Name: Cuantificación basada en citometría de flujo y análisis de células B miocárdicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T14:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 46 s
Description: Aprende a cuantificar células B miocárdicas mediante citometría de flujo con este protocolo optimizado. Maximiza el rendimiento de recuperación celular y reduce la variabilidad en muestras cardíacas de ratón.

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Este estudio fue financiado por las subvenciones del NHLBI 5K08HLO145108-03 y 1R01HL160716-01 otorgadas a Luigi Adamo.
El citómetro de flujo Aurora utilizado para desarrollar este estudio fue financiado por la subvención S10OD026859 de los NIH. Reconocemos el apoyo del JHU Ross Flow Cytometry Core.

Todos los experimentos descritos en este manuscrito se realizaron con la aprobación del IACUC en la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins.
1. Preparativos
<ol><li>Prepare el búfer del sistema de control de los bienes sobre el terreno, como se describe en el cuadro 1.</li>
	<li>Asegúrese de que haya suficienteCO2 para sacrificar a los animales.</li>
	<li>Prepare el espacio de disección (coloque la almohadilla de banco y coloque la cinta y las herramientas de disección cerca).</li>
	<li>Etiquete los tubos de 15 ml, coloque 3 ml de HBSS con calcio y magnesio en cada tubo (consulte la Tabla de materiales) y colóquelos en hielo (un tubo por corazón y uno adicional para el grupo de referencia/controles de citometría de flujo). Además, llene las placas de Petri pequeñas (35 mm) con HBSS.</li>
	<li>Encienda el agitador con control de temperatura, configúrelo a 37 °C y enfríe previamente la centrífuga a una temperatura de 4 °C.</li>
	<li>Prepare la bomba de jeringa y ajuste el caudal a 3 ml/min. Llene una jeringa de 20 ml con HBSS, prepare la línea de tubos con tampón y elimine cualquier burbuja.</li>
</ol>2. Tinción intravascular de células B (in vivo)
<ol><li>Pesar un ratón macho de 12 semanas de edad de la cepa C57BL/6J. Cargue una jeringa de insulina de 3/10 cc con 100 μL de dilución de anticuerpos B220 (1:10, en PBS). Cubra la jeringa con papel de aluminio para protegerla de la luz.</li>
	<li>Anestesiar a un ratón.<ol><li>Aplicar una inyección intraperitoneal de 2,2,2-tribromoetanol al 2% con una dosis de 400 mg/kg y esperar 10-20 min. NOTA: Controle la respiración y el movimiento del ratón. Una vez que el ratón deja de moverse, estimule el dolor pellizcando el dedo del pie; La ausencia de un reflejo de abstinencia indica una anestesia adecuada.</li>
		<li>Si no se logra una anestesia adecuada en el transcurso de 20 min, se puede administrar una dosis adicional de anestésico a 100 mg / kg, y se debe realizar una evaluación de la cinética del ratón, el reflejo de abstinencia y la respiración cada 5 minutos.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque el mouse en el banco de laboratorio en una almohadilla inclinada hacia un lado, tire suavemente hacia abajo de la piel de la espalda y presione ligeramente el cuerpo contra el banco para que el ojo sobresalga.</li>
	<li>Inyecte el anticuerpo B220 diluido del paso 2.1 mediante inyección retroorbitaria.<ol><li>Introducir la jeringa en el ojo a 45° del plano sagital de la cabeza del ratón. Inyecte lentamente la solución. Si se siente resistencia, retire la jeringa y vuelva a entrar. Espere 2 min. NOTA: El tiempo de incubación prolongado pondría en peligro la capacidad de discriminar las células B intravasculares frente a las extravasculares, ya que daría tiempo al anticuerpo inyectado para difundirse fuera de la vasculatura.</li>
	</ol></li>
	<li>Eutanasia del ratón según las regulaciones de IACUC.<ol><li>Abra el flujo deCO2 a la cámara de eutanasia a una velocidad de 0,5 L / min, o el caudal recomendado según el tamaño de su cámara.</li>
		<li>Coloque el ratón en la cámara durante el tiempo recomendado, asegurándose de que ya no respira. Retirarlo y realizar la luxación cervical como método secundario de eutanasia.</li>
		<li>Una vez que el ratón es sacrificado, proceda rápidamente a la sustracción de órganos y la perfusión.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Colección de corazones
<ol><li>Abertura del pecho.<ol><li>Sostenga la piel del ratón con fórceps en el área epigástrica. Haga una abertura de 2 mm en la piel con tijeras y use los fórceps para pelar la piel para revelar la capa de fascia, una capa translúcida brillante, del pecho y el abdomen. Corte en el epigastrio a través de la fascia y el peritoneo para abrir la pared abdominal y revelar el proceso xifoide. Sujete el proceso xifoide con pinzas hemostáticas.</li>
		<li>Con las tijeras, haga un corte vertical a través de la pared torácica al nivel de la línea clavicular media a cada lado y levante la pared torácica anterior para revelar el contenido del mediastino, utilizando fórceps hemostáticos como peso para mantener la abertura.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfusión y extracción del corazón.<ol><li>Con fórceps, elimine cualquier grasa o tejido tímico que rodee el corazón.</li>
		<li>Sostenga la aorta de forma segura desde atrás con fórceps. Introduzca la aguja de la jeringa (25 G) en el ápice del corazón. Perfundir con 3 mL de HBSS a una velocidad de 3 mL/min. NOTA: Monitoree la perfusión. El hígado debe llenarse y la sangre en los vasos coronarios debe eliminarse por completo. Se recomienda el uso de una bomba de jeringa calibrada a 1 ml / minuto para mantener un flujo constante.</li>
		<li>Cortar la aorta con tijeras y sacar el corazón. Lave el corazón en la placa de Petri con HBSS para eliminar cualquier resto de sangre. Usando tijeras y fórceps, retire la grasa, el tejido conectivo y el timo, y seque el corazón. Pese el corazón aislado y anote el peso en miligramos. Picar el corazón a temperatura ambiente en trozos pequeños (1-2 mm) con una cuchilla. NOTA: Los corazones de ratón adultos pueden pesar entre 0.090-0.210 mg.</li>
		<li>Mida la masa de tejido cardíaco y coloque 60 mg del corazón picado para digerir en un tubo de 15 ml con 3 ml de HBSS. Retener el tejido cardíaco restante y colocarlo en un tubo etiquetado como "Tejido de control de referencia"; Esto se utilizará para el control de compensación para señales vivas muertas y autofluorescencia.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Digestión del corazón y tinción celular
<ol><li>Agregue enzimas a cada tubo que contenga tejido picado (ver Tabla 1). Agregue 0.5 μL/mg de DNasa 1 (300 unidades para 60 mg de tejido cardíaco), 0.5 μL/mg de colagenasa II (625 unidades para 60 mg de tejido cardíaco) y 0.2 μL/mg de hialuronidasa (50 unidades para 60 mg de tejido cardíaco) al tubo.</li>
	<li>Coloque la reacción de digestión en el agitador durante 30 minutos a 300 rpm. Ajuste la rejilla agitadora a unos 25° de inclinación.</li>
	<li>Añadir 7 ml de HBSS a cada uno de los tubos de reacción de 15 ml y centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C con la aceleración y la ruptura ajustadas a moderadas o lentas. Decantar el sobrenadante y resuspender cada gránulo en 5 ml de tampón de lisis ACK para eliminar los glóbulos rojos. Incubar en el tampón de lisis ACK durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Agregue 10 ml de PBS a cada tubo, mezcle y luego filtre en un tubo de 50 ml con un filtro de 40 μm. Asegúrese de que todos los residuos estén dentro de la cámara del filtro. Aplaste cualquier residuo en el filtro con un émbolo de jeringa hasta que esté completamente suspendido dentro de la cámara del filtro.</li>
	<li>Agregue PBS a través del filtro hasta que el volumen alcance los 25 ml por corazón; Esto permitirá que las celdas suspendidas pasen a través del filtro. Agregue 25 ml adicionales de PBS al tubo de tejido de control de referencia y divida el volumen en diferentes tubos (25 ml cada uno). Etiquete uno de los tubos como "Sin manchas" y el otro como "Vivo-muerto". Centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C. NOTA: En este punto, prepare la dilución para la tinción de muertos vivos (dilución: 1:500 en 1x PBS).</li>
	<li>Decantar el sobrenadante, resuspender el pellet en el tubo sin teñir en 100 μL de PBS y cada uno de los otros pellets en 100 μL de la dilución de tinción de muertos vivos. Incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad, cubriendo el cubo de hielo con papel de aluminio.</li>
	<li>Añadir 500 μL de tampón FACS a cada muestra y transferirlo a un tubo FACS marcado a través de un filtro de 40 μm. Centrifugar los tubos FACS a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Resuspender el pellet en 500 μL de tampón FACS.</li>
	<li>Añadir 50 μL de solución bloqueadora Fc (ver Tabla 1) a cada tubo, excepto para los tubos sin teñir y muertos vivos. Mezclar e incubar durante 5 min.</li>
	<li>Agregue 50 μL de solución de mezcla de anticuerpos (ver Tabla 1) a cada tubo, excepto los tubos sin teñir y muertos vivos, e incubar durante 30 minutos en la oscuridad, cubriendo el cubo de hielo con papel de aluminio.</li>
	<li>Añadir 2 ml de tampón FACS a cada tubo y centrifugar a 250 x g durante 5 min a 4 °C. Retirar el sobrenadante y resuspender en 300-500 μL de tampón FACS.</li>
</ol>5. Citometría de flujo
<ol><li>Configure los ajustes de control del instrumento. NOTA: En este protocolo la muestra se analiza con un citómetro de flujo Cytek Aurora de 4 láseres. Otro citómetro de flujo apropiado podría usarse para detectar los marcadores de interés.<ol><li>Abra el software de control del instrumento (consulte Tabla de materiales). En la parte superior de la ventana, seleccione la pestaña Adquisición y haga clic en Nuevo +. Aparecerá una ventana llamada Crear nuevo experimento .</li>
		<li>En la sección Biblioteca, en el campo Tipo para filtrar, escriba PE, PerCP-Cy5.5, BV421, Alexa Fluor 700 y Zombie Aqua, haga clic en Agregar después de escribir cada uno. Los nombres de los fluoróforos deben verse a la derecha. A continuación, haga clic en Siguiente para pasar a la pestaña Grupo .</li>
		<li>En la pestaña Grupo , haga clic en el símbolo con un tubo para agregar el corazón para el análisis.</li>
		<li>Haga clic en el grupo + Referencia y aparecerá una ventana. En la columna de etiqueta fluorescente, seleccione Zombie Aqua y, en la columna de tipo de control, seleccione Celdas y, a continuación, haga clic en Guardar.</li>
		<li>Haga clic en la pestaña Siguiente > Marcadores ; Se mostrará una tabla con los nombres de los fluoróforos. Escriba el marcador de celda correspondiente en la primera fila de cada columna de fluoróforos y escriba Entrar: CD45 para PerCP-Cy5.5; CD19 para BV421; CD11b para Alexa Fluor 700; B220 para PE; y muertos vivientes para Zombie Aqua.</li>
		<li>Haga clic en Siguiente dos veces para ir a la pestaña Adquisición . En Eventos para registrar del grupo de experimento, escriba 10.000.000 y en el mismo campo para la línea del grupo de referencia escriba 200.000. Haga clic en Guardar y abrir. Las otras configuraciones deben permanecer como predeterminadas, Tiempo de detención a 10.000 y Detención de volumen a 3.000.</li>
		<li>En la parte inferior izquierda, haga clic en Control de instrumentos. Ajuste el voltaje a FSC-50, SSC-175, SSC-B-175. A continuación, seleccione Control de adquisición. Para la opción Caudal , seleccione Alto en el menú desplegable.</li>
	</ol></li>
	<li>Adquiera muestras de referencia con un citómetro y desmezcle en software.<ol><li>Vortex el tubo cardíaco sin teñir y colóquelo firmemente en el puerto de inyección de la muestra (SIP). Asegúrese de que la flecha indicadora verde apunte a la muestra correcta, luego haga clic en Inicio en el panel Control de adquisición del software del citómetro y espere hasta que se registren los eventos. Haga lo mismo para el tejido cardíaco manchado de muertos vivos.</li>
		<li>Seleccione el menú Desmezclar y defina los siguientes controles:<ol><li>Seleccione las casillas de verificación de PE, PerCP-Cy5.5, BV421 y Alexa Fluor 700 en la columna de la biblioteca. Asegúrese de que Zombie Aqua no esté marcado en la misma columna. En la parte inferior, marque la opción de Autofluorescencia como etiqueta fluorescente.</li>
			<li>Haga clic en Siguiente para ir a la pestaña Identificar poblaciones positivas/negativas . En esta pestaña, se mostrará un gráfico de FSC-A vs. SSC-B-A. Haga clic y arrastre los puntos del polígono para seleccionar un área entre 1,0 M y 4,0 M en el eje FSC-A, y entre 0,2 M y 3,0 M en el eje SSC-B-A.</li>
			<li>En el siguiente gráfico a la derecha, V5-A se mostrará en el eje X. Mueva las puertas para seleccionar la mitad del pico en el extremo derecho como positivo y una región en el lado izquierdo de la gráfica como negativa. En la gráfica titulada Grupo de referencia - Sin teñir, seleccione una población en un rango similar. Para esto no se tiene que establecer lo no manchado positivo-negativo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Adquirir muestras experimentales.<ol><li>Para cada tubo que contenga una muestra para un ratón individual, voltice el tubo y colóquelo firmemente en el SIP. Asegúrese de que la flecha indicadora verde apunte a la muestra correcta, luego haga clic en Inicio en el panel Control de adquisición del software del citómetro y espere hasta que se registren los eventos.</li>
	</ol></li>
	<li>Estrategia de compuertas.<ol><li>Seleccione la pestaña Hoja de cálculo predeterminada sin mezclar . Cree un gráfico FSC-A vs. SSC-A utilizando la herramienta Diagrama de puntos en la parte superior. Seleccione eventos superiores a 0,4 M en el eje FSC-A y superiores a 0,8 M en el eje SSC-A mediante la herramienta de selección de polígonos. Haga doble clic en esta selección y se mostrará un nuevo gráfico.</li>
		<li>En el gráfico recién creado, haga clic con el botón derecho en la etiqueta del eje X y seleccione AF-A; haga clic con el botón derecho en la etiqueta del eje Y y seleccione Mancha de muertos vivos. Haga clic en la herramienta de selección de rectángulo en la parte superior y seleccione todos los eventos por debajo de 105 en el eje de muertos vivos que correspondan a la señal de muertos vivos inferior. Haga doble clic en esta selección y se mostrará un nuevo gráfico.</li>
		<li>En la nueva gráfica, haga clic con el botón derecho para seleccionar PerCP-Cy5.5-A para el eje X y SSC-A para el eje Y. Con la herramienta de selección de rectángulos, seleccione los eventos superiores a 104 en el eje PerCP-Cy5.5-A que correspondan a las células CD45 positivas. Haga doble clic en la selección y se mostrará un nuevo gráfico.</li>
		<li>En el nuevo gráfico, haga clic con el botón derecho para seleccionar FSC-A para el eje X y FSC-H para el eje Y. Utilizando la herramienta de selección de polígonos, seleccione los eventos que siguen una tendencia en la que el valor FSC-A y el valor SSC-A son los mismos; con esto se eliminarán los dobletes celulares y la población en la selección se denominará población CD45+. Haga doble clic en la selección para mostrar una nueva gráfica con la población CD45+.</li>
		<li>En la gráfica de población CD45+, haga clic con el botón derecho para seleccionar BV421 en el eje X frente a SSC-A en el eje Y. Con la herramienta de selección de polígonos, seleccione la población a la derecha en el eje BV421 . Esta es la población de células B. Haga doble clic dos veces en esta población para crear dos nuevas gráficas con la población de células B.<ol><li>Haga clic con el botón derecho para configurar la primera gráfica de células B con PE-A en el eje X y BV421-A en el eje Y. La población de la derecha corresponde a las células B intravasculares, y la población de la izquierda representa las células B intersticiales. Utilice la herramienta de selección de polígonos para realizar una selección de ambos.</li>
			<li>Haga clic derecho para configurar la segunda gráfica de células B con Alexa Fluor 700-A en el eje X y SSC-A en el eje Y. La población de la izquierda corresponde a las células CD11b-, y los eventos a la derecha (si los hay) corresponden a las células CD11b+.</li>
			<li>Haga clic con el botón derecho en cada selección y, a continuación, haga clic en Propiedades de la puerta. Haga clic en Count y % Parent para mostrar los tamaños y porcentajes. Registre el número de eventos y porcentajes para un análisis posterior de los datos.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>

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Luigi Adamo es cofundador de i-Cordis, LLC, una compañía enfocada en el desarrollo de moléculas inmunomoduladoras para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, con un interés específico en los derivados del fármaco modulador de células B pirfenidona. Los autores restantes no tienen conflictos que declarar.

Un creciente cuerpo de evidencia indica que las células B juegan un papel importante en el contexto de la fisiología miocárdica y la remodelación/adaptación miocárdica a la lesión 7,8,9,10,11,12,13,36. La citometría de flujo es una excelente herramienta par...

Los linfocitos B son células inmunes altamente especializadas que desempeñan un papel importante en las respuestas inmunes adaptativas e innatas1. Hay dos poblaciones principales de células B: una población más pequeña de células B1 que se producen principalmente durante la vida embrionaria, y una población preponderante de células B2 que se producen en la vida adulta en la médula ósea1. Después de madurar en la médula ósea, las células B migran a los órganos linfoides primarios y secundarios. Desde allí recirculan continuamente entre los órganos linfoides viajando a través de los vasos sanguíneos y linfáticos2. Las células B expresan anticuerpos específicos en su superficie, que funcionan como receptores. Cuando las células B encuentran un antígeno que se une a su receptor, se puede activar una señal de activación. Las células B activadas migran al tejido donde se encontró el antígeno o regresan a la médula ósea, donde pueden madurar y convertirse en células plasmáticas productoras de anticuerpos 3,4.
Recientemente, se ha apreciado que el corazón alberga una población considerable de células B. Estudios en roedores han demostrado que las células B colonizan el corazón temprano durante el desarrollo embrionario5, y que las células B asociadas al miocardio son en su mayoría células B2 intravasculares, ingenuas, adheridas al endotelio6,7, con un pequeño porcentaje de células B17. Todavía hay muchas áreas de incertidumbre, pero los datos disponibles indican que las células B desempeñan un papel importante tanto en el corazón ingenuo como en el contexto de la adaptación miocárdica a la lesión.
Los estudios en el corazón murino naïve han demostrado que, al inicio del estudio, las células B miocárdicas se encuentran principalmente en el espacio intravascular, adheridas al endotelio (se encontró que el >95% de las células B cardíacas murinas se encontraban en el espacio intravascular). Se encontró que estas células B tienen patrones de expresión génica diferentes de los de las células B circulantes aisladas de la sangre periférica. El análisis de corazones ingenuos de animales deficientes en células B y controles singénicos encontró que los animales que carecían de células B tenían corazones más pequeños y una mayor fracción de eyección6. Toda esta evidencia sugiere que las células B podrían modular el crecimiento miocárdico y / o la función miocárdica, y que no solo las células B intersticiales sino también las intravasculares podrían ser responsables de tales observaciones. También se encontró que las células B modulan el fenotipo de los macrófagos residentes del miocardio8.
Varios estudios han demostrado que las células B juegan un papel importante en el contexto de la adaptación miocárdica a la lesión 8,9,10,11,12,13. Las células B se acumulan transitoriamente en el corazón lesionado, probablemente a través de un mecanismo dependiente de CXCL13-CXCR511,13. A partir de ahí, las células B promueven la remodelación cardíaca adversa a través de varios mecanismos que incluyen el reclutamiento de monocitos mediados por citoquinas 9,12. Además, las células B pueden producir anticuerpos contra proteínas cardíacas que pueden promover la extensión del daño cardíaco y la remodelación cardíaca adversa a través de varios mecanismos 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . Las células B también pueden ejercer efectos protectores sobre el corazón lesionado a través de la secreción de IL-1010.
A medida que crece el número de grupos que investigan el papel de las células B en el corazón ingenuo y lesionado, cada vez es más importante definir protocolos compartidos para cuantificar y evaluar adecuadamente las células B del miocardio y así evitar inconsistencias que ya han comenzado a aparecer en la literatura. Hasta ahora, se ha informado que las células B son una de las células inmunes más prevalentes en el corazón de roedores7 y están presentes en una prevalencia marcadamente menor que las células mieloides26,27, o que son bastante raras 28. Del mismo modo, varios grupos han descrito que el número de células B miocárdicas aumenta después de la lesión miocárdica isquémica aguda 7,9,13, pero un grupo no informó cambios en el número de células B del miocardio lesionado29. Los estudios sobre las células inmunes cardíacas rara vez dan detalles sobre las condiciones de perfusión y no hay consenso sobre las condiciones de digestión. Dado que en el corazón de roedor una gran proporción de células B son intravasculares y la extracción de células inmunes del miocardio depende en gran medida del método de digestión utilizado, las diferencias reportadas en la literatura podrían ser el resultado de diferencias en la perfusión de órganos y la digestión de tejidos.
Aquí se presenta un método detallado para la cuantificación basada en citometría de flujo de células B miocárdicas murinas que maximiza el rendimiento de la recuperación de células B al optimizar las condiciones de perfusión y digestión y permite la discriminación de células B miocárdicas intravasculares vs. extravasculares6. Este protocolo es una adaptación y optimización de otros protocolos similares que distinguen entre células inmunes intravasculares e intersticiales 28,30,31.
En este protocolo, estandarizamos la perfusión miocárdica para eliminar las células B que flotan en el espacio intravascular sin eliminar las células B biológicamente relevantes adheridas al endotelio microvascular. Además, basándonos en protocolos previos que han descrito el uso de inyección intravenosa de anticuerpos para distinguir las células inmunes intravasculares de las intersticiales32, y aprovechando el hecho de que las células B expresan el marcador de superficie B22033, demostramos cómo distinguir las células B miocárdicas intravasculares frente a las extravasculares a través de la inyección intravascular de un anticuerpo específico B220 inmediatamente antes del sacrificio del animal y la perfusión cardíaca. Este protocolo es relevante para la investigación de cualquier científico interesado en incluir el análisis de células B miocárdicas en el corazón ingenuo y lesionado. La implementación generalizada de este protocolo reducirá las inconsistencias entre los grupos de investigación, permitirá el análisis de los cambios en los grupos de células B miocárdicas intravasculares y extravasculares y, por lo tanto, reforzará el avance de los descubrimientos en el campo de la inmunología cardíaca.
En resumen, el protocolo representa un flujo de trabajo optimizado para cuantificar y analizar las células B del miocardio a través de la citometría de flujo, y al mismo tiempo distinguir entre las células ubicadas en el espacio extravascular y el espacio intravascular.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-ratón/humano Anticuerpo CD11b</td><td>101222</td><td>BioLegend</td><td>100 &micro; g 200 y micro; L</td></tr><tr><td>(CellTreat 29481) Filtro de células, 40 y micro; m, Blue</td><td>QBIAP303</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL Tubo de microcentrífuga natural</td><td>1605-0000</td><td>SealRite, EE. UU. Inyección</td><td></td></tr><tr><td>de cloruro de sodio al 0,9% científico, USP</td><td>114-055-101</td><td>Calidad biológica</td><td>0,90%</td></tr><tr><td>1,5 mL Tubo de microcentrífuga natural</td><td>1615-5500</td><td>SealRite, EE. UU. Scientific</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L Puntas de filtro TipOne graduadas</td><td>11213810</td><td>EE. UU. Scientific</td><td></td></tr><tr><td>1000 y micro; L Puntas de filtro graduadas TipOne 11267810</td><td></td><td>EE. UU. Tubo</td> de centrífuga científico <td></td></tr> de <tr><td>15 mL, tapón de sellado, polipropileno, libre de ARNasa/DNasa</td><td>430052</td><td></td> Válvula de cierre de 1 vía Corning<td></td></tr><tr><td>, policarbonato</td><td>SVPT951</td><td>ECT Fabricación</td><td></td></tr> de <tr><td>2,2,2-tribromoetanol</td><td>T48402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; L Puntas de filtro graduadasOne 11208810</td><td></td><td>EE. UU</td>. Válvula de cierre científica <td></td></tr><tr><td>de 3 vías, policarbonato</td><td>SVPT953</td><td>ECT Fabricación</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de fondo redondo de poliestireno de 5 mL, estilo 352054 de 12 x 75 mm, un</td><td></td> tubo de centrífuga de 50 mL de la <td>marca</td><td></td>Corning</tr><tr><td>, tapón de sellado de tapón, polipropileno, libre de ARNasa/DNasa</td><td>430290</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>ACK ( Cloruro de Amonio-Potasio) Tampón de lisado</td><td>118-156-101</td><td>Calidad</td><td>Osmolalidad Biológica: 290 + o -5% mOsm/kg Adaptador H20</td></tr><tr><td>4x50ml, para cubo rectangular de 250 mL en Rotor A-4-63</td><td>5810759005</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador para Tubos de Centrífuga de 15 mL, 9 Tubos por Adaptador, Fondo Cónico para usar con Rotor Modelo A-4-62</td><td>22638289</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador para 15 tubos de fondo redondo 2.6 &ndash; 7 mL, para cubeta rectangular de 250 mL en Rotor A-4-62</td><td>22638246</td> Papel de aluminio <td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Rollo de 12 pulgadas x 75' .0007</td><td>UPC 109153</td><td>Reynolds Wrap</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Induction Chamber - Ratón</td><td>RWD-AICMV-100</td><td>Conduct Science</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer Jeringa de punta deslizante con aguja adjunta 25 G x 5/8 pulg., estéril, de un solo uso, 1 mL</td><td>309626</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Brandzig Jeringas de insulina ultrafina 29G 1cc 1/2" 100-Pack CMD</td><td>2613</td><td>Brandzig</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-ratón CD19 Anticuerpo</td><td>115537</td><td>BioLegend</td><td>50 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>TAPAS para tubos de flujo con malla de filtro 35 y micro; m, Doble posición para tubos de 12 x 75 mm, estéril</td><td>T9009</td><td>Southern Labware</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Dioxide USP E CGA 940&nbsp;</td><td>CD USPE</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cole-Parmer Essentials Vaso de precipitados de forma baja, vidrio, 500 mL</td><td>UX-34502-46</td><td>Cole-Parmer</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa 2</td><td>LS004176</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Conector latón cromado 1/4" hembra NPT x 1/4" lengüeta</td><td>Y992611-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora Citómetro</td><td></td><td>de flujo Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Diss 1080 Boquilla 1/4 BARB CP</td><td>M-08-12</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>DNase I - 40,000 U</td><td>D4527</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Easypet&nbsp; 3 - Controlador electrónico de pipetas</td><td>4430000018</td> balanza electrónica <td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>, AX223/E</td><td>30100606</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Eppendorf 5810R</td><td>5810R</td><td>Eppendorf Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Research plus pipetas</td><td></td> variables de 1 canal <td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.8.1</td><td></td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>GLACIERbrand, bandeja de hielo de triple densidad (IPAN-3100)</td><td>Z740287</td><td>Heathrow Scientific</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x) - Ca2+ [+] Mg2+ [+]</td><td>14025076</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>Hialuronidasa</td><td>H3506</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>Kelly Hemostáticos, Recto</td><td>13018-14</td><td>Fine Science Tools</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Luer Slip estéril, de un solo uso, 20 mL</td><td>302831</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940</td><td>M1-940-PG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Almohadillas McKesson, Moderadas</td><td>4033- CS150</td><td>McKesson</td><td></td></tr><tr><td>Navigator Balanza portátil multipropósito</td><td>NV2201</td><td>Ohaus Corp.</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]</td><td>10010023</td><td>gibco</td><td>1x</td></tr><tr><td>PE anti-ratón/humano CD45R/B220 Anticuerpo</td><td>103208</td><td>BioLegend</td><td>200 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>PerCP/Cyanine5.5 anti-ratón Anticuerpo CD45 103132</td><td></td><td>BioLegend</td><td>100 &micro; g 500 uL</td></tr><tr><td>Placa de Petri, Apilable 35 mm x 10 mm Poliestireno estéril</td><td>FB0875711YZ</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Paquete: Diss 1080 Tuerca/CO2/CO2-02</td><td>M08-1</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Potente LED de 6 vatios Iluminador de doble cuello de cisne</td><td>LED-6W</td><td>AmScope</td><td></td></tr><tr><td>Aguja PrecisionGlide 25 G x 5/8 (0,5 mm x 16 mm)</td><td>305122</td><td>BD Becton, Dickinson and Company</td><td></td></tr><tr><td>Rata purificada Anti-Ratón CD16/CD32 (Ratón BD Fc Bloque) Clon 2.4G2 (RUO)</td><td>553141</td><td>BD Becton, Dickinson and Company Biosciences</td><td>0,5 mg/mL</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td>La Fundación</td><td></td>R</tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>9501250000</td><td>Accutec Blades Inc</td><td></td></tr><tr><td>Regulador analítico de dos etapas 0-25 psi Entrega CGA320 3500 psi Entrada</td><td>Y12244A320-AG</td><td>AirGas USA</td><td></td></tr><tr><td>Rotor A-4-62, incl. 4 cubos rectangulares de 250 mL</td><td>Rotor A-4-62</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica, taponada, 10 mL, estéril, apirógena/libre de endotoxinas, no citotóxica, 1 unidad(es)/blíster</td><td>86.1254.001</td><td>Sarstedt AG & Co KG</td><td></td></tr><tr><td>Cinta de etiquetas Sigma</td><td>L8394</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td></tr><tr><td>SpectroFlo 3.0.0</td><td></td><td>Cytek Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>Spex VapLock Luer Fitting, PP, Recto, Macho Luer Lock x 1/8" Lengüeta de manguera; 1/EA</td><td>MTLL230-6005</td><td>Spex</td><td></td></tr><tr><td>Std Tubo de Laboratorio de Pared, Tamaño S2, Excelon, 1/8" de diámetro interno x 3/16" de diámetro exterior x 1/32" de pared x 50' de largo</td><td>CG-730-003</td><td>Laboratorio Excelon</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa PP/PE sin aguja, 3 mL</td><td>Z683566</td><td>Millipore Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>55-1199 (95-240)</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td></tr><tr><td>Thomas Temporizador de alarma de 3 canales TM10500</td><td>9371W13</td><td>Thomas Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Rack de tubos, 12&nbsp; posiciones, 6 para 5.0&nbsp; mL y 15&nbsp; mL tubos y 6 para 25&nbsp; mL y 50&nbsp; Tubos mL, polipropileno, posiciones numeradas, esterilizables en autoclave</td><td>30119835</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>Tube Rack, 12&nbsp; posiciones, para 5.0&nbsp; mL y 15&nbsp; Tubos de mL, polipropileno, posiciones numeradas, esterilizables en autoclave</td><td>30119827</td><td>Eppendorf</td><td></td></tr><tr><td>TYGON R-3603 Tubos de laboratorio, diámetro interno y times; O.D. 1/4 pulg. y veces; 3/8 pulg.</td><td>T8913 (Millipore Sigma)</td><td>Tygon, Saint-Gobain</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>SI-0236</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de disección VWR con pasador guía con puntas curvas</td><td>89259-946</td><td>Avantor, de VWR</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de disección VWR, punta afilada, 4&frac12; "</td><td>82027-578</td><td>Avantor, de VWR</td><td></td></tr><tr><td>Agitador orbital de incubación VWR, modelo 3500I</td><td>12620-946</td><td>Avantor, de VWR</td><td></td></tr><tr><td>Zombie Aqua Kit de viabilidad reparable</td><td>423102</td><td>BioLegend</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificación basada en citometría de flujo y análisis de células b miocárdicas

Flow Cytometry-Based Quantification and Analysis of Myocardial B-Cells

Un creciente cuerpo de evidencia muestra que los linfocitos B juegan un papel importante en el contexto de la fisiología miocárdica y la adaptación miocárdica a la lesión. Sin embargo, la literatura informa datos contrastantes sobre la prevalencia de las células B del miocardio. Se ha informado que las células B se encuentran entre las células inmunes más prevalentes en el corazón de roedores o que están presentes, pero con una prevalencia marcadamente menor que las células mieloides, o que son bastante raras. Del mismo modo, varios grupos han descrito que el número de células B miocárdicas aumenta después de la lesión miocárdica isquémica aguda, pero un grupo no informó cambios en el número de células B del miocardio lesionado. La implementación de un método compartido y reproducible para evaluar la prevalencia de las células B miocárdicas es fundamental para armonizar las observaciones de diferentes grupos de investigación y, por lo tanto, promover el avance del estudio de las interacciones miocárdicas de las células B. Según nuestra experiencia, las observaciones aparentemente contrastantes reportadas en la literatura probablemente se derivan del hecho de que las células B miocárdicas murinas son en su mayoría intravasculares y están conectadas al endotelio microvascular. Por lo tanto, el número de células B recuperadas de un corazón murino es exquisitamente sensible a las condiciones de perfusión utilizadas para limpiar el órgano y al método de digestión utilizado. Aquí informamos de un protocolo optimizado que da cuenta de estas dos variables críticas de una manera específica. Este protocolo permite el análisis reproducible basado en citometría de flujo del número de células B miocárdicas murinas y permite a los investigadores distinguir las células B miocárdicas extravasculares de las intravasculares.

Una vez que se completa la adquisición y se recopilan todos los eventos, los datos deben analizarse de acuerdo con la práctica estándar de citometría de flujo. El enfoque del análisis variará dependiendo del objetivo individual de cada experimento. En este caso, se buscó la cuantificación de células B intravasculares y extravasculares, y se expresó como el número de células por mg de tejido.
Cuando se utiliza un citómetro espectral, se recomienda comenzar el análisis con una activación inicial...

Aquí presentamos un protocolo para la cuantificación y diferenciación de linfocitos B miocárdicos en función de su ubicación en el espacio intravascular o endotelial mediante citometría de flujo.

Cuantificación basada en citometría de flujo y análisis de células B miocárdicas

A growing body of evidence shows that B-lymphocytes play an important role in the context of myocardial physiology and myocardial adaptation to injury. ...

La literatura reporta datos contrastantes sobre la prevalencia de células B miocárdicas. Esto probablemente se debe a la variabilidad en las técnicas de perfusión y digestión. Nuestro protocolo permite el análisis basado en citometría de flujo reproducible en células B miocárdicas.Esta técnica maximiza el rendimiento de recuperación de las células B y reduce la variabilidad en los recuentos de citometría de flujo entre las células B y otras poblaciones de muestras de corazón. Este método optimizado de digestión y aislamiento se puede modificar fácilmente para implementar un panel de anticuerpos extendido para estudiar diferentes tipos de células inmunes en el corazón. El protocolo también se puede aplicar a otros órganos, como el pulmón o el hígado, para estudiar las células B asociadas con esos órganos.Para empezar, pesa un ratón macho de 12 semanas de edad. Cargue una jeringa de insulina de 310 cc con 100 microlitros de la solución de anticuerpos B220. Inyecte el anticuerpo B220 diluido mediante inyección retroorbitaria y proceda rápidamente a la extracción de órganos y la perfusión.Después de la eutanasia, sostenga la piel del ratón con fórceps en el área epigástrica. Haga una abertura de dos milímetros en la piel con tijeras y use los fórceps para pelar la piel y revelar la capa de fascia. Corte en el epigastrio a través de la fascia y el peritoneo.Sujete el proceso xifoide con pinzas hemostáticas. Haga un corte vertical a través de la pared torácica al nivel de la línea medioclavicular en cada lado y levante la pared torácica anterior para revelar el contenido del mediastino. Sostenga la aorta de forma segura desde atrás con fórceps.Introduzca la aguja de la jeringa en el ápice del corazón. Perfundido con tres mililitros de HBSS a una velocidad de tres mililitros por minuto. Cortar la aorta y extraer el corazón.Lave el corazón en la placa de Petri con HBSS. Pese el corazón aislado y anote el peso en miligramos. Picar el corazón a temperatura ambiente en trozos pequeños con una cuchilla.Las piezas del corazón deben tener un tamaño aproximado de 1,5 milímetros. Mida la masa de tejido cardíaco usando una balanza y coloque 60 miligramos del corazón picado para ser digerido en un tubo de 15 mililitros en hielo con tres mililitros de HBSS. Repita este proceso para un ratón que no recibió la inyección de anticuerpos B220 y colóquelo en el tubo con tres mililitros de tejido de control de referencia marcado con HBSS.Agregue enzimas a cada tubo que contenga tejidos picados. Agregue 0.5 microlitros por miligramos de DNasa I, 0.5 microlitros por miligramo de colagenasa II y 0.2 microlitros por miligramo de hialuronidasa. Coloque la reacción de digestión en el agitador durante 30 minutos a 300 rotaciones por minuto.Los tubos se colocan en el agitador en un ángulo pequeño, unos 25 grados de inclinación. Agregue siete mililitros de HBSS a cada uno de los tubos de reacción de 15 mililitros y centrifugar a 250 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de decantar el sobrenadante, resuspender cada pellet en cinco mililitros de tampón de lisis ACK.Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de agregar 10 mililitros de PBS a cada tubo, mezcle y filtre en un tubo de 50 mililitros con un colador de 40 micrómetros. Aplaste cualquier residuo en el filtro con un émbolo de jeringa para asegurarse de que todo el material pase a través del filtro.Después de agregar PBS a través del filtro hasta que el volumen alcance los 25 mililitros por corazón, agregue 25 mililitros adicionales de PBS al tubo de tejido de control de referencia y divida el volumen en dos tubos diferentes. Etiquete uno de los tubos sin manchar y el otro vivo/muerto. Después de centrifugar a 250 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, decantar el sobrenadante y volver a suspender el tubo sin teñir en 100 microlitros de PBS y cada uno de los otros gránulos en 100 microlitros de la solución de tinción viva/muerta.Incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Después de agregar 500 microlitros de tampón FACS a cada muestra, transfiérala a un tubo FACS a través de un filtro de 40 micrómetros. Después de rechazar los tubos FACS a 250 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón FACS.Agregue 50 microlitros de solución de bloqueo de FC a cada tubo, excepto los tubos sin teñir y vivos / muertos. Mezclar e incubar durante cinco minutos. Después de agregar 50 microlitros de solución de mezcla de anticuerpos a cada tubo, excepto los tubos sin teñir y vivos / muertos, incubar durante 30 minutos en la oscuridad, cubriendo el cubo de hielo con papel de aluminio.Al igual que con la mancha viva/muerta, lavar de nuevo con 500 microlitros de tampón FACS y resuspender en 300 a 500 microlitros de tampón FACS. Abra el software de control del instrumento. En la parte superior de la ventana, seleccione la pestaña Adquisición y haga clic en Nuevo.En la sección de biblioteca, en el campo Tipo para filtrar, escriba PE, PerCP-Cy5.5, violeta brillante 421, Alexa Fluor 700 y Zombie Aqua, seleccione el fluoro-4 y haga clic en Agregar después de escribir cada uno. A continuación, haga clic en Siguiente para pasar a la pestaña Grupos. Ahora haga clic en el símbolo con un tubo para agregar el corazón para el análisis.Haga clic en el grupo de referencia y aparecerá una ventana. En la columna de etiquetas fluorescentes, seleccione Zombie Aqua como etiqueta fluorescente, eliminando cualquier otra haciendo clic en el icono rojo de la papelera junto a cada una. A continuación, en el icono Tipo de control, seleccione Celdas.A continuación, haga clic en Guardar. Haga clic en Siguiente. A continuación, haga clic en la pestaña Marcadores.Se mostrará una tabla. Escriba el marcador de celda correspondiente en la primera fila de cada columna de fluoro-4 y presione Entrar. Haga clic en Siguiente dos veces para ir a la pestaña Adquisición.En Events To Record de las muestras experimentales, tipo 10 millones, y en el mismo campo para la línea del grupo de referencia, tipo 200, 000. Haga clic en Guardar y abrir. En la parte inferior izquierda, haga clic en Control de instrumentos.Ajuste el voltaje a FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Seleccione el control de adquisición. Para la opción de caudal, seleccione Alto en el menú desplegable.Vortex el tubo cardíaco sin teñir y colóquelo firmemente en el puerto de inyección de muestra. Asegúrese de que la flecha indicadora verde apunte a la muestra correcta. A continuación, haga clic en Grabar y espere hasta que se registren los eventos.Haga lo mismo para el tejido cardíaco manchado vivo/muerto. Seleccione el menú Desmezclar y establezca los controles. Seleccione la casilla de verificación Autofluorescencia como etiqueta fluorescente.Luego, haga clic en Siguiente para continuar con la pestaña Identificar poblaciones positivas / negativas. En esta pestaña, se mostrará un gráfico del área de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión lateral. Haga clic y arrastre los puntos del polígono para seleccionar un área entre 1 y 4 millones en el eje del área de dispersión hacia adelante y entre 0,2 y 3 millones en el eje del área de dispersión lateral.En el siguiente gráfico a la derecha, V5-A se mostrará en el eje X. Mueva las puertas para seleccionar la mitad del pico en el extremo derecho como positivo y una región en el lado izquierdo de la gráfica como negativa. En la gráfica titulada Grupo de referencia-Sin teñir, seleccione una población en un rango similar.Para los no manchados, no se debe seleccionar ningún positivo/negativo. Haga clic en el botón Desmezclar en vivo. Ahora adquiera las muestras experimentales, haga un vórtice del tubo y colóquelo de forma segura en el SIP.Asegúrese de que la flecha indicadora verde apunte a la muestra correcta. A continuación, haga clic en Grabar en el panel Control de adquisición del software del citómetro y espere hasta que se registren los eventos. Seleccione la pestaña Hoja de cálculo predeterminada sin mezclar.Cree un gráfico FCS-A frente a SSC-A utilizando la herramienta de diagrama de puntos en la parte superior. Seleccione eventos superiores a 0,4 millones en el eje FSC-A y superiores a 0,8 millones en el eje SSC-A mediante la herramienta de selección de polígonos. Cree un nuevo trazado haciendo doble clic en la selección y, en este nuevo gráfico, haga clic con el botón derecho en la etiqueta del eje Y y seleccione mancha viva/muerta.Haga clic derecho en la etiqueta del eje X y seleccione Autofluorescencia A.Seleccione todos los eventos por debajo de 10 al quinto en el eje vivo/muerto. Estas son las células vivas. Haga doble clic en esta selección.En la nueva gráfica, seleccione PerCP-Cy5.5A para el eje X y SSC-A para el eje Y. Seleccione las poblaciones en el lado derecho del PerCP-Cy5.5A. Estas son las células inmunes.Haga doble clic en la selección. En la nueva gráfica, seleccione FSC-A para el eje X y la altura de dispersión hacia adelante para el eje Y. Seleccione los eventos que siguen una tendencia en la que el valor FSC-A y el valor SSC-A son los mismos.Esto selecciona celdas individuales y elimina dobletes. Haga doble clic en esta selección para ver una nueva gráfica en la población unicelular CD45 positiva. De la gráfica de población unicelular CD45 positiva, seleccione violeta brillante 421 en el eje X frente a SSC-A en el eje Y.Seleccione la población a la derecha en el eje 421 violeta brillante. Esta es la población de células B. Haga doble clic dos veces en esta población para crear dos nuevas gráficas con la población de células B.Configure la primera gráfica de células B con PEA en el eje X y violeta brillante 421A en el eje Y. La población de la derecha corresponde a las células B intervasculares, y la población de la izquierda representa las células B intersticiales. Seleccione ambos.Configure la segunda gráfica de células B con Alexa Fluor 700A en el eje X y SSC-A en el eje Y. La población de la izquierda corresponde a las células CD11b negativas, y los eventos a la derecha corresponden a las células CD11b positivas. Haga clic derecho en cada sección y, a continuación, haga clic en Propiedades de la puerta.Haga clic en Count and Parent (Count and Parent (Recuento y padre) para mostrar el número de eventos y porcentajes de las poblaciones principales. Registre el número de eventos y porcentajes para un análisis posterior de los datos. Después de la eliminación de dobletes en un corazón ingenuo no lesionado, se espera que alrededor del 20% de las células CD45 positivas sean células B CD19 positivas.De estas células, en promedio, el 5,5% se encuentran en el espacio intersticial. El 94,5% se encuentran en el espacio intravascular. De toda la población de células B encontradas en el corazón, solo alrededor del 1,6% corresponde a células B1 basadas en el marcador de superficie CD11b y el otro 98,4% corresponde a células B2.Al analizar las células B del miocardio a través de citometría de flujo, es crucial perfundir y picar el corazón correctamente siguiendo el protocolo. La filtración adecuada del corazón digerido también es esencial para maximizar la recuperación de las células inmunes.

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