Recolección de espermatozoides y análisis de espermatozoides asistido por computadora en el modelo teleósteo japonés Medaka (Oryzias latipes)

Esta técnica permite el muestreo de lecha de un pequeño pez modelo, Makaka japonés, y la investigación de su calidad de manera consistente. Específicamente la recolección de espermatozoides por masaje abdominal permite el muestreo repetido en el mismo pez ya que este enfoque no es invasivo. Además, esta técnica se puede aplicar para la criopreservación de espermatozoides Madaka.

La calidad del esperma es un indicador esencial del éxito de la fertilización y, por lo tanto, un parámetro importante para analizar en estudios de fisiología ecológica y productiva completa. Para comenzar, prepare una esponja de sujeción suave, cortándola para que quepa con aire de suficiencia en una placa de Petri. Corte una línea recta en el centro de la esponja, que sea lo suficientemente larga como para sostener al pez en su lado ventral hacia arriba.

Después de anestesiar el pescado, seque el abdomen del pescado limpiándolo suavemente con una toalla de papel. Coloque el pez en el canal de la esponja de retención húmeda con el lado ventral hacia arriba, de modo que sus branquias queden expuestas a la solución anestésica en la esponja. Si el área alrededor de la cloaca está húmeda, seque suavemente la parte inferior del abdomen con una toallita desechable.

Bajo un microscopio de disección, coloque la micropipeta con un tubo aspirador conectado contra la cloaca del pez. Ahora masajee el abdomen del pez apretando suavemente con un extremo romo pinzas suaves en un movimiento rostral a caudal. Para la recuperación de los peces, suéltelos de la esponja en el agua de recuperación previamente preparada antes de devolver los peces al sistema de acuario.

Transfiera la lecha recogida a un tubo que contenga solución activadora precalentada y solución de pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces utilizando el conjunto del tubo aspirador. Homogeneice suavemente los espermatozoides diluidos moviendo los tubos antes del análisis. Después de la eutanasia el pescado séquelo como se demostró anteriormente y coloque el pescado bajo un microscopio de disección con su lado lateral izquierdo hacia arriba.

Usando pequeñas tijeras de disección, corte un colgajo dorsalmente de la cloaca y luego a través de las costillas hasta las branquias para exponer los órganos internos. Localice los testículos y corte el accesorio en ambos extremos con pinzas finas. Retire los testículos y transfiéralos a un tubo preparado que contenga una solución activadora precalentada.

Use los fórceps para aplastar los testículos varias veces contra el costado del tubo para liberar los espermatozoides, que se pueden visualizar por la apariencia ligeramente turbia de la solución. Para comenzar el análisis, abra el software de análisis de espermatozoides y seleccione el módulo de motilidad. Establezca las configuraciones en el software para todos los parámetros.

Coloque un portaobjetos desechable precalentado de cámara de conteo de 20 micrómetros debajo del microscopio en una platina calentada, ajustada a 27 grados centígrados. Pipete la muestra en la cámara del portaobjetos hasta que se llene, pero sin llenarla demasiado. Limpie cuidadosamente el exceso de muestras de la entrada de la cámara para evitar el movimiento de deriva de las células en la solución.

Seleccione analizar para observar la muestra bajo el microscopio. Asegúrese de que el microscopio esté enfocado y seleccione analizar nuevamente para registrar los espermatozoides en el campo. Mueva la diapositiva a una nueva área de la muestra en el marco y repita el procedimiento para tres a cinco campos de visión diferentes, evitando burbujas de aire, masas celulares o artefactos.

Para ver los resultados, seleccione los resultados y haga doble clic en un campo para visualizar el campo individual o para verificar manualmente si hay espermatozoides mal etiquetados o no rastreados. Si es necesario, haga clic derecho en los espermatozoides individuales para volver a etiquetar la motilidad. En el presente estudio, se utilizó el análisis de espermatozoides asistido por computadora para registrar varios parámetros de velocidad y movimiento.

Los valores calculados incluyen el índice de rectitud, el índice de linealidad y el bamboleo. La osmolaridad de las soluciones de activación afectó la motilidad de los espermatozoides de la disección de los testículos. Los espermatozoides eran inmóviles en el agua del acuario, pero móviles en HBSS con alta y baja osmolaridad.

Sin embargo, la motilidad se reduce significativamente a 36 mili osmol por kilogramo, en comparación con soluciones de osmolalidad más altas. La motilidad también se vio afectada por el método de recolección de espermatozoides, en el que los espermatozoides son significativamente más móviles en el método de disección de testículos en comparación con el masaje abdominal. Además, un mayor porcentaje de las células eran progresivas y más células eran de movimiento medio o rápido.

El porcentaje de motilidad y progresividad es significativamente mayor en los espermatozoides almacenados a cuatro grados centígrados o en hielo, en comparación con el almacenamiento de 27 grados centígrados. Las condiciones ambientales y de vivienda también afectaron ligeramente la motilidad de los espermatozoides. No se observaron diferencias significativas en la motilidad de los espermatozoides en los espermatozoides recolectados después y antes del desove.

Los machos alojados sin hembras durante un mes mostraron una alta motilidad, pero la diferencia fue insignificante. Para la recolección de espermatozoides mediante masaje abdominal, se necesita entrenamiento para aprender la presión y el movimiento adecuados de los fórceps y para evitar la contaminación fecal. Esta técnica será muy útil para investigar, por ejemplo, los efectos de diversos contaminantes sobre la fertilidad masculina en estudios ecotoxicológicos, donde Medaka es un modelo de uso común.