E3 a cada pocillo y luego incube las larvas durante cuatro horas para aclimatarse a la placa de prueba. Transfiera la microplaca cargada de larvas a la caja de seguimiento del pez cebra. Encienda la fuente de luz e incube las larvas en la caja de prueba durante 30 minutos para aclimatarse al medio ambiente.

Monitoree y registre el comportamiento del pez cebra utilizando un sistema automatizado de seguimiento de video. Registre 12 sesiones de cinco minutos cada una para larvas individuales de pez cebra y defina la distancia total como se describe en el texto manuscrito. Después del tratamiento durante 24 horas, de uno a cinco miligramos por mililitro de inyección cerebral ventricular de lipopolisacárido indujo una pérdida significativa de neuronas AR en el cerebro de TgEtvmat2: GFP larva de pez cebra en comparación con los grupos control y simulado.

La línea transgénica elavl3:mCherry zebrafish demostró cambios significativos en la densidad integrada de fluorescencia de las neuronas cerebrales larvales cuando se inyectó con 2,5 a cinco miligramos por mililitro de lipopolisacárido, mientras que la inyección de lipopolisacárido de un miligramo por mililitro no mostró ningún efecto. Además, cinco miligramos por mililitro de lipopolisacárido indujeron una deficiencia de locomoción y disminuyeron la distancia total del movimiento del pez cebra durante un período de seguimiento de 60 minutos. La producción de óxido nitroso y la expresión de ARNm de citoquinas proinflamatorias en la cabeza de larvas de pez cebra aumentaron en 2,5 a cinco miligramos por mililitro de tratamiento con lipopolisacáridos en comparación con la expresión en los grupos control y simulado.

La inyección de uno a cinco miligramos por mililitro de lipopolisacárido demostró el reclutamiento de neutrófilos en el cerebro larvario del pez cebra, lo que resultó en un aumento significativo en el número de neutrófilos en la región cerebral del pez cebra Tgmpo: eGFP. El tamaño de apertura de las agujas y la cantidad de fuerza de inyección para la microinyección junto con la separación de la cabeza de los ojos y el cuerpo del pez cebra es crucial para este procedimiento.