Name: Amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL después de la infección por HSV-1 en células humanas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Aprende a detectar RIPK3 y MLKL fosforilados mediante amplificación de señal de tiramida en células HT-29 humanas infectadas con HSV-1. Este protocolo mejora la sensibilidad para estudiar la necroptosis inducida por ZBP1.

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Nos gustaría agradecer al VIB Bioimaging Core por la capacitación, el apoyo y el acceso al parque de instrumentos. J.N. cuenta con el apoyo de una beca de doctorado de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO). La investigación en el grupo J.M. fue apoyada por una beca Odysseus II (G0H8618N), EOS INFLADIS (40007512), una beca de investigación junior (G031022N) de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO), una beca de prueba de concepto para jóvenes investigadores de CRIG y por la Universidad de Gante. La investigación en el grupo P.V. contó con el apoyo de EOS MODEL-IDI (30826052), EOS INFLADIS (40007512), FWO senior research grants (G.0C76.18N, G.0B71.18N, G.0B96.20N, G.0A9322N), Methusalem (BOF16/MET_V/007), iBOF20/IBF/039 ATLANTIS, Foundation against Cancer (F/2016/865, F/2020/1505), CRIG y GIGG consorcios, y VIB.

1. Preparación de tiramida biotinilada
<ol><li>Preparar tiramida biotinilada a partir de biotina-tiramida. Para hacer una solución madre de 10 mM, disuelva 3,6 mg de tiramida de biotina en 1 ml de DMSO. Conservar el producto disuelto en alícuotas a -20 °C para preservar la calidad.</li>
</ol>2. Mantenimiento de células HT-29 en cultivo
NOTA: Los HT-29 que expresan ZBP1 se generaron por transducción con un lentivector27 que codifica ZBP1 humano.
<ol><li>Mantenga las células HT-29 que expresan ZBP1 en el medio 5A de McCoy suplementado con L-glutamina, piruvato de sodio y suero bovino fetal al 10% (de ahora en adelante denominado medio completo) y manténgalo en una incubadora a 37 ° C con 5% de dióxido de carbono. Lo ideal es utilizar celdas de un número de paso bajo (menos de 10). Deje que las células se recuperen durante al menos 5 días después del ciclo de descongelación antes del inicio del experimento.</li>
	<li>Para separar las células del matraz de cultivo, retirar el medio y lavar las células con 5 ml de PBS (precalentado a 37 °C). A continuación, añadir la cantidad adecuada de tripsina/EDTA (0,05% tripsina y 0,032% EDTA, respectivamente, precalentado a 37 °C) a las células (2 ml para un matraz T75, 3 ml para un matraz T175).</li>
	<li>Incubar las células con tripsina/EDTA durante un máximo de 10 minutos en una incubadora a 37 °C con 5% de dióxido de carbono. Después, golpee el matraz y compruebe visualmente si las células se desprendieron del matraz con un microscopio con un aumento objetivo de 4x-20x.</li>
	<li>Si las células no están completamente separadas, incubar durante otros 5 minutos a 37 °C. Cuando las células se desprendan, detener la reacción enzimática añadiendo 6 ml de medio completo al matraz.</li>
	<li>Reúna la suspensión celular en un tubo de 15 ml. Contar las células usando una tinción azul de tripano para evaluar la viabilidad; Se recomienda una dilución 1:5. Solo se procede con el experimento si la viabilidad de las células supera el 90%.</li>
</ol>3. Inicio del experimento, siembra y estimulación de las células
<ol><li>Sembrar 90.000 células HT-29 que expresan ZBP1 en medio completo en una placa de pozo de área de superficie de 1 cm² que permite microscopía de alta gama. Utilice un volumen final de 200 μL por pocillo.</li>
	<li>Incubar las células durante la noche a 37 °C con 5% de dióxido de carbono. Tenga en cuenta que es necesario sembrar algunos pozos adicionales para los controles de tinción, lo que se explica con más detalle en el paso 5.6.</li>
	<li>Cuando las células alcancen una confluencia del 70% -80%, agregue un estímulo inductor de necroptosis a las células. Aquí, las células se infectaron con HSV-1 ICP6mutRHIM (multiplicidad de infección [MOI] de 5, definida como unidades formadoras de placa (ufp) divididas por el número de células; la pfu se cuantificó mediante un ensayo de placa en células Vero) durante 6 h, 8 h o 10 h.</li>
	<li>Como control positivo para la inducción de necroptosis, estimular las células durante 4 h con un cóctel inductor de necroptosis que contenga 30 ng/mL de TNF, 20 μM del inhibidor pan-caspasa zVAD-fmk y 5 μM del SMAC mimético BV6.</li>
	<li>Como control negativo para la tinción de p-RIPK3 (S227), incluir GSK'840 (1 μM) para inhibir la actividad de la quinasa RIPK3 y prevenir la autofosforilación de S227. Idealmente, agregue el inhibidor en una condición no tratada y después de la estimulación de la necroptosis. El inhibidor se puede agregar simultáneamente con la infección viral.</li>
	<li>Preparar los estímulos en medio completo, precalentados a 37 °C. Use un volumen final de 200 μL por pocillo para todas las estimulaciones.</li>
</ol>4. Fijación de las celdas
<ol><li>Retire el medio y lave las células con 200 μL de 1x PBS. Luego, agregue 150 μL de PFA al 4% (ya equilibrado a temperatura ambiente) a las células e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. NOTA: Si está utilizando celdas que se desprenden fácilmente, la fijación de las celdas se puede optimizar de la siguiente manera. Retire 100 μL de medio del pozo, de modo que quede un volumen de 100 μL en la placa. Agregue 100 μL de PFA al 4% a las células. Incubar las celdas durante 5 min a temperatura ambiente. Después, retire el medio/fijador de los pocillos y reemplácelo con 150 μL de PFA al 4%. Incubar las células durante otros 20 minutos a temperatura ambiente para asegurar la fijación completa de las células.</li>
	<li>Después de la fijación, retire el PFA al 4% y lave las células 3x con 200 μL de 1x PBS. Las muestras pueden almacenarse en un exceso (>200 μL) de 1x PBS a 4 °C durante la noche hasta su posterior procesamiento.</li>
</ol>5. Permebilización y tinción primaria
<ol><li>Retire el PBS y agregue 100 μL de tampón de permeabilización (0.5% Triton X-100 en PBS). Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.</li>
	<li>Retirar el tampón de permeabilización y, posteriormente, lavar los pocillos con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar la cámara de imágenes con tampón de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante (20-30 movimientos de balanceo por minuto).</li>
	<li>Para evitar la unión inespecífica de anticuerpos primarios, añadir 100 μL de medio bloqueador e incubar a temperatura ambiente durante 2 h. Alternativamente, este paso de bloqueo puede ser reemplazado por el bloqueo con BSA al 3%, Triton-X-100 al 0,1% en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.</li>
	<li>Después de retirar el tampón de lavado, añadir los anticuerpos primarios a la cámara de imagen e incubar durante la noche a 4 °C. Use un volumen final de 100 μL para cubrir el pozo. Durante la incubación nocturna a 4°C, no coloque la cámara de imágenes sobre un agitador de laboratorio basculante. NOTA: Anti p-MLKL (S358; dilución: 1:200) y anti-p-RIPK3 (S227; dilución: 1:200) comparten al conejo como especie huésped y, por lo tanto, no deben combinarse en un pozo. Para controlar la infección viral, combine un anticuerpo primario contra una proteína viral de elección con p-MLKL (S358) o p-RIPK3 (S227). Aquí, las células se infectaron con infección por HSV-1 seguida de tinción ICP0 (dilución: 1:50, especie huésped: ratón).</li>
	<li>Tenga en cuenta los controles de tinción necesarios en este punto. Siempre incluya una condición sin anticuerpos primarios para visualizar el fondo potencial del paso de amplificación de TSA para establecer el umbral de enmascaramiento (consulte el paso 9). NOTA: En caso de un protocolo de tinción conjunta (por ejemplo, combinar p-MLKL [S358] o p-RIPK3 [S227] con un anticuerpo contra una proteína viral) use también tinciones individuales. El uso de tinciones individuales es importante para corregir la posible señal de sangrado en otros canales de imagen.</li>
</ol>6. Amplificación de señal de tiramida (TSA)
<ol><li>Retire la mezcla de anticuerpos primarios y lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.</li>
	<li>Retire el tampón de lavado y agregue 100 μL de anticuerpo secundario marcado con HRP reconociendo la especie de anticuerpo primario que necesita ser amplificado. Para amplificar la señal p-RIPK3 (S227) o p-MLKL (S358), añadir 100 μL de anti-conejo-HRP e incubar durante 30 min a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante. NOTA: Solo se amplificarán p-MLKL (S358) o p-RIPK3 (S227). La tinción de una proteína viral se visualizará utilizando un método estándar de tinción indirecta.</li>
	<li>Después, lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.</li>
	<li>En los siguientes pasos, agregue la tiramida biotinilada a la placa microscópica. Usando el grupo HRP acoplado a los anticuerpos secundarios, la reacción enzimática desencadenará la formación de radicales tiramida muy cerca del objetivo primario (aquí, p-MLKL [S358] o p-RIPK3 [S227]).</li>
	<li>Para activar la actividad enzimática de HRP, agregue un sustrato oxidante junto con la tiramida biotinilada. Para lograr esto, complemente el tampón TSA (ácido bórico 0.1 M [pH 8.5]) con 0.03 M H 2 O2; específicamente, tomar 5 mL de tampón TSA y agregar 5 μL de 30%H2O2.</li>
	<li>Ahora, diluya la biotina-tiramida en un tampón TSA suplementado conH2O2que va desde 1: 1,000 a 1: 20,000. NOTA: El factor de dilución de la biotina-tiramida debe optimizarse por lote.</li>
	<li>Retire el tampón de lavado de los pocillos y agregue biotina-tiramida diluida a los pocillos hasta un volumen final de 100 μL. Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en un agitador de laboratorio basculante.</li>
	<li>A continuación, lave los pocillos 3 veces con 100 μL de tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.</li>
</ol>7. Fluoróforos
NOTA: Dado que la señal del anticuerpo primario se convierte en un grupo biotina, p-MLKL (S358) y p-RIPK3 (S227) se visualizan utilizando estreptavidina acoplada a un fluoróforo (fluoróforo 568, dilución: 1:500). Además, los núcleos se tiñen con DAPI (5 μg/mL). Si se incluye una proteína viral en el protocolo de tinción, incluya un anticuerpo secundario adecuado marcado con fluorescencia contra la especie huésped de su anticuerpo primario. En los resultados representativos, se utilizó un ratón anti-ICP0. Como anticuerpo secundario se incluyó un antiratón de cabra acoplado al fluoróforo 633 (dilución: 1:1.000).
<ol><li>Hacer la mezcla de tinción en tampón de lavado (0,1% Triton X-100 en PBS) que contiene los anticuerpos y tinciones mencionados anteriormente. Retire el tampón de lavado, agregue 100 μL de mezcla para tinción e incube a temperatura ambiente durante 1 h en un agitador de laboratorio basculante. Mantenga la cámara de imágenes protegida de la luz desde este paso en adelante.</li>
	<li>A continuación, lave los pocillos 2x con tampón de lavado (0.1% Triton X-100 en PBS). Incubar los pasos de lavado durante 5 minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.</li>
	<li>Finalmente, enjuague los pozos 2x con 1x PBS. Almacene las muestras en un exceso (> 200 μL) de 1x PBS hasta obtener imágenes. Alternativamente, sumerja las muestras en un medio de montaje para preservar la tinción. La cámara de imágenes ahora está lista para ser visualizada en un microscopio confocal.</li>
</ol>8. Obtención de imágenes con un microscopio confocal
<ol><li>Encienda el microscopio confocal y los láseres al menos 10 minutos antes de la toma de imágenes.</li>
	<li>Utilice un objetivo de inmersión para la sensibilidad. Preferiblemente, use un aumento objetivo de 40x o 63x. Antes de obtener imágenes, limpie los objetivos de inmersión con un limpiador de lentes utilizando bolas de algodón adecuadas. Los objetivos sucios (por ejemplo, debido al polvo) pueden dar lugar a imágenes de menor calidad.</li>
	<li>Coloque una cantidad excesiva de aceite en la parte inferior de la cámara de imágenes. Además, agregue una gota de aceite en el objetivo de elección.</li>
	<li>Coloque la cámara de imágenes en el microscopio. Encuentre el campo de enfoque mediante la tinción DAPI o mediante imágenes de campo claro. Si es necesario, muévase alrededor de la cámara de imágenes para garantizar la distribución adecuada del aceite de inmersión.</li>
	<li>Configure las pistas de imágenes necesarias en el microscopio. Dependiendo del microscopio, los siguientes pasos pueden variar (Tabla 1). NOTA: Al configurar las pistas de imágenes, programe las pistas para que la tinción nuclear se mida al final. El láser de 405 nm puede contribuir al fotoblanqueo y, por lo tanto, a la pérdida de señal específica en todos los canales.</li>
	<li>Para analizar una celda completa para detectar la presencia de p-RIPK3 (S227) o p-MLKL (S358), mida pilas z que abarquen la altura de la celda. Aquí, las pilas z se hicieron de 40 cortes cada 0,16 μm, lo que resultó en un rango de 6,22 μm.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Pista</td>
			<td>Láser</td>
			<td>Divisor de haz</td>
			<td>Filtro</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">pRIPK3 (S227) /pMLKL (S358)</td>
			<td rowspan="2">561</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 570-620 + LP645</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS SP615</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Gen viral: ICP0</td>
			<td rowspan="2">633</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + LP605</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633 + SBS LP570</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Núcleo: DAPI</td>
			<td rowspan="2">405</td>
			<td>MBS -405 +</td>
			<td rowspan="2">BP 420-480 + BP 495-550</td>
		</tr><tr><td>MBS 488/561/633</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Pistas de imágenes para la visualización celular.
9. Análisis y cuantificación de datos
<ol><li>Cargue las imágenes microscópicas en el software. Utilice el enfoque extendido para visualizar toda la información de la pila z en una imagen 2D.</li>
	<li>A continuación, programe el protocolo de análisis para extraer la siguiente información: el número de células por imagen, la suma de vóxeles que muestran la tinción p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+. Un vóxel representa un volumen tridimensional, definido como el equivalente tridimensional de un píxel.</li>
	<li>Para cuantificar el número de células por imagen, segmente el núcleo. Para reducir el ruido en los resultados de segmentación, agregue una limitación de tamaño a la segmentación (>100 μm³). El número de núcleos segmentados representa el número de células en la imagen.</li>
	<li>Para cuantificar la cantidad de vóxeles p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+, programe una segmentación basada en umbrales. Establezca el umbral para que no se capte ninguna señal en las imágenes sin anticuerpos primarios (NP).</li>
	<li>Adapte aún más el umbral utilizando las imágenes de la condición simulada no tratada. Para garantizar la detección sensible del aumento de la señal debido a la estimulación de la necroptosis, limite la captación de vóxeles p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+ en condiciones simuladas estableciendo un umbral más alto. Siempre verifique el protocolo de análisis programado en varias imágenes de la condición simulada y la infección viral que induce necroptosis.</li>
	<li>Ejecute el análisis en todos los conjuntos de imágenes. Exporte la cuantificación de vóxel y la segmentación del núcleo en un archivo .txt para su posterior procesamiento en el software de hoja de cálculo.</li>
	<li>Haga una tabla dinámica de los datos que muestre el nombre de la imagen, la cuantificación del núcleo y la suma de los vóxeles detectados.</li>
	<li>A continuación, divida la suma de los vóxeles positivos por el recuento de celdas en la imagen. Esto da como resultado un valor relativo de vóxeles positivos por célula. Para visualizar el aumento del pliegue, divida el valor relativo de p-RIPK3 (S227)+ o p-MLKL (S358)+ vóxeles por celda por la mediana de la condición no tratada (simulacro).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo de tinción inmunofluorescente describe el uso de la amplificación de señal de tiramida (TSA) para aumentar la sensibilidad a los eventos de señalización de la vía de señalización necropótica humana que son difíciles de detectar, incluida la fosforilación de RIPK3 y MLKL26. La inclusión de un paso TSA mejora significativamente el umbral de detección de p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) y aumenta la sensibilidad del esfuerzo p-MLKL (S358). TSA reveló una señal p-RIPK3 (S227) ya presente ...

La proteína quinasa 3 de serina/treonina que interactúa con receptores (RIPK3) y la quinasa de linaje mixto similar a un dominio (MLKL) son reguladores centrales de la muerte celular necrótica 1,2. La necroptosis es una forma lítica e inflamatoria de muerte celular regulada involucrada en la inmunidad antiviral y la autoinflamación. La necroptosis de las células infectadas por virus detiene inmediatamente la replicación del virus. La lisis celular después de la inducción de necroptosis también libera patrones moleculares asociados al daño, que estimulan la inmunidad antiviral 3,4. La necroptosis se inicia por la activación de RIPK3 después de interacciones mediadas por motivos de interacción homotípica RIP (RHIM) con una de las tres moléculas activadoras aguas arriba: RIPK1 (sobre el compromiso del receptor TNF 1 [TNFR1]), β inductor de interferón inductor de adaptador que contiene dominio TIR (TRIF; en el compromiso de los receptores 3 y 4 tipo Toll), o el sensor antiviral de ácido nucleico Z-DNA proteína de unión al ADN 1 (ZBP1)1,2 . La señalización de necroptosis procede a través de una serie de eventos de fosforilación que comienzan con la autofosforilación de RIPK3. La autofosforilación de RIPK3 humana en serina (S)227 dentro de su dominio quinasa es un requisito previo para la necroptosis al permitir la interacción con MLKL y se usa comúnmente como un marcador bioquímico para la activación de RIPK3 humana y la muerte celular necrótica 1,5. Una vez activado, RIPK3 fosforila el bucle de activación de MLKL en treonina (T)357 y S3581. Esto provoca un cambio en la conformación MLKL, lo que resulta en la exposición del dominio del haz de cuatro hélices N-terminal. MLKL luego oligomeriza y trafica a la membrana celular donde forma un poro a través de la inserción de los cuatro haces helicoidales expuestos en la bicapa lipídica, lo que finalmente conduce a la muerte celular 2,6.
ZBP1 es un sensor de ácido nucleico antiviral que reconoce los ácidos nucleicos zurdos en forma Z, incluido el ARN bicatenario en la conformación Z (ARN Z). La unión al ARN Z se produce a través de dos dominios Zα posicionados en el extremo N de ZBP1. Se cree que el ARN-Z que se acumula durante la infección por virus de ARN y ADN afecta directamente a ZBP1 7,8. ZBP1 activado recluta RIPK3 a través de sus RHIM centrales e induce la muerte celular regulada, incluyendo necroptosis 9,10. Los virus han adoptado numerosos mecanismos de escape para contrarrestar la necroptosis de la célula huésped inducida por ZBP111. Por ejemplo, la subunidad 1 de la ribonucleótido reductasa del virus del herpes simple 1 (HSV-1), conocida como ICP6 y codificada por UL39, alberga RHIM en su extremo N que interfiere con la activación de RIPK3 mediada por ZBP1 en células humanas12,13,14,15. ZBP1 no sólo restringe la replicación viral, sino que los estudios en ratones han demostrado que la activación de ZBP1 causa enfermedades inflamatorias y estimula la inmunidad contra el cáncer 16,17,18,19,20,21. Los protocolos que detectan eventos de señalización que ocurren durante la necroptosis inducida por ZBP1 en células humanas son, por lo tanto, valiosos para evaluar el papel de ZBP1 en estos procesos.
La amplificación de señal de tiramida (TSA), también conocida como deposición catalizada del informador (CARD), se ha desarrollado para mejorar el límite de detección y la relación señal-ruido en inmunoensayos basados en anticuerpos. Durante la TSA, se puede usar cualquier anticuerpo primario para detectar el antígeno de interés. La peroxidasa de rábano picante (HRP), acoplada a un anticuerpo secundario, cataliza la acumulación local de radicales tiramida biotinilados en presencia de peróxido de hidrógeno. Estos radicales de biotina-tiramida activados reaccionan con residuos de tirosina proximales para formar enlaces covalentes. Los sustratos potenciales de tiramida-biotina incluyen el antígeno en sí, los anticuerpos primarios y secundarios y las proteínas vecinas. Por lo tanto, aunque TSA mejora significativamente la sensibilidad del ensayo, parte de su resolución espacial se pierde. En un paso final, las moléculas de biotina se detectan utilizando estreptavidina marcada con fluorescencia. La reacción HRP deposita muchas moléculas de tiramida-biotina en o cerca del antígeno de interés. Esto aumenta en gran medida el número de sitios de unión estreptavidina-fluorocromo, amplificando así en gran medida la sensibilidad del ensayo (Figura 1). Alternativamente, la tiramida se puede acoplar directamente a un fluorocromo, eliminando la necesidad de fluoróforos acoplados a estreptavidina. La inmunohistoquímica de proteínas y la hibridación in situ ADN/ARN estuvieron entre los primeros métodos mediante los cuales se empleó TSA para mejorar las intensidades de señal22,23. Más recientemente, la TSA se ha combinado con la citometría de flujo intracelular24 y la espectrometría de masas25.
Aquí, presentamos un protocolo para detectar serina 227 fosforilada humana RIPK3 (p-RIPK3 [S227]) y MLKL humana fosforilada (p-MLKL [S358]) tras la activación de ZBP1 por infección por HSV-1 utilizando microscopía de inmunofluorescencia. Utilizamos una línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano HT-29 sensible a la necroptosis que se transdució para expresar de manera estable ZBP1 humano. Estas células fueron infectadas con una cepa HSV-1 que expresa una proteína ICP6 mutante (HSV-1 ICP6mutRHIM) en la que cuatro aminoácidos centrales dentro del RHIM viral (VQCG) fueron reemplazados por alaninas (AAAA), lo que hace que el ICP6 no pueda bloquear la necroptosis mediada por ZBP113,14,15. Para superar el problema de la baja relación señal-ruido de los anticuerpos actualmente disponibles comercialmente dirigidos contra p-RIPK3 y p-MLKL en inmunotinción26, realizamos un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) (Figura 1), que resulta en la detección robusta de p-RIPK3 humano (S227) y mejora la sensibilidad de detección de p-MLKL humano (S358) en un orden de magnitud.

<table><tbody><tr><td><Fuerte>Anticuerpos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-conejo HRP</td><td>Agilent Technologies Bélgica</td><td>K4002</td><td>Envision+ System-HRP Etiquetado Polímero anti-conejo</td></tr><tr><td>Cabra anti-ratón DyLight 633</td><td>Thermofisher</td><td>35513</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>HSV-1 ICP0 Santa</td><td>Cruz</td><td>sc-53070</td><td>Anticuerpo</td></tr> <tr><td>anti-ICP0 (HSV-1) de ratónSuero de ratón IAV-PR8</td><td>Producción propia</td><td>xx</td><td>Anticuerpo policlonal anti-IAV-PR8</td></tr><tr><td>de ratón pMLKL</td><td>Abcam</td><td>ab187091</td><td>Anticuerpo anti-MLKL-fosfo S358</td></tr><tr><td>de conejo pRIPK3 Abcam</td><td></td><td>ab209384</td><td>Anticuerpo anti-RIPK3-fosfo S227 de conejo</td></tr><tr><td><fluoróforos fuertes></fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher</td><td>D21490</td><td>Para visualizar el núcleo de las células</td></tr><tr><td>Estreptavidina acoplada a Alexa Fluor 568</td><td>Thermofisher</td><td>S11226</td><td>Para visularizar moléculas de biotina</td></tr><tr><td><fuerte>Compuestos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Sustrato oxidante, necesario para la actividad de HRP</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>SANBIO</td><td>AR1068</td><td>Para fijar/reticular las células</td></tr><tr><td>Biotinil-tiramida</td><td>R& D Systems</td><td>6241</td><td>Para amplificar la señal, sustrato HRP</td></tr><tr><td>BV-6</td><td>Selleckchem</td><td>S7597</td><td>BV6 IAP Inhibitor</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Para cultivo celular: para separar las células</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>8,0 g/L de NaCl</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,4 g/L de sal disódica de EDTA</td></tr><tr><td>EDTA 0,04%</td><td>Formulación</td><td></td> propia <td>1,1 g/L Na2HPO4</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L NaH2PO4</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L KCl</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>0,2 g/L de glucosa</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>TICO</td><td>FBS EU XXX</td><td>Para cultivo celular, mantenimiento del cultivo celular; Número de lote: 90439</td></tr><tr><td>GSK'840</td><td>Aobious</td><td>AOB0917</td><td>inhibidor de la quinasa RIPK3</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td>Para el cultivo celular, el mantenimiento del cultivo celular</td></tr><tr><td>MAXblock</td><td>Active Motif</td><td>15252</td><td>Solución bloqueante</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>10444402</tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td>Para el cultivo celular, mantenimiento del cultivo celular</td></tr><tr><td>TNF-& alpha;</td><td>Producción interna</td><td>:</td> <td>molécula de señalización, capaz de desencadenar la muerte celular en combinación con BV6 y zVAD</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Para permeabilizar las células</td></tr><tr><td>Azul de tripán</td><td>Merck</td><td>11732</td><td>Para el recuento de células, utilizado como marcador vivo/muerto al 0,1%</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4424</td><td>Para el cultivo celular: para separar las células</td></tr><tr><td>zVAD</td><td>Bachem</td><td>BACE4026865.0005</td><td>Z-Val-Ala-DL-Asp-fluorometilcetona</td></tr><tr><td><fuerte>Material</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;-Diapositiva 8 pocillo alto fondo de vidrio</td><td>iBidi</td><td>80807</td><td>Para cultivar las células</td></tr><tr><td>Algodón Preping Balls-tamaño mediano</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>71001-10</td><td>Para limpiar los objetivos</td></tr><tr><td>Immersol 518 F / 30 &deg; C</td><td>ZEISS</td><td>444970-9000-000</td><td>Para visualizar la muestra con grandes aumentos</td></tr><tr><td>Limpiador de lentes</td><td>ZEISS</td><td>000000-0105-200</td><td>Para limpiar los objetivos</td></tr><tr><td>LSM880 Microscopio</td><td></td><td></td> confocal Fast Airyscan <td>Para visualizar la muestra</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Office</td><td>xx</td><td>Para procesar los datos</td></tr><tr><td>Prisma 9</td><td>Graphpad</td><td>xx</td><td>Para analizar los datos: pruebas estadísticas y generación de gráficos</td></tr><tr><td>Volocity 6.3</td><td>Volocity</td><td>xx</td><td>Para realizar cuantificaciones</td></tr><tr><td>Zen black</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>Para adquirir y procesar imágenes</td></tr><tr><td>Zen blue</td><td>ZEISS</td><td>xx</td><td>Para visualizar imágenes</td></tr><tr><td>Viruses</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cepa HSV-1 (mutRHIM) F</td><td>producida por&nbsp; Dr. Jiahuai Han</td><td>en la replicación interna de</td><td>HSV-1 como desencadenante de la necroptosis; El dominio central RHIM de UL39/ICP6 está mutado (VQCG>AAAA)</td></tr><tr><td>HSV-1 (WT) Cepa F</td><td>producida por el Dr. Jiahuai Han</td> en <td>la replicación interna</td><td>HSV-1 (WT) como control negativo para la inducción de la necroptosis (inhibición de ICP6)</td></tr><tr><td>IAV PR8</td><td>en stock interno</td><td>en la replicación interna</td><td>IAV como desencadenante de la necroptosis</td></tr></tbody></table>

amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de zbp1 de ripk3 y mlkl después de la infección por hsv-1 en células humanas

Tyramide Signal Amplification for the Immunofluorescent Staining of ZBP1-Dependent Phosphorylation of RIPK3 and MLKL After HSV-1 Infection in Human Cells

La quinasa Receptor-interacción serina/treonina proteína quinasa 3 (RIPK3) y su sustrato mixto de linaje quinasa similar a dominio (MLKL) son reguladores críticos de necroptosis, una forma inflamatoria de muerte celular con importantes funciones antivirales. La autofosforilación de RIPK3 induce la fosforilación y activación de la proteína verdugo formadora de poros de la necroptosis MLKL. El tráfico y oligomerización de MLKL fosforilada en la membrana celular da lugar a la lisis celular, característica de la muerte celular necroptótica. El sensor de ácido nucleico ZBP1 se activa uniéndose al ARN bicatenario zurdo en forma Z (ARN-Z) después de la infección con virus de ARN y ADN. La activación de ZBP1 restringe la infección por virus al inducir la muerte celular regulada, incluida la necroptosis, de las células huésped infectadas. La microscopía de inmunofluorescencia permite la visualización de diferentes pasos de señalización aguas abajo de la necroptosis mediada por ZBP1 por célula. Sin embargo, la sensibilidad de la microscopía de fluorescencia estándar, utilizando anticuerpos fosfoespecíficos disponibles comercialmente contra RIPK3 y MLKL humanos, impide la obtención de imágenes reproducibles de estos marcadores. Aquí, describimos un procedimiento de tinción optimizado para serina (S) fosforiladas RIPK3 (S227) y MLKL (S358) en células humanas HT-29 infectadas con el virus del herpes simple 1 (HSV-1). La inclusión de un paso de amplificación de señal de tiramida (TSA) en el protocolo de tinción inmunofluorescente permite la detección específica de S227 fosforilado RIPK3. Además, TSA aumenta en gran medida la sensibilidad de la detección de MLKL fosforilado S358. Juntos, este método permite la visualización de estos dos eventos críticos de señalización durante la inducción de la necroptosis inducida por ZBP1.

La detección inmunofluorescente de la fosforilación de MLKL y especialmente de la fosforilación de RIPK3 en células humanas es técnicamente desafiante26. Aquí presentamos un protocolo de tinción mejorado para p-RIPK3 (S227) y p-MLKL (S358) humanos tras la activación de ZBP1. El protocolo incluye un paso TSA para mejorar el límite de detección y la sensibilidad de las señales fluorescentes. Para validar el método, se realizó una comparación lado a lado de la inmunofluorescencia mediada por TSA con ...

La amplificación de la señal de tiramida durante la tinción inmunofluorescente permite la detección sensible de RIPK3 y MLKL fosforilados durante la necroptosis inducida por ZBP1 después de la infección por HSV-1.

Amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL después de la infección por HSV-1 en células humanas

The kinase Receptor-interacting serine/threonine protein kinase 3 (RIPK3) and its substrate mixed lineage kinase domain-like (MLKL) are critical ...

La visualización robusta de RIPK3 y MLKL fosforiladas, dos eventos de señalización clave durante la inducción de necroptosis, ha sido técnicamente desafiante. El protocolo de amplificación de tiramida presentado permite la detección sensible de estas dos moléculas. El paso de amplificación de la señal reduce el umbral de detección, lo que permite una detección robusta y reproducible de RIPK3 y MLKL fosforilados.Comience a sembrar las 90, 000 células HT-29 que expresan ZBP1 en el medio 5A de McCoy de fuerza completa en una placa de pozo de área de superficie cuadrada de un centímetro, lo que permite una microscopía de alta gama. Utilice un volumen final de 200 microlitros por pozo. Incubar las células durante la noche a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono.Una vez que las células alcanzan el 70 al 80% de confluencia, infectar las células en 200 microlitros precalentados, medio McCoy's 5A de fuerza completa que contiene el virus del herpes simple uno, codificando un borde mutante ICP6 en una multiplicidad de infección de cinco. Incubar las células con el virus durante nueve horas para inducir necroptosis. Como control positivo para la inducción de necroptosis, estimule las células durante cuatro horas con 200 microlitros de cóctel precalentado que induce necroptosis.Como control negativo, agregue 22 microlitros de 10 micromolares GSK840 precalentados a 37 grados centígrados para inhibir la actividad de la quinasa RIPK3. Incluya este inhibidor en una condición no tratada y después de la estimulación de necroptosis para prevenir la autofosforilación de la serina 227. Para fijar las células, retire el medio y lave las células con 200 microlitros de PBS.Luego retire el PBS y agregue 150 microlitros de paraformaldehído al 4% equilibrado a temperatura ambiente. Incubar las células a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la fijación, retire el 4% de paraformaldehído y lave las células tres veces con 200 microlitros de PBS.Las muestras se pueden almacenar en exceso de PBS a cuatro grados centígrados durante la noche hasta su posterior procesamiento. Retire el PBS de la placa e incube las células con 100 microlitros de tampón de permeación a temperatura ambiente durante 30 minutos en un agitador de laboratorio basculante. Después de la incubación, retire el tampón de permeabilización y lave las células con 100 microlitros de tampón de lavado.Incubar la cámara de imágenes con tampón de lavado durante cinco minutos a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante. Para evitar la unión no específica de anticuerpos primarios, incube la placa con 100 microlitros de medio de bloqueo a temperatura ambiente durante dos horas en un agitador de laboratorio basculante. A continuación, lave los pocillos tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado con cinco minutos de incubación a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante.Después de retirar el tampón de lavado, agregue 100 microlitros de anticuerpos primarios a la cámara de imágenes. Asegúrese de incluir una condición sin anticuerpos primarios para visualizar el fondo potencial de la amplificación de la señal de tiramida y establecer el umbral de enmascaramiento. Incubar la cámara durante la noche a cuatro grados centígrados.Retire la mezcla primaria de anticuerpos y lave los pocillos tres veces con 100 microlitros de tampón de lavado con cinco minutos de incubación a temperatura ambiente en un agitador de laboratorio basculante. Después de retirar el tampón de lavado, incubar las células con 100 microlitros de anticuerpo secundario marcado con HRP, reconociendo la especie del anticuerpo primario que se amplificará durante 30 minutos en un agitador de laboratorio basculante. Durante la incubación de anticuerpos, prepare la mezcla de tiramida biotinilada.Para desencadenar la actividad enzimática de HRP, agregue un sustrato oxidante al tampón TSA antes de usarlo. A continuación, diluir la tiramida biotinilada en el tampón TSA preparado utilizando la dilución optimizada. Después de la incubación con anticuerpos secundarios marcados con HRP, lave los pocillos tres veces con tampón de lavado con cinco minutos de incubación en un agitador de laboratorio basculante.Después de retirar el tampón de lavado del pozo, agregue biotina-tiramida diluida al pozo hasta un volumen final de 100 microlitros. Incubar la reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos en un agitador de laboratorio basculante, seguido de tres lavados tampón. Prepare la mezcla de tinción que contiene el anticuerpo secundario, la estreptavidina acoplada y la tinción nuclear y el tampón de lavado.Retire el tampón de lavado e incube la placa con 100 microlitros de mezcla de tinción a temperatura ambiente durante una hora en un agitador de laboratorio basculante. Mantenga las cámaras de imágenes protegidas de la luz desde este paso en adelante. Después de la tinción, lave consecutivamente dos veces con tampón de lavado y enjuague los pocillos dos veces con PBS.Almacene las muestras en exceso de PBS a cuatro grados centígrados para preservar la tinción hasta la obtención de imágenes. La cámara de imágenes ahora está lista para ser visualizada en un microscopio confocal. La inclusión de la amplificación de la señal de tiramida permitió la detección robusta de RIPK3 fosforilada en serina 227 en el citosol del virus del herpes simple uno que codifica una célula infectada con ICP6 mutante en el borde.Una potencia láser del 2% fue suficiente para la detección sensible. En la inmunofluorescencia indirecta estándar, una mayor potencia láser seguía siendo insuficiente para la detección de fosfo-RIPK3. En la cuantificación de las imágenes tridimensionales de la pila Z, las células infectadas mostraron un aumento de aproximadamente 20 veces de vóxeles positivos para RIPK3 fosforilada sobre células tratadas simuladamente.El aumento de la tinción fosfo-RIPK3 de las células infectadas con el virus del herpes simple de tipo salvaje en comparación con las células tratadas con simulacros indicó que el dominio del borde de ICP6 no puede bloquear completamente la fosforilación de RIPK3 en serina 227. GSK840 se une al dominio quinasa de RIPK3 y previene la fosforilación de RIPK3 en la serina 227 tras la activación de ZBP1, confirmando la especificidad del método de detección de fosfo-RIPK3 mediado por amplificación de señal de tiramida. Las células tratadas simuladas mostraron una tinción citosólica baja ligeramente puntuada de la fosforilación de MLKL en la serina 358, mientras que se detectó una fuerte tinción en el citosol, el núcleo y la membrana plasmática de las células infectadas.La inmunofluorescencia indirecta estándar requirió una potencia láser del 40% para la detección específica de una señal de fosfo-MLKL en las células infectadas. Por el contrario, la amplificación de la señal de tiramida aumentó la sensibilidad de detección de fosfo-MLKL, reduciendo así la potencia láser necesaria al 6%La cuantificación de la imagen de la pila Z 3D mostró un aumento de aproximadamente 90 veces en el número de vóxeles positivos para fosfo-MLKL utilizando amplificación de señal de tiramida, en comparación con un aumento de siete veces utilizando el método estándar, lo que indica un umbral de detección mejorado y sensibilidad para fosfo-MLKL. Similar al virus del herpes simple uno, la infección por el virus de la influenza A desencadenó necroptosis dependiente de ZBP1.La amplificación de la señal de tiramida permitió la detección robusta de fosfo-RIPK3 y fosfo-MLKL, lo que indica necroptosis. Para interpretar la tinción confocal, se deben incluir varios controles de tinción. Esto implica una condición no primaria, manchas individuales, así como un control positivo.Al adaptar este protocolo, se pueden amplificar múltiples objetivos utilizando TSA secuencial. Esto permitiría la detección de RIPK3 y MLKL fosforilados dentro de la misma célula. La detección sensible de biomarcadores de necroptosis puede ser reveladora para la investigación en curso de ZBP1 sobre autoinflamación o infección por virus en la que las vías de muerte celular dependientes de ZBP1 ejecutadas aún deben confirmarse como necroptosis, apoptosis o piroptosis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

La migraña y su transformación a la migraña crónica es una carga enorme de salud en la necesidad de mejorar las opciones de tratamiento. Tratamos de definir la forma en la señalización neuronal inmune modula la susceptibilidad a la migraña, el...

Modelado neuronal de señalización inmune de la migraña episódica y crónica mediante la depresión propagada In Vitro</em

En este artículo se describe un método para visualizar la formación de una sinapsis virológica de VIH-1 sobre de cristal inducido por el apoyo bicapas planas de reflexión total interna de fluorescencia (TIRF) microscopía. El método también se puede combinar con la tinción de inmunofluorescencia para detectar la activación y la redistribución de las moléculas de señalización que se producen durante el VIH-1 sobre inducida por la formación de sinapsis virológicas.

Imagen del VIH-1 sobre inducida sinapsis virológica y señalización en la bicapa lipídica sintéticas

La compartimentación de las proteínas, ya sea dentro de la membrana plasmática o en lugares intracelulares es un mecanismo de regulación que pueden influir mucho en los resultados de señalización, por lo que, para comprender la señalización es importante estudiar el comportamiento espacial y temporal de las proteínas implicadas. Se describe aquí un sistema de microscopía TIRF base para estudiar la transducción de señal en las células T, pero es ampliamente aplicable.

Una técnica de microscopía TIRF en tiempo real, imágenes simultáneas de la TCR y sus proteínas asociadas de señalización

Este video muestra un método para monitorear la proteína celular infectada 0, el tráfico de ICP0 en la infección por el virus del herpes simple-1. Después de la síntesis de novo, ICP0 se transloca al núcleo, luego se mueve al citoplasma durante la progresión de la infección. La microscopía de inmunofluorescencia revela y analiza la localización subcelular de la proteína, ofreciendo información sobre su tráfico a través de las fases de la infección.

Una técnica de inmunofluorescencia para la localización de proteínas virales en células infectadas

Hemos establecido un fluorescente en el protocolo de hibridación in situ para la detección de un genoma del virus de ADN persistente dentro de las secciones de tejido de modelos animales. Este protocolo permite el estudio de proceso de infección por codetection del genoma viral, sus productos de ARN, y proteínas virales o celulares dentro de las células individuales.

Detección del genoma y transcripciones de un virus ADN persistente en los tejidos neuronales por Fluorescente In situ La hibridación Combinado con inmunotinción

La piel es un tejido objetivo del patógeno humano virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1). Para explorar la ruta de invasión del VHS-1 en el tejido, establecimos un modelo de infección ex vivo de láminas epidérmicas murinas, que representan la capa más externa de la piel.

Ex Vivo Infección de murino Epidermis con virus herpes simplex tipo 1

Fábricas transcripcionales virales son estructuras discretas que se enriquecen con celular polimerasa de ARN II para aumentar la transcripción de genes virales durante la reactivación. Aquí, se describe un método para localizar sitios de transcripción activamente de cromatina viral en el espacio 3D nuclear por una combinación de la hibridación de RNA en situ y tinción de inmunofluorescencia.

Proyección de imagen funcional de fábricas de transcripción Viral mediante microscopia de fluorescencia 3D

ICP0 sufre translocación nuclear-a-citoplásmico durante la infección de HSV-1. No se conoce el mecanismo molecular de este evento. Aquí describimos el uso de microscopio confocal como una herramienta para cuantificar el movimiento ICP0 infección por HSV-1, que establece las bases para el análisis cuantitativo de desplazamiento ICP0 en futuros estudios mecanicistas.

Análisis temporal de la translocación Nuclear-a-citoplásmico de una proteína del Virus 1 del Herpes simple por inmunofluorescencia microscopia Confocal

Describimos un protocolo que utiliza la hibridación in situ por fluorescencia (FISH) para visualizar múltiples ARN herpesvirales dentro de células humanas infectadas lyéticamente, ya sea en suspensión o adherente. Este protocolo incluye la cuantificación de la fluorescencia produciendo una relación nucleocitotoplasmática y se puede extender para la visualización simultánea de proteínas huésped y virales con inmunofluorescencia (IF).

Fluorescencia cuantitativa en hibridación situ (FISH) e inmunofluorescencia (IF) de productos genéticos específicos en células infectadas por KSHV

En este estudio, presentamos estrategias basadas en inhibidores y siRNA para interferir con el flujo autofágico en las células dendríticas infectadas por el virus del herpes simple tipo-1 (HSV-1) basadas en monocitos.

electroporación de siRNA para modular la autofagia en el virus del herpes simple tipo 1-Células dendríticas derivadas de monocitos infectados

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.

Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Aprende a detectar RIPK3 y MLKL fosforilados mediante amplificación de señal de tiramida en células HT-29 humanas infectadas con HSV-1. Este protocolo mejora la sensibilidad para estudiar la necroptosis inducida por ZBP1.

Amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL después de la infección por HSV-1 en células humanas (Video) | JoVE Journal

Amplificación de la señal de tiramida para la tinción inmunofluorescente de la fosforilación dependiente de ZBP1 de RIPK3 y MLKL después de la infección por HSV-1 en células humanas

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