Name: El aislamiento de la linfa mesentérica fluida en ratones para cuantificar la cinética in vivo de la absorción de lípidos en la dieta y la secreción de quilomicrones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprende a aislar linfa mesentérica en ratones para medir la absorción de lípidos y la secreción de quilomicrones en tiempo real. Este protocolo reduce el estrés animal y mejora la supervivencia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Estamos extremadamente agradecidos a la Fundación de Fibrosis Quística (Premio Piloto y de Viabilidad 1810, a ABK), la Fundación Rainin (Premio Synergy, a PI GJ Randolph y Co-I ABK) y los Institutos Nacionales de Salud (R01DK118239, R03DK116011 a ABK) por su apoyo a estos estudios.

Todos los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el Comité Interno de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh [Protocolo # 20047008] y cumplen con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL6/J, de 8 a 14 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales). Todos los ratones fueron alojados en un ciclo de luz / oscuridad de 12 h con acceso ad libitum a comida y agua estándar.
1. Preparación de animales
<ol><li>Dependiendo del diseño experimental, alimenta a los ratones o déjalos ayunar. NOTA: Un ayuno nocturno es innecesario a menos que haya preocupaciones sobre las diferencias en la tasa de vaciado del estómago.</li>
	<li>Inducir la anestesia con gas isoflurano al 5% y asegurar una anestesia adecuada pellizcando la cola y el dedo del pie. Una vez anestesiados, mantenga a los ratones en un plano anestésico adecuado con gas isoflurano al 2% -3% y colóquelos con cinta adhesiva en la plataforma quirúrgica.</li>
	<li>Mantenga a los ratones calientes en una plataforma quirúrgica calentada que utilice agua tibia circulante (consulte la Tabla de materiales).</li>
</ol>2. Cirugía y diseño experimental
<ol><li>Comience la cirugía aplicando ungüento veterinario en los ojos, afeitando el abdomen y aplicando exfoliante quirúrgico antiséptico (consulte la Tabla de materiales) en el sitio quirúrgico. Esto esteriliza la incisión y reduce la generación de pelaje en el aire durante la incisión de la línea media.</li>
	<li>Mantenga un área de trabajo estéril utilizando instrumentos estériles, cortinas y otros equipos y suministros necesarios.</li>
	<li>Inyecte la primera dosis de carprofeno (ver Tabla de materiales) para aliviar el dolor (i.p.) a una dosis de 5 mg/kg.</li>
	<li>Agarre la piel con pinzas y haga una incisión abdominal en la línea media con tijeras pequeñas. Cortar hacia el esternón (nunca por encima) y cortar hasta la grasa inguinal. Luego, corte la capa muscular por separado con las tijeras. NOTA: Esterilice todo el equipo antes de usarlo.</li>
	<li>Usando el retractor, mueva las vísceras peritoneales fuera del camino hasta que el conducto linfático sea visible.</li>
	<li>Usando un Q-tip empapado en solución salina (consulte la Tabla de materiales), mueva el hígado hacia el lado superior derecho del cuerpo y los intestinos y el estómago a la izquierda del animal.</li>
	<li>Estire el duodeno hacia la izquierda transversalmente para exponer la arteria mesentérica superior y el conducto linfático intestinal.</li>
	<li>Prepare un tubo de cánula de 30-40 cm de longitud insertando una aguja roma en el tubo de cánula (consulte la Tabla de materiales) y enjuague una pequeña cantidad de heparina (1,000 U/L) a través del tubo con una jeringa de 1 ml. NOTA: El flujo linfático es asistido por la gravedad para fluir hacia abajo y hacia los tubos de recolección de microcentrífugas en hielo. Dependiendo de dónde se encuentre el cubo de hielo de recolección adyacente a la configuración quirúrgica, es posible que sea necesario ajustar la longitud del tubo de la cánula.</li>
	<li>Use tijeras para cortar un bisel en la punta del tubo de la cánula.</li>
	<li>Haga una incisión superficial con tijeras de iris (consulte la Tabla de materiales) en el conducto linfático aproximadamente a 5 mm de su aparición en el intestino delgado.</li>
	<li>Sostenga el tubo de la cánula con un par de pinzas finas e inserte suavemente el bisel de la punta en el conducto. NOTA: Es importante no empujar la cánula demasiado lejos en el conducto porque esto puede impedir el flujo linfático cuando los órganos retraídos vuelven a su posición original.</li>
	<li>El conducto linfático es demasiado frágil para las manipulaciones asociadas con atar el catéter con una sutura. En su lugar, use una gota de pegamento de cianoacrilato (consulte la Tabla de materiales) para pegar la cánula linfática en el conducto linfático mesentérico.</li>
	<li>Verifique si hay linfa blanca lechosa (si se usó sonda nasogástrica de aceite de oliva antes de la cirugía) o linfa clara (si los ratones han ayunado antes de la cirugía) que comienza a fluir inmediatamente a través de la cánula de la fístula linfática. NOTA: Verifique que la cánula linfática se haya colocado correctamente y que la linfa fluya; Continuar con la colocación de la cánula intraduodenal.</li>
	<li>Con una aguja de 18 G, perfore un orificio a través de la región pilórica del estómago posterior al esfínter pilórico.</li>
	<li>Inserte el tubo de infusión duodenal (consulte la Tabla de materiales) a través de ese orificio en el estómago hasta aproximadamente 1-2 mm más allá del esfínter pilórico en el duodeno.</li>
	<li>Asegurar mediante una ligadura de cuerda de bolso con sutura de seda 5-0 (ver Tabla de materiales) con una aguja en el estómago y sellar con una gota de pegamento de cianoacrilato para evitar fugas.</li>
	<li>Iniciar la infusión intraduodenal de glucosa al 5%-solución salina al 0,9% a 0,3 mL/h. NOTA: Cuando se usan ratones con pequeñas variaciones en el peso corporal que miden aproximadamente 25 g (~ 8 semanas de edad), la infusión de 0.3 ml / h de glucosa / solución salina es apropiada. Si los ratones son dramáticamente más grandes, la velocidad de infusión debe ajustarse hacia arriba para tener en cuenta el cambio en el peso corporal y el volumen sanguíneo.</li>
	<li>Reemplace los órganos en la cavidad corporal y suture (5-0) los tejidos musculares y cutáneos por separado. NOTA: La cánula linfática y la sonda de alimentación intraduodenal se exteriorizan a través de la misma incisión. No hay precedencia para separar los tubos con una sutura y no hay preferencia por el ángulo de la exteriorización de los tubos.</li>
	<li>Después de la cirugía, pero antes de retirar la anestesia, coloque a los ratones suavemente en sujeciones de acurrucamiento (consulte la Tabla de materiales) para limitar la motilidad. NOTA: Las restricciones de acurrucamiento evitan que los ratones agarren o giren la cabeza para masticar los puntos y tubos.</li>
	<li>Luego, coloque a los ratones en una caja de plexiglás transparente en un rotador con un balanceo suave, y caliente usando una almohadilla térmica de anfibios / reptiles disponible comercialmente con temperatura controlada adherida al costado de la caja de contención. Proporcione humidificación también en forma de recipientes de agua desionizada estériles en las esquinas de la caja de contención (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>A los 30 min antes de retirar el isoflurano, administrar a los ratones su segunda dosis de alivio del dolor (Buprenex, 0,1 mg/kg, i.p.).</li>
	<li>Dependiendo del experimento, proporcione a los ratones una infusión intraduodenal continua de glucosa al 5%, solución salina al 0,9% a una velocidad de 0,3 ml / h durante 1 h. NOTA: La solución salina al 5% de glucosa-0,9% se prepara utilizando una bolsa salina estéril (para uso humano, pH 7,4) de la farmacia y un frasco estéril para uso humano de dextrosa al 50%, siguiendo estrictas pautas de esterilidad. La solución debe hacerse fresca y desecharse si han pasado las fechas de caducidad proporcionadas en la bolsa de solución salina o en el frasco de dextrosa.</li>
	<li>Administrar a los ratones uno de los lípidos enumerados en la Tabla 1 como un lípido experimental a través de una cánula intraduodenal (ver Tabla de materiales). NOTA: Para todos los datos mostrados en la Figura 1, SMOFlipid (emulsión inyectable de lípidos al 20%, USP, ver Tabla de materiales) se infundió intraduodenalmente. Esta infusión en bolo lipídico tanto pre como post-intraduodenal reemplaza el líquido perdido que drena a través del conducto linfático y es un requisito absoluto. Los ratones ahora están listos para ser infundidos con una dosis experimental de lípidos.</li>
	<li>Realice la infusión lipídica clásica de un bolo de emulsión lipídica de 0,3 ml (emulsión inyectable de lípidos SMOF al 20%, USP) a través del tubo de infusión intraduodenal (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Después de la infusión en bolo de lípidos intraduodenales, cambie la infusión de nuevo a 5% de glucosa-0,9% de solución salina a 0,3 ml / h continuamente hasta el final del experimento.</li>
	<li>Recoja las muestras de linfa en tubos de microcentrífuga previamente pesados durante 60 minutos y mantenga la linfa en hielo. Pese los tubos por segunda vez para establecer el peso de la linfa que se secreta cada período de 60 minutos. NOTA: Espere recolectar aproximadamente 50-300 μL de linfa por hora, por ratón en el ~ 6 h después de un bolo lipídico de 0.3 ml.</li>
	<li>La linfa puede fluir hasta 6 h después de la infusión de lípidos. En el punto de tiempo de 6 h, eutanasia a los ratones a través de isoflurano y dislocación cervical. NOTA: Un cirujano y/o técnico de laboratorio debe estar presente para monitorear a los animales durante todo el experimento. Durante la observación, esté atento a los coágulos en el drenaje linfático y los cambios en el comportamiento de los animales que indican dolor / angustia. Si el conducto linfático está obstruido en cualquier momento durante el experimento, el experimento se termina y el animal es sacrificado. Técnicamente, el animal puede mantenerse vivo hasta 24 h después de la cirugía (según las reglas de cirugía de supervivencia de IACUC). Sin embargo, las tasas de supervivencia disminuyen con el tiempo, y 6 h es un período de supervivencia reproducible donde la absorción de lípidos todavía imita la fisiología in vivo , y el animal no está luchando con la supervivencia.</li>
	<li>Realizar la recolección de tejido terminal después de la eutanasia (paso 3.1). NOTA: La diferencia en los perfiles de absorción de lípidos en la dieta en ratones mantenidos durante 6 h o 24 horas después de la cirugía se probó recientemente44. Encontramos que el procedimiento de 24 horas reduce las tasas de supervivencia animal y la excursión de lípidos dietéticos a la linfa. Por estas razones, recomendamos encarecidamente el enfoque de 6 horas. Este diseño quirúrgico actualizado reduce la muerte innecesaria de animales y el potencial de angustia animal en el período postquirúrgico. Esto apoya un objetivo importante de la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio, que es el "Reemplazo, Reducción, Refinamiento" de animales [ref PMID: 21595115].</li>
</ol>3. Recogida del contenido luminal y del tejido mucoso
<ol><li>Al final del período de infusión de lípidos de 6 h, sacrifique a los ratones a través de isoflurano y dislocación cervical. Ate ambos extremos del estómago, el intestino delgado y el ciego con suturas 5-0 para evitar fugas del contenido luminal.</li>
	<li>Recoja el estómago, el ciego y el colon, y colóquelos en un tubo de vidrio de 15 ml. Divida el intestino delgado en tres o cuatro segmentos y recoja el contenido luminal enjuagando el tejido en 2-3 ml de PBS frío después de cortar longitudinalmente.</li>
	<li>Retire la mucosa intestinal que comprende las células epiteliales y la lámina propia asociada de la capa muscular raspando cada sección en 2-3 ml de PBS frío con una pinza curva.</li>
	<li>Colocar todos los tejidos, los aislados luminal y mucoso, y la capa muscular en tubos de vidrio y añadir 8 mL de CHCl 3:MeOH a cada tubo de 2:1 vol/vol CHCl3:MeOH.</li>
	<li>Determinar la radiactividad y/o las concentraciones de lípidos mediante el recuento de centelleo líquido y/o un kit de ensayo de triglicéridos (ver Tabla de materiales) después de la extracción de Folch45.</li>
</ol>4. Cromatografía en capa fina (TLC)
<ol><li>Extraer los lípidos totales de los aislados luminal y mucoso mediante una extracción de Folch modificada45.</li>
	<li>Seque los lípidos extraídos en el disolvente bajo un evaporador de nitrógeno y luego resuspenda en 2:1 vol/vol de CHCl3:MeOH antes de cargarlos en una placa de gel de sílice TLC (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Separe los lípidos usando un sistema solvente de éter de petróleo, éter etílico y ácido acético glacial (25:5:1 vol/vol/vol). Utilice vapor de yodo para la visualización de diferentes lípidos, incluidos los estándares.</li>
	<li>Raspa las manchas en la placa TLC correspondientes a monoglicéridos/fosfolípidos, diglicéridos, ácidos grasos, triglicéridos y éster de colesterol en viales de centelleo individuales antes de la adición de 4 ml del líquido de centelleo (ver Tabla de materiales) para el recuento de centelleo.</li>
	<li>Exprese los datos como un porcentaje de la dosis total de lípidos en bolo o como una fracción del lípido total detectado para cada muestra.</li>
</ol>5. Aislamiento y caracterización de quilomicrones
<ol><li>Transfiera las muestras de linfa combinadas del bolo postlipídico de 6 h (paso 2.29) a tubos de ultracentrífuga, mezcladas con NaCl al 0,9% (300-500 μL), y luego superponga cuidadosamente con un volumen apropiado de NaCl al 0,87% (300-500 μL).<ol><li>Ultracentrífuga (ver Tabla de materiales) las muestras a 110.000 x g a 4 °C durante 16 h. Recoger la fracción superior que contiene quilomicrones aislados y transferirlos a un nuevo tubo de microcentrífuga.</li>
	</ol></li>
	<li>Determine las concentraciones de triglicéridos, colesterol y apoB de quilomicrones siguiendo los pasos a continuación.<ol><li>Determine las concentraciones de triglicéridos y colesterol utilizando un kit de análisis de triglicéridos y colesterol (consulte la Tabla de materiales).</li>
		<li>Brevemente, incubar 2 μL de las muestras con 200 μL de reactivo enzimático a 37 °C durante 5 min en una placa de 96 pocillos. Lea la placa usando un lector de placas a 500 nm para triglicéridos y 600 nm para colesterol. NOTA: Para el cálculo de las concentraciones se utilizaron patrones y espacios en blanco. Las concentraciones de ApoB se determinaron utilizando el kit ELISA de ApoB de ratón (ver Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Determine el tamaño de partícula de quilomicrones.<ol><li>Use muestras frescas de quilomicrones a concentraciones de triglicéridos de alrededor de 40 mg / dL para imágenes TEM. Brevemente, coloque 5-10 μL de cada muestra en una rejilla TEM y séquela.</li>
		<li>Examine la rejilla con un microscopio electrónico de transmisión y capture imágenes. Mida los tamaños de las partículas de lipoproteínas y analícelas utilizando el software ImageJ (consulte la Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El procedimiento original de fístula linfática de 2 días fue descrito por Bollman et al.25 y practicado por el laboratorio de Patrick Tso durante los últimos 45 años 26,27. El protocolo presentado aquí es una poderosa adición a este método clásico y estándar de oro para identificar, cuantificar y comprender las secreciones quilosas únicas del intestino delgado, así como la dinámica in vivo de la absorción y el metabolismo de nutrientes en la dieta, las hormonas intestinales y la inmunidad intestinal.
Las ventajas de este modelo incluyen (1) la capacidad de muestrear continuamente la linfa mesentérica durante todo el período de alimentación y postprandial en lugar de muestreo estático en un punto de tiempo durante la absorción, digestión o secreción; (2) la medición de hormonas intestinales y citoquinas directamente en su compartimento fisiológico en lugar de en la sangre, donde se diluyen y degradan enzimáticamente17,44; (3) la capacidad de aislar, cuantificar y caracterizar las lipoproteínas secretadas por el intestino delgado después de la ingestión de una harina lipídica y la ausencia de lipasas endoteliales en la linfa mesentérica, lo que preserva las concentraciones de triglicéridos quilomicrones y la estructura de quilomicrones nativos46,47; (4) la capacidad de medir directamente la tasa de flujo linfático, la producción de triglicéridos y colesterol (u otros compuestos con infusión duodenal), la composición de quilomicrones y las concentraciones hormonales intestinales. Finalmente, este protocolo permite recolectar cantidades relativamente grandes de >50 μL de linfa cada hora durante un período de 6 horas. A medida que el líquido se repone con solución salina intraduodenal e infusión de glucosa, el modelo de fístula linfática mejora significativamente sobre otras técnicas de muestreo linfático y da como resultado grupos de linfa mesentérica que fluyen en lugar de estáticos. Como el volumen es un obstáculo importante para los enfoques lipidómicos, proteómicos y metabolómicos, esta es una fortaleza importante.
El protocolo de fístula linfática de ratón de 1 día descrito aquí tiene varias ventajas sobre el protocolo original de fístula linfática, incluida una reducción en el número total de animales experimentales de los protocolos de fístula linfática de 2 días descritos anteriormente26,27 debido a una mayor tasa de supervivencia después de la cirugía; una reducción en el tiempo experimental total de 2 días a un solo día; y, finalmente, una reducción en el período de recuperación para ratones de durante la noche (>18 h), donde puede ocurrir dolor irruptivo o malos resultados postquirúrgicos, a un período postoperatorio más manejable de ~ 6 h después de la cirugía.
Una característica de este protocolo de 1 día es el enfoque en consideraciones humanas y puntos finales. Estos deben tener la máxima prioridad: (1) los animales deben recibir líquidos de reemplazo intraduodenal o IV; (2) deben mantenerse calientes y lo más indoloros posible (con Buprenex y/o carprofeno postoperatorio, dependiendo del diseño experimental y la necesidad de evitar efectos antiinflamatorios); (3) sangrado, temblores, diarrea o signos de angustia son razones convincentes para un criterio de valoración humano. Según las estrictas pautas de IACUC, el isoflurano seguido de dislocación cervical es un buen punto final. Las tasas de supervivencia quirúrgica son ~ 70% para un solo día (en comparación con ~ 40% para la cirugía original de 2 días), pero los investigadores no deben dudar en terminar el experimento a un signo de angustia. Esto debe tenerse en cuenta al planificar el número de animales.
En términos de solución de problemas de esta técnica, la colocación exitosa de la cánula linfática es el principal cuello de botella en este procedimiento quirúrgico. Mientras practica la cirugía, ayuda a sonda nasogástrica al ratón con 0,3 ml de aceite de oliva aproximadamente 2 h antes de la cirugía. Esto causará la secreción de quilomicrones en el conducto linfático mesentérico, haciéndolo parecer "lechoso" y más visible. El azul de metileno también se puede usar, pero a menudo es menos obvio que el conducto linfático lechoso. Si después de la colocación de la cánula linfática y su colocación con pegamento, la linfa mesentérica fluye con éxito a través de la cánula hacia un recipiente de recolección, entonces se puede proceder con la colocación de un tubo de infusión duodenal. Ocasionalmente, la linfa puede no fluir continuamente, pero puede comenzar a fluir nuevamente cuando el animal se coloca en la mesa giratoria. Críticamente, tenga cuidado con los coágulos dentro del tubo linfático. Estos deben ser masajeados fuera de los tubos para evitar la presión de reflujo en el conducto linfático.
Además de la secreción de triglicéridos y la tasa de flujo linfático, esta técnica se puede utilizar para determinar la siguiente cinética de absorción de lípidos y las características de los quilomicrones:
Secreción de quilomicrones45,48,49 Inmediatamente después de una comida que contiene grasa, hay un aumento transitorio en los triglicéridos plasmáticos circulantes. Como los triglicéridos son inherentemente hidrofóbicos, primero deben emulsionarse para ser solubles en sangre50. Los enterocitos del intestino delgado desempeñan esta función y empaquetan triglicéridos dietéticos en partículas de emulsión de quilomicrones51. Los quilomicrones contienen colesterol y triglicéridos dietéticos en su núcleo, rodeados de fosfolípidos y apolipoproteínas, incluyendo apoB-48, apoA-I, apoA-IV y apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 es la proteína estructural esencial, y las otras apolipoproteínas tienen varias funciones requeridas para el metabolismo de quilomicrones y la eliminación de la sangre. Para determinar las características clave de los quilomicrones, incluido su contenido de triglicéridos y apolipoproteínas, se debe utilizar la técnica de fístula linfática de 1 día que se muestra aquí. La tasa de secreción de quilomicrones es el porcentaje de 3triglicéridos H infundidos que se secretan en la linfa y se miden por centelleo contando muestras de linfa por hora. Esto se puede combinar con la caracterización detallada de quilomicrones 48,49,56,57,58. Las muestras de linfa por hora se pueden combinar o mantener por separado. La linfa se transfiere a tubos de ultracentrífuga, se mezcla con NaCl al 0,9% y luego se superpone cuidadosamente con 300-500 μL de NaCl al 0,87%. A continuación, las muestras se centrifugan a 110.000 g a 4 °C durante 16 h. Las fracciones superiores que contienen quilomicrones aislados se recogen y se analizan para determinar las concentraciones de triglicéridos utilizando el kit de ensayo de triglicéridos. Brevemente, 2 μL del quilomicron (dilución 1:10) se incuban con 200 μL de reactivo enzimático a temperatura ambiente durante 10 min en una placa de 96 pocillos. La placa es leída por un lector de placas a 500 nm, y los patrones y espacios en blanco se utilizan para el cálculo de las concentraciones de triglicéridos. El tamaño de los quilomicrones puede determinarse mediante tinción negativa y microscopía electrónica de transmisión (TEM)14,29. Los triglicéridos y el colesterol se pueden cuantificar mediante ensayo químico y contenido de apolipoproteínas (apoB-48, A-I, C-II, C-III) mediante kits ELISA o Western blot.
Determinación del sitio primario de absorción de lípidos 48,59 Al aislar los compartimentos de células luminales y epiteliales del duodeno, yeyuno e íleon a las 6 h después de la infusión de 3 triglicéridos H o una comida mixta radiomarcada, se extrae el contenido de Folch para determinar qué cantidad del triglicérido 3 H seabsorbe a través de la membrana celular epitelial (normal) o se retiene en el lumen (anormal) a lo largo del intestino delgado48 . Estos estudios son particularmente impactantes si existen diferencias potenciales en la motilidad GI 60,61,62, si existe una hipótesis con respecto a los ácidos biliares (altamente activos durante la absorción de lípidos y reabsorbidos en el íleon)63,64,65,66, o si existe la preocupación de que los nutrientes estén siendo absorbidos en la ubicación anatómica incorrecta (íleon o incluso colon)67 ,68,69,70.
Identificación de mecanismos de tráfico de 3H-triglicéridos en células epiteliales absorbentes48 Esto se realiza calculando el porcentaje de 3 triglicéridos H hidrolizados a 3ácidos grasos libres de Hen la luz intestinal, absorbidos en la mucosa y reesterificados en triglicéridos 3 Hintracelulares antes de la secreción como quilomicrones. Este es un poderoso marcador de defectos de absorción / secreción, ya que se puede rastrear para mostrar el movimiento de los triglicéridos dietéticos en sus productos de degradación y el posterior envasado en quilomicrones. La expresión de ARNm de la maquinaria de absorción de ácidos grasos (CD36, FABPs, ACSLs), la vía de reesterificación (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) y las apolipoproteínas (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) pueden cuantificarse adicionalmente mediante RT-PCR.
Las aplicaciones futuras de esta técnica solo están limitadas por el interés en la diafonía entre el intestino y los órganos, el metabolismo, la inmunidad, la absorción de nutrientes, los contaminantes dietéticos ambientales o cualquier otra enfermedad con un papel en el sistema gastrointestinal. Es probable que muchos experimentos e hipótesis convincentes se hayan estancado debido a la dificultad para acceder al sistema linfático mesentérico crítico, y el objetivo de este protocolo visualizado es hacer que esta técnica esté más fácilmente disponible. Aislar los quilomicrones y la linfa mesentérica en la que residen inicialmente es una parte crítica de la comprensión del metabolismo de todo el cuerpo; El modelo de fístula linfática de ratón de 1 día es un poderoso modelo fisiológico para estudiar estos eventos.

La importancia fisiológica del sistema linfático mesentérico Los linfáticos mesentéricos han sido descritos de alguna forma desde ~300 a.C. cuando Herófilo describió el sistema portal hepático y todas las "venas absorbentes en los intestinos"1,2,3,4,5. Durante más de 1.700 años después de esta descripción inicial, una característica definitoria de los linfáticos intestinales fue la presencia de líquido lechoso en la linfa mesentérica poco después de una comida3. Ahora se sabe que la linfa lechosa que contiene quilomicron (linfa "quilosa") no drena en la vena porta y el hígado, sino que viaja a través de la cisterna quili hacia el conducto torácico y, en última instancia, se une a la sangre en la vena subclavia izquierda6. Debido a esta disposición anatómica, la linfa quilosa viaja primero a través del corazón y los pulmones antes de circular por el resto del cuerpo. Esto significa que el corazón y los pulmones obtienen un "primer paso" en las secreciones en la linfa mesentérica7.
Un papel importante de los linfáticos mesentéricos es su transporte de lípidos dietéticos desde el intestino delgado 8,9,10. Anatómicamente, quilomicrones, células inmunes intestinales 11,12,13,14, hormonas intestinales 15,16,17,18, antígenos 19,20,21, compuestos lipofílicos no quilomicrones 22,23 , y el exceso de líquido entra en los lacteales subyacentes a la membrana basal de los enterocitos y luego se concentran a través de los capilares linfáticos a los ganglios linfáticos mesentéricos. Es probable que haya muchos componentes linfáticos mesentéricos desconocidos, incluidos metabolitos, antígenos, contaminantes ambientales, nutrientes y moléculas de señalización.
Los componentes de la linfa mesentérica no se han identificado sistemáticamente, en gran parte debido a la dificultad de aislar la linfa mesentérica. El acceso a la linfa mesentérica siempre ha sido un desafío serio porque los conductos linfáticos son incoloros, y excepto después de una comida grasa cuando se vuelven quilosos y lechosos, los linfáticos mesentéricos contienen líquido linfático incoloro 6,8,9,10.
Métodos actuales y comunes para aislar la linfa intestinal No se puede acceder a la linfa mesentérica en humanos (excepto en circunstancias raras y extremas en las que se ha producido un traumatismo gastrointestinal grave)24. La recolección linfática in vivo es quirúrgicamente compleja y exigente. El procedimiento original de fístula linfática de 2 días fue descrito por Bollman et al.25 y ha sido mejorado y profesionalizado por el laboratorio de Patrick Tso durante los últimos 45 años 26,27. El procedimiento de fístula linfática permite a los investigadores recolectar linfa que fluye de animales conscientes durante un período de infusión de lípidos duodenales de 6 h.
El modelo de fístula linfática se ha utilizado principalmente en ratas para medir la tasa de flujo linfático, la producción de triglicéridos y colesterol (u otros compuestos con infusión duodenal), la composición de quilomicrones y las concentraciones hormonales intestinales. En menor medida, esta técnica también se puede utilizar en ratones, aunque la supervivencia quirúrgica y el volumen linfático sufren. Debido a las dificultades para ver los conductos linfáticos mesentéricos, los métodos históricos han incluido la linfa mesentérica canulante en animales más grandes como mini-cerdos28, ovejas29, cerdos30, perros31 y ratas17. Trabajar con estos modelos más grandes requiere muchos recursos y no permite estudios en modelos knock-in o knock-out.
También se han utilizado enfoques alternativos. Los quilomicrones pueden aislarse de la sangre en estado postprandial (aunque estos serán parcialmente hidrolizados por la lipoproteína lipasa plasmática)32,33,34,35. El conducto torácico también puede ser canulado, aunque la linfa recolectada allí contiene una mezcla de linfa mesentérica y drenaje linfático extraintestinal26,36. In vitro, las células Caco-2 secretan una partícula similar al quilomicron en respuesta al tratamiento con ácidos grasos, y estas células pueden ser cocultivadas con células endoteliales o vasculares linfáticas relevantes37,38. Se ha demostrado que los cultivos de organoides intestinales humanos y de ratón procesan lípidos apicales y secretan quilomicrones 39,40,41,42. Estos modelos son muy ventajosos y permiten conocimientos mecanicistas sobre la fisiología del intestino delgado, pero no pueden replicar la complejidad, los gradientes fisicoquímicos o el flujo linfático dinámico de los linfáticos mesentéricos in situ.
Ventajas del modelo de fístula linfática de ratón de 1 día presentado aquí Con respecto a estos otros métodos de aislamiento de lipoproteínas intestinales, la técnica de fístula linfática Tso Lab se ha considerado tradicionalmente la técnica estándar de oro para medir la absorción de nutrientes dietéticos en la linfa mesentérica. Esta técnica in vivo tiene la ventaja de capturar aspectos fisiológicos clave de la absorción de lípidos en la dieta: la apariencia dinámica de los compuestos durante el período de absorción, lo que requiere el muestreo repetido de linfa mesentérica que fluye en animales vivos con nutrientes duodenales. Esta técnica quirúrgica también mide las hormonas intestinales y las citoquinas directamente en su compartimento fisiológico en lugar de en la sangre, donde se diluyen y degradan enzimáticamente17,43.
Si la pregunta experimental requiere una comprensión de la dinámica de la secreción lipídica o la absorción dinámica y el metabolismo de cualquier compuesto o fármaco GI hidrófobo, entonces esta técnica no solo es apropiada sino que también es el único enfoque que interpola el movimiento del contenido luminal desde el intestino proximal al distal (estómago a colon) y desde la superficie apical a la basolateral (contenido luminal a través de enterocitos a lacteales y circulación portal). Como esta técnica emplea la entrega luminal de nutrientes a través del catéter intraduodenal, y debido a que la linfa mesentérica que fluye se desvía y se recolecta, todo el aparato de absorción está bajo control experimental y se puede usar para evaluar cualitativamente los perfiles de absorción del intestino delgado.
Presentado visualmente aquí por primera vez es una actualización importante del modelo de fístula linfática Tso Lab, que (1) reduce el tiempo experimental a un período de implantación quirúrgica y recolección experimental de 1 día; (2) mejora la supervivencia del ratón y las consideraciones de bienestar animal; y (3) aumenta la reproducibilidad del enfoque en ratones para aprovechar el poder de los modelos genéticos de ratón. Esta técnica debe considerarse un estándar de oro para todas las cuestiones experimentales de secreciones intestinales, lipoproteínas o absorción de lípidos en la dieta y es la mejor técnica para la determinación de alta fidelidad de la cinética de absorción de lípidos y quilomicrones.

<table><tbody><tr><td>Inyección de cloruro de sodio al 0,9 %, USP &nbsp; estéril</td><td>Hospira, Lake Forest, IL,</td><td>US NDC 0409-4888-06</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf de 1,7 mL Fisher</td><td>Scientific, Waltham, MA, US</td><td>7200184</td><td></td></tr><tr><td>14C-colesterol: Colesterol-[4-14C] (0,1mCi/mL)</td><td>American Radiomarked Chemicals Inc., St. Louis, MO, US</td><td>ARC 0857</td><td></td></tr><tr><td>Aguja</td> <td>de 18 GBecton Dickinson, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>2 pinzas de microdisección Dumont</td><td>Fine Science Tools, Foster City, CA, EE. UU</td>. <td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>2 pinzas</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, US</td><td>RS-5130</td><td></td></tr><tr><td>3H-TAG:&nbsp; Trioleína [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/mL)</td><td>American Radiomarked Chemicals Inc., St. Louis, MO, US</td><td>ART0199</td><td></td></tr><tr><td>3H-TG Trioleína [9,10-3H(N)] (3H-TG)</td><td>American Radiomarked Chemicals, INC. St. Louis</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>50% Inyección de Dextrodio, USP 25 gramos/50 mL&nbsp; estéril</td><td>Hospira, Lake Forest, IL, US</td><td>NDC-0409-6648-16</td><td></td></tr><tr><td>Analtech TLC Uniplates: matriz de gel de sílice Z265500-1PAK</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, US</td><td>11-101-0007</td><td></td></tr><tr><td>BD CareFusion ChloraPrep Swabstick</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, US</td><td>14-910-501</td><td></td></tr><tr><td>Betadine exfoliante quirúrgico</td><td>Dynarex Corp., Orangeburg, NY, US</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Cánula de corte en bisel</td><td>Braintree Scientific.,&nbsp; Braintree, MA, EE. UU.</td><td>MRE025</td><td></td></tr><tr><td>Inyección de buprenorfina HCl Carpuject PFS 0,3 mg/mL 10/Bx (Buprenex)</td><td>HenrySchein, Warrendale, PA, EE. UU</td><td>. 1278184</td><td></td></tr><tr><td>ratones machos C57BL6/J</td><td>Laboratorio Jackson, Bar Harbor, Maine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChloraPrep</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU</td><td>. 260100</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de colesterol</td><td>FujiFilm Healthcare, Lexington, MA, EE. UU.</td><td></td><td></td>99902601</tr><tr><td>Colesterol-[4-14C]</td><td>American Radiomarked Chemicals, INC. St. Louis</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>Caja de plexiglás transparente L43cm X W26 X H 21 con almohadilla térmica con control de temperatura y humidificación</td><td></td><td></td><td>nuestro propio diseño y modificaciones</td></tr><tr><td>disponibles comercialmente&nbsp; almohadilla térmica de anfibios/reptiles</td><td>ShenZhen XingHongChang Electric CO., LTD. ShenZhen, China</td><td>XHC-F035D</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de punta de algodón</td><td>Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>22363156</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de infusión duodenal - canuala</td><td>Braintree Scientific, Braintree, MA, US</td><td>MRE037</td><td></td></tr><tr><td>Ensure</td><td>Abbott Nutrition, Columbus, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plataforma quirúrgica con almohadilla térmica con combinación de bomba de agua caliente circulante</td><td>Patterson Scientific, Waukesha, WI, US</td><td>Gaymar T/ Bomba Inyección</td><td></td></tr> clásica <tr>de<td>hetarina sódica, USP 1,000 unidades/mL estéril</td><td>Mylan, Morgantown, WV, EE. UU</td>. <td>NDC-67457-384-31</td><td></td></tr><tr><td>Imagen J Software</td><td>Instituto Nacional de Salud, Bethesda, Maryland,Tijeras</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de iris</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, EE. UU</td>. <td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal Soluciones farmacéuticas, Riverview, MI, NDC DE EE. UU.</td><td> 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de inducción de isoflurano y aparato de anestesia</td><td>Patterson Scientific, Waukesha, WI, EE. UU</td>. <td>Cámara</td><td></td>de inducción de ratón</tr><tr><td>Pegamento Krazy</td><td>Elmer's products Inc., Columbus, OH, EE. UU</td>. <td>KG484</td><td></td></tr><tr><td>Liposyn III 20% lipídico inyectable</td><td>Hospira Inc. Lake Forest, Illinois, EE. UU</td><td></td><td></td>.</tr><tr><td>LS 6500 Contador de centelleo multipropósito</td><td>Beckman Coulter, Brea, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de resorte de microdisección</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, EE. UU</td>. <td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Ratón apoB ELISA Kit</td><td>ABCAM Inc., Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>AB230932-1</td><td></td></tr><tr><td>Portaagujas</td><td>Herramientas de ciencia fina, Foster City, CA, EE. UU</td>. <td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Retractores</td><td>Kent Scientific Co., Torrington, CT, EE. UU</td>. <td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>Rimadyl (Carprofeno)</td><td>Zoetis Inc., Kalamazoo MI, EE. UU</td>. <td>4019449</td><td></td></tr><tr><td>Mesa giratoria Barnstead Thermolyne</td><td>Labquake, Z&uuml; rich, Suiza</td><td>Barnstead Thermolyne</td><td></td></tr><tr><td>SMOFlipid 20% emulsión inyectable de lípidos, USP</td><td>Fresenius Kabi, Warrendale, PA, EE. UU</td>. <td>NDC-63323-820-01</td><td></td></tr><tr><td>Snuggle</td><td>Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'&Icirc; le-Perrot, QC J7V 7M4, Canadá</td><td>MS 02.5PM</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras quirúrgicas</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Co., Gaithersburg, MD, EE. UU</td>. <td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sutura (5-0 seda con aguja)</td><td>DemeTECH, Miami Lakes, FL, EE. UU</td>. <td>DT-719</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio electrónico de transmisión (JEOL 1400-FLASH 120KV )</td><td>JEOL, Peabody, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de triglicéridos Randox</td><td>Laboratories, Crumlin, Reino Unido</td><td>TR210</td><td></td></tr><tr><td>ULTIMA GOLD XR Fluido de centelleo</td><td>Perkin Elmer, Hebron, KY, EE. UU.</td><td>6013119</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrífuga, rotor S100AT4-497</td><td>SORVALL RC M120 GX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

el aislamiento de la linfa mesentérica fluida en ratones para cuantificar la cinética in vivo de la absorción de lípidos en la dieta y la secreción de quilomicrones

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

Las lipoproteínas intestinales, especialmente los quilomicrones ricos en triglicéridos, son un importante impulsor del metabolismo, la inflamación y las enfermedades cardiovasculares. Sin embargo, aislar las lipoproteínas intestinales es muy difícil in vivo porque primero se secretan desde el intestino delgado hacia los linfáticos mesentéricos. La linfa que contiene quilomicron luego se vacía en la vena subclavia desde el conducto torácico para entregar componentes de la comida al corazón, los pulmones y, en última instancia, la circulación de todo el cuerpo. Aislar los quilomicrones ingenuos es imposible de la sangre ya que el triglicérido de quilomicrones sufre hidrólisis inmediatamente después de la interacción con la lipoproteína lipasa y otros receptores de lipoproteínas en circulación. Por lo tanto, el procedimiento original de fístula linfática de 2 días, descrito por Bollman et al. en ratas, se ha utilizado históricamente para aislar la linfa mesentérica fresca antes de su entrada en la vena torácica. Ese protocolo ha sido mejorado y profesionalizado por el laboratorio de Patrick Tso durante los últimos 45 años, lo que permite el análisis de estas lipoproteínas críticas y secreciones del intestino. El procedimiento de fístula linfática Tso ahora se ha actualizado y se presenta aquí visualmente por primera vez. Este procedimiento revisado es una técnica quirúrgica de un solo día para instalar una sonda de alimentación duodenal, canular el conducto linfático mesentérico y recolectar linfa después de una comida en ratones conscientes. Los principales beneficios de estas nuevas técnicas incluyen la capacidad de recolectar linfa de ratones de forma reproducible (que aprovecha el poder de los modelos genéticos de ratón); la reducción del tiempo de anestesia para ratones durante la implantación del tubo de infusión duodenal y la cánula linfática; la capacidad de muestrear continuamente la linfa durante la alimentación y el período postprandial; la capacidad de medir cuantitativamente hormonas y citoquinas antes de su dilución e hidrólisis enzimática en sangre; y la capacidad de recolectar grandes cantidades de linfa para aislar lipoproteínas intestinales. Esta técnica es una herramienta poderosa para medir directa y cuantitativamente la absorción de nutrientes en la dieta, la síntesis intestinal de lipoproteínas y la secreción de quilomicrones.

La Figura 2 muestra la secreción de triglicéridos en la linfa mesentérica y las tasas promedio de flujo linfático en los ratones n = 17 de tipo salvaje (WT) más recientes que se sometieron al procedimiento de fístula linfática de un solo día descrito aquí. Como se muestra en la Figura 2A, la concentración de triglicéridos en la linfa aumenta en respuesta a un bolo intraduodenal de 300 μL de SMOFLipid. La concentración máxima de triglicéridos se alcanza a ~ 2-3 h después del bolo y disminuye constantemente durante el tiempo de 6 h (inmediatamente antes de la eutanasia). En paralelo con la secreción de triglicéridos, la tasa de flujo linfático aumenta desde la infusión en bolo de Time 0 hasta el final del experimento (Figura 2B).
Estos resultados muestran que se ha producido la implantación quirúrgica tanto del conducto linfático mesentérico como de la cánula intraduodenal y son representativos de un control positivo al que se podrían comparar otros contenidos linfáticos (hormonas, péptidos, nutrientes). Si no hay cambios en la concentración de triglicéridos en la linfa en respuesta a los lípidos intraduodenales en bolo, esto indica que la cirugía ha causado un daño significativo al intestino delgado, por lo que la capacidad de absorción de lípidos está ausente, o, en modelos genéticos previamente no fenotipados, esto sugeriría que el ratón tiene un defecto en la absorción de lípidos que es fisiológicamente significativo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig01.jpg"> Figura 1: Línea de tiempo propuesta para el modelo de ratón con fístula linfática. T-4, T-3, T-2: La doble canulación dura aproximadamente 2-4 h, seguida de la colocación de los ratones en cámaras de recuperación. T-1: Una vez que los ratones están en el período de recuperación, reciben una infusión duodenal continua de 5% de glucosa-0,9% de solución salina. T0: la infusión intraduodenal continua se cambia de 5% glucosa-0,9% solución salina a una infusión de nutrientes experimentales. T0-T6: Los ratones reciben glucosa intraduodenal continua al 5% en solución salina o, alternativamente, nutrientes continuos. La linfa se recolecta cada hora durante este período. Punto final: Los ratones son sacrificados y se pueden recolectar tejidos. La figura fue creada con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig02.jpg"> Figura 2: Concentración de triglicéridos linfáticos mesentéricos y caudal. A los ratones de tipo salvaje se les colocó una sonda de alimentación intraduodenal y una cánula linfática mesentérica. Los ratones recibieron una infusión en bolo de 300 μL de lípido. La linfa se recolectó durante 6 h en alícuotas cada hora y se mantuvo en hielo. (A) El contenido de triglicéridos linfáticos se determinó mediante un ensayo químico en cada alícuota horaria de linfa. (B) En las 6 h después de la infusión en bolo, el flujo linfático se representa como gramos de linfa secretada por hora. Los puntos son medios ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Métodos de administración de lípidos</td>
			<td colspan="6">Recomendaciones/Instrucciones</td>
		</tr><tr><td>Bolo mixto de emulsión lipídica</td>
			<td colspan="6">Se puede usar una dosis de 0,3 ml de ( A ) Liposyn III 20% inyectable de lípidos o (B) emulsión inyectable de lípidos SMOFlipid al 20%, USP, a través de un tubo de infusión intraduodenal. Estos lípidos emulsionados son útiles porque no necesitan ser preparados previamente, son líquidos a temperatura ambiente, son estériles y porque contienen una mezcla "fácilmente digerible" de ácidos grasos libres, triglicéridos, fosfolípidos y taurocolato de sodio. Esta es una buena infusión iniciadora para ratones que pueden tener insuficiencias pancreáticas o biliares.</td>
		</tr><tr><td>Bolo de triglicéridos</td>
			<td colspan="6">0.3 ml de aceite de oliva suavemente calentado (o trioleína purificada) como un lípido neutro que refleja una dieta rica en grasas insaturadas, manteca de cerdo (que refleja una dieta con alto contenido de grasas saturadas) o aceite de coco (que refleja una dieta con alto contenido de triglicéridos de cadena media) se pueden administrar por tubo de infusión intraduodenal o sonda oral. Si el triglicérido experimental está saturado, debe calentarse para que sea líquido a temperatura ambiente.</td>
		</tr><tr><td>Bolo de comida mixta</td>
			<td colspan="6">0.3 mL Asegúrese de que con la formulación que contiene 0.075 g de grasa (21.6%), 0.5 g de carbohidratos (64.0%) y 0.1125 g de proteína (14.4%) y refleja una comida mixta baja en grasa, se puede administrar por infusión intraduodenal.</td>
		</tr><tr><td>Bolo lipídico radiomarcado</td>
			<td colspan="6">5.0 μCi 3 trioleato de glicerol marcado con H y / o 1.0 μCi 14C-colesterol en 0.3ml de aceite de oliva se pueden administrar a través de infusión intraduodenal. 14 Colesterol-C: Colesterol-[4-14C] con actividad específica de 55Ci/mmol y una concentración de 0.1mCi/mL. 3 Trioleína H-TG [9,10-3H(N)] (3H-TG) con actividad específica de 60Ci/mmol y concentración de 1mCi/mL</td>
		</tr><tr><td>Dosis continua</td>
			<td colspan="6">La infusión de cualquiera de las formulaciones de nutrientes experimentales anteriores a una velocidad de 0,3 ml / h (en lugar de 0,3 ml de bolo total), dará como resultado una salida constante de triglicéridos en la linfa. Esto difiere de una infusión en bolo, donde la concentración de triglicéridos en la linfa alcanza su punto máximo en ~ 2-3 h, y luego regresa a las concentraciones basales en ~ 6-8 h.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Tabla de infusiones lipídicas.

El presente protocolo describe un protocolo quirúrgico detallado para aislar la linfa intestinal que fluye en respuesta a infusiones de nutrientes intraduodenales en ratones. Esto permite la determinación fisiológica de la absorción total de lípidos intestinales y la síntesis y secreción de quilomicrones en respuesta a diversos nutrientes experimentales.

El aislamiento de la linfa mesentérica fluida en ratones para cuantificar la cinética in vivo de la absorción de lípidos en la dieta y la secreción de quilomicrones

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, ...

Nuestro protocolo nos permite medir directamente el metabolismo postprandial en la linfa mesentérica que fluye. Esto es poderoso porque podemos determinar cuantitativamente el movimiento de nutrientes desde el intestino delgado hacia la linfa. Y podemos medir citoquinas, lípidos dietéticos, otros componentes dietéticos y linfocitos.Esta técnica puede ayudarnos a diseccionar la dinámica de los lípidos dietéticos que se mueven hacia la linfa, la síntesis y secreción de quilomicrones. El modelo de un día presentado aquí tiene varias ventajas. En primer lugar, reduce el tiempo experimental.En segundo lugar, reduce el estrés animal. Aumenta la supervivencia animal. Y en general, disminuye el número experimental.Demostrando nuestra técnica hoy estará nuestro cirujano de laboratorio senior, el Sr. Nick Dedousis. Y nuestro científico investigador, el Dr. Lihong Teng. Después de preparar al ratón para la cirugía, agarre la piel con pinzas y haga una incisión abdominal en la línea media con tijeras pequeñas.Luego, corte hacia el esternón y hacia abajo hasta la grasa inguinal. Usando el retractor, mueva las vísceras peritoneales fuera del camino hasta que el conducto linfático sea visible. Usando una punta Q empapada en solución salina, mueva el hígado hacia el lado superior derecho del cuerpo y los intestinos y el estómago a la izquierda del animal.Luego exponga la arteria mesentérica superior y el conducto linfático intestinal estirando el duodeno transversalmente hacia la izquierda. Prepare un tubo de cánula de 30 a 40 centímetros de longitud insertando una aguja roma. Luego, usando una jeringa de un mililitro, enjuague una pequeña cantidad de heparina a través del tubo y corte un bisel en la punta del tubo de la cánula con tijeras.Luego, haga una incisión poco profunda y un conducto linfático para usar tijeras de iris como se describe en el manuscrito. Sostenga el tubo de la cánula con un par de pinzas finas e inserte suavemente el bisel de la punta en el conducto. Como el conducto linfático es frágil, use una gota de cianoacrilato para pegar la cánula linfática en la linfa mesentérica en lugar de atar el catéter con una sutura.Ahora, usando una aguja de calibre 18, perfore un orificio a través de la región pilórica del estómago posterior al esfínter pilórico e inserte el tubo de infusión duodenal en el estómago de uno a dos milímetros más allá del esfínter pilórico en el duodeno. Luego, asegure el tubo al estómago con una ligadura de cuerda de bolso usando una sutura de seda 5/0 y sellado con una gota de pegamento de cianoacrilato para evitar fugas. Iniciar la infusión intraduodenal de 5% de glucosa y 0,9% de solución salina.Reemplace los órganos en la cavidad corporal y suture la incisión de la línea media. Coloque el ratón suavemente en una sujeción de acurrucamiento. Proporcionar a los ratones una infusión intraduodenal continua de solución salina y glucosa durante una hora.Revise la cánula para el flujo linfático y comience a ordeñar la cánula linfática para mantener el flujo linfático. Realizar la clásica infusión lipídica de un bolo de emulsión lipídica de 0,3 mililitros a través del tubo de infusión intraduodenal. Luego, cambie la infusión de nuevo a 5% de glucosa y 0.9% de solución salina a 0.3 mililitros por hora continuamente hasta el final del experimento.Recoja las muestras de linfa y pese previamente los tubos de microcentrífuga durante 60 minutos y mantenga la linfa en hielo. Pese los tubos la segunda vez para establecer el peso de la linfa secretada cada 60 minutos. Recoja el estómago, el ciego y el colon y coloque cada órgano en un tubo de vidrio de 15 mililitros.Divida el intestino delgado en tres o cuatro segmentos. Córtelo longitudinalmente y recoja el contenido luminal enjuagando el tejido con dos o tres mililitros de PBS frío. Retire la mucosa intestinal que comprende las células epiteliales y la lámina propia asociada de la capa muscular raspando cada sección en dos o tres mililitros de PBS frío con una pinza curva.Coloque todos los tejidos, los aislados luminal y mucoso, y la capa muscular en tubos de vidrio. La concentración de triglicéridos en la linfa aumentó en respuesta a un bolo intraduodenal de 300 microlitros de SMOFlipid. La concentración máxima de triglicéridos se alcanza a las dos o tres horas después del bolo y disminuye constantemente durante el tiempo de seis horas.La tasa de flujo linfático aumenta desde la infusión en bolo de tiempo cero hasta el final del experimento. Un objetivo importante de este protocolo era reducir el estrés animal, aumentar la tasa de supervivencia y disminuir el tiempo de anestesia. Para lograr esto, cambiamos las jaulas de sujeción Bollman por acurrucados, y agregamos humedad, calor y reposición de líquidos.Nuestro protocolo de fístula de un día nos permite medir en tiempo real, in vivo, la dinámica de absorción de lípidos. También nos permite estudiar la diafonía de los órganos intestinales, el metabolismo, la absorción de nutrientes en la dieta y los fenotipos inmunes.

the-isolation-flowing-mesenteric-lymph-mice-to-quantify-vivo-kinetics

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

El endotelio glicocalix / endotelial capa superficial está muy bien estudiada mediante microscopía intravital. Microscopía intravital es técnicamente difícil en un órgano en movimiento, como el pulmón. Se demuestra cómo simultánea campo claro y microscopía de fluorescencia se puede usar para estimar el espesor de capa de la superficie endotelial en un libremente...

Medición in vivo de la capa de ratón pulmonar superficie endotelial

Aquí describimos una técnica para canular el conducto linfático mesentérico en ratas que permite cuantificar el transporte de lípidos y fármacos a través del sistema linfático después de la administración intestinal. La técnica se puede adaptar para evaluar las concentraciones de linfa mesentérica y/o el transporte de líquidos, células inmunitarias, péptidos, proteínas y moléculas lipofílicas.

La linfa mesentérica Conducto canulado Rata Modelo: Aplicación de la Evaluación de Intestinal Linfático Transporte de Drogas

Caco-2 pueden servir como modelo in vitro para estudiar el transporte de lípidos por parte de los enterocitos y fármacos/vitaminas liposolubles en lípidos. El sistema de membrana permeable separa el compartimento apical del basolateral, mientras que el sistema de expresión de lentivirus ofrece un método eficaz de sobreexpresión génica. El aislamiento de lipoproteínas está confirmado por TEM.

El uso de células Caco-2 para el Estudio de lípidos Transporte por el Intestino

Presentamos un procedimiento quirúrgico para cateterizar el tronco linfático intestinal en cerdos neonatos para recolectar grandes cantidades de componentes del metabolismo lipídico de la linfa eferente.

Largo Plazo La cateterización de la linfa intestinal Tronco y colección de linfa en cerdos neonatales

Existe un creciente interés en la caracterización cuantitativa de los linfocitos intestinales debido al creciente reconocimiento de que estas células desempeñan un papel crítico en una variedad de enfermedades intestinales y sistémicas. En este protocolo, describimos cómo aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado para su posterior caracterización por citometría de flujo.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

Aquí describimos un protocolo detallado para el aislamiento de los linfocitos de los sitios inductivos como el tejido linfoide asociado a intestino de Peyer y los ganglios linfáticos mesentéricos drenantes y los sitios efectores incluyendo la lámina propia y la epitelio intestinal del pequeño sistema inmune intestinal.

Aislar los linfocitos desde el sistema de inmune Intestinal pequeño ratón

Aquí, demostramos los métodos de cuantificación en vivo de la salida de leucocitos de ingenuo, inflamado y mala piel murina. Realizamos una comparación directa de dos modelos: photoconversion de aplicación y en situ FITC transdérmica. Además, demostramos la utilidad de photoconversion para el seguimiento de salida de leucocitos de tumores cutáneos.

Cuantificación de leucocitos salida vía los recipientes linfáticos de la piel murina y tumores

Este documento proporciona tres ensayos fáciles y accesibles para evaluar el metabolismo de los lípidos en ratones.

Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

La función epitelial intestinal desregulada de la barrera y las inmunorespuestas son sellos de la enfermedad de intestino inflamatoria que siguen siendo investigados mal debido a una carencia de modelos fisiológicos. Aquí, se describe un modelo de asa intestinal de ratón que emplea un segmento intestinal bien vascularizado y exteriorizado para estudiar la permeabilidad de la mucosa y el reclutamiento de leucocitos in vivo.

Evaluación Funcional De La Permeabilidad Intestinal Y La Migración Transepitelial Neutrófilo En Ratones Usando Un Modelo De Bucle Intestinal Estandarizado

Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

Este protocolo describe un procedimiento de supervivencia para una linfadenectomía mesentérica murina segura y bien tolerada en cada una de las cuatro estaciones a lo largo de la cadena de ganglios linfáticos mesentéricos. Este procedimiento es adaptable para permitir la interrupción selectiva de la comunicación linfática con el colon distal, el colon proximal y/o el intestino delgado.

Linfodenectomía mesentérica murina por alteración selectiva de la comunicación linfática con el intestino específico de la región

Aprende a aislar linfa mesentérica en ratones para medir la absorción de lípidos y la secreción de quilomicrones en tiempo real. Este protocolo reduce el estrés animal y mejora la supervivencia.

El aislamiento de la linfa mesentérica fluida en ratones para cuantificar la cinética in vivo de la absorción de lípidos en la dieta y la secreción de quilomicrones (Video) | JoVE Journal

El aislamiento de la linfa mesentérica fluida en ratones para cuantificar la cinética in vivo de la absorción de lípidos en la dieta y la secreción de quilomicrones

Explorar más videos