Cuantificación basada en citometría de flujo y análisis de células B miocárdicas

La literatura reporta datos contrastantes sobre la prevalencia de células B miocárdicas. Esto probablemente se debe a la variabilidad en las técnicas de perfusión y digestión. Nuestro protocolo permite el análisis basado en citometría de flujo reproducible en células B miocárdicas.

Esta técnica maximiza el rendimiento de recuperación de las células B y reduce la variabilidad en los recuentos de citometría de flujo entre las células B y otras poblaciones de muestras de corazón. Este método optimizado de digestión y aislamiento se puede modificar fácilmente para implementar un panel de anticuerpos extendido para estudiar diferentes tipos de células inmunes en el corazón. El protocolo también se puede aplicar a otros órganos, como el pulmón o el hígado, para estudiar las células B asociadas con esos órganos.

Para empezar, pesa un ratón macho de 12 semanas de edad. Cargue una jeringa de insulina de 310 cc con 100 microlitros de la solución de anticuerpos B220. Inyecte el anticuerpo B220 diluido mediante inyección retroorbitaria y proceda rápidamente a la extracción de órganos y la perfusión.

Después de la eutanasia, sostenga la piel del ratón con fórceps en el área epigástrica. Haga una abertura de dos milímetros en la piel con tijeras y use los fórceps para pelar la piel y revelar la capa de fascia. Corte en el epigastrio a través de la fascia y el peritoneo.

Sujete el proceso xifoide con pinzas hemostáticas. Haga un corte vertical a través de la pared torácica al nivel de la línea medioclavicular en cada lado y levante la pared torácica anterior para revelar el contenido del mediastino. Sostenga la aorta de forma segura desde atrás con fórceps.

Introduzca la aguja de la jeringa en el ápice del corazón. Perfundido con tres mililitros de HBSS a una velocidad de tres mililitros por minuto. Cortar la aorta y extraer el corazón.

Lave el corazón en la placa de Petri con HBSS. Pese el corazón aislado y anote el peso en miligramos. Picar el corazón a temperatura ambiente en trozos pequeños con una cuchilla.

Las piezas del corazón deben tener un tamaño aproximado de 1,5 milímetros. Mida la masa de tejido cardíaco usando una balanza y coloque 60 miligramos del corazón picado para ser digerido en un tubo de 15 mililitros en hielo con tres mililitros de HBSS. Repita este proceso para un ratón que no recibió la inyección de anticuerpos B220 y colóquelo en el tubo con tres mililitros de tejido de control de referencia marcado con HBSS.

Agregue enzimas a cada tubo que contenga tejidos picados. Agregue 0.5 microlitros por miligramos de DNasa I, 0.5 microlitros por miligramo de colagenasa II y 0.2 microlitros por miligramo de hialuronidasa. Coloque la reacción de digestión en el agitador durante 30 minutos a 300 rotaciones por minuto.

Los tubos se colocan en el agitador en un ángulo pequeño, unos 25 grados de inclinación. Agregue siete mililitros de HBSS a cada uno de los tubos de reacción de 15 mililitros y centrifugar a 250 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de decantar el sobrenadante, resuspender cada pellet en cinco mililitros de tampón de lisis ACK.

Incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de agregar 10 mililitros de PBS a cada tubo, mezcle y filtre en un tubo de 50 mililitros con un colador de 40 micrómetros. Aplaste cualquier residuo en el filtro con un émbolo de jeringa para asegurarse de que todo el material pase a través del filtro.

Después de agregar PBS a través del filtro hasta que el volumen alcance los 25 mililitros por corazón, agregue 25 mililitros adicionales de PBS al tubo de tejido de control de referencia y divida el volumen en dos tubos diferentes. Etiquete uno de los tubos sin manchar y el otro vivo/muerto. Después de centrifugar a 250 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados, decantar el sobrenadante y volver a suspender el tubo sin teñir en 100 microlitros de PBS y cada uno de los otros gránulos en 100 microlitros de la solución de tinción viva/muerta.

Incubar en hielo durante 30 minutos en la oscuridad. Después de agregar 500 microlitros de tampón FACS a cada muestra, transfiérala a un tubo FACS a través de un filtro de 40 micrómetros. Después de rechazar los tubos FACS a 250 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón FACS.

Agregue 50 microlitros de solución de bloqueo de FC a cada tubo, excepto los tubos sin teñir y vivos / muertos. Mezclar e incubar durante cinco minutos. Después de agregar 50 microlitros de solución de mezcla de anticuerpos a cada tubo, excepto los tubos sin teñir y vivos / muertos, incubar durante 30 minutos en la oscuridad, cubriendo el cubo de hielo con papel de aluminio.

Al igual que con la mancha viva/muerta, lavar de nuevo con 500 microlitros de tampón FACS y resuspender en 300 a 500 microlitros de tampón FACS. Abra el software de control del instrumento. En la parte superior de la ventana, seleccione la pestaña Adquisición y haga clic en Nuevo.

En la sección de biblioteca, en el campo Tipo para filtrar, escriba PE, PerCP-Cy5.5, violeta brillante 421, Alexa Fluor 700 y Zombie Aqua, seleccione el fluoro-4 y haga clic en Agregar después de escribir cada uno. A continuación, haga clic en Siguiente para pasar a la pestaña Grupos. Ahora haga clic en el símbolo con un tubo para agregar el corazón para el análisis.

Haga clic en el grupo de referencia y aparecerá una ventana. En la columna de etiquetas fluorescentes, seleccione Zombie Aqua como etiqueta fluorescente, eliminando cualquier otra haciendo clic en el icono rojo de la papelera junto a cada una. A continuación, en el icono Tipo de control, seleccione Celdas.

A continuación, haga clic en Guardar. Haga clic en Siguiente. A continuación, haga clic en la pestaña Marcadores.

Se mostrará una tabla. Escriba el marcador de celda correspondiente en la primera fila de cada columna de fluoro-4 y presione Entrar. Haga clic en Siguiente dos veces para ir a la pestaña Adquisición.

En Events To Record de las muestras experimentales, tipo 10 millones, y en el mismo campo para la línea del grupo de referencia, tipo 200, 000. Haga clic en Guardar y abrir. En la parte inferior izquierda, haga clic en Control de instrumentos.

Ajuste el voltaje a FSC 50, SSC 175, SSC-B 175. Seleccione el control de adquisición. Para la opción de caudal, seleccione Alto en el menú desplegable.

Vortex el tubo cardíaco sin teñir y colóquelo firmemente en el puerto de inyección de muestra. Asegúrese de que la flecha indicadora verde apunte a la muestra correcta. A continuación, haga clic en Grabar y espere hasta que se registren los eventos.

Haga lo mismo para el tejido cardíaco manchado vivo/muerto. Seleccione el menú Desmezclar y establezca los controles. Seleccione la casilla de verificación Autofluorescencia como etiqueta fluorescente.

Luego, haga clic en Siguiente para continuar con la pestaña Identificar poblaciones positivas / negativas. En esta pestaña, se mostrará un gráfico del área de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión lateral. Haga clic y arrastre los puntos del polígono para seleccionar un área entre 1 y 4 millones en el eje del área de dispersión hacia adelante y entre 0,2 y 3 millones en el eje del área de dispersión lateral.

En el siguiente gráfico a la derecha, V5-A se mostrará en el eje X. Mueva las puertas para seleccionar la mitad del pico en el extremo derecho como positivo y una región en el lado izquierdo de la gráfica como negativa. En la gráfica titulada Grupo de referencia-Sin teñir, seleccione una población en un rango similar.

Para los no manchados, no se debe seleccionar ningún positivo/negativo. Haga clic en el botón Desmezclar en vivo. Ahora adquiera las muestras experimentales, haga un vórtice del tubo y colóquelo de forma segura en el SIP.

Asegúrese de que la flecha indicadora verde apunte a la muestra correcta. A continuación, haga clic en Grabar en el panel Control de adquisición del software del citómetro y espere hasta que se registren los eventos. Seleccione la pestaña Hoja de cálculo predeterminada sin mezclar.

Cree un gráfico FCS-A frente a SSC-A utilizando la herramienta de diagrama de puntos en la parte superior. Seleccione eventos superiores a 0,4 millones en el eje FSC-A y superiores a 0,8 millones en el eje SSC-A mediante la herramienta de selección de polígonos. Cree un nuevo trazado haciendo doble clic en la selección y, en este nuevo gráfico, haga clic con el botón derecho en la etiqueta del eje Y y seleccione mancha viva/muerta.

Haga clic derecho en la etiqueta del eje X y seleccione Autofluorescencia A.Seleccione todos los eventos por debajo de 10 al quinto en el eje vivo/muerto. Estas son las células vivas. Haga doble clic en esta selección.

En la nueva gráfica, seleccione PerCP-Cy5.5A para el eje X y SSC-A para el eje Y. Seleccione las poblaciones en el lado derecho del PerCP-Cy5.5A. Estas son las células inmunes.

Haga doble clic en la selección. En la nueva gráfica, seleccione FSC-A para el eje X y la altura de dispersión hacia adelante para el eje Y. Seleccione los eventos que siguen una tendencia en la que el valor FSC-A y el valor SSC-A son los mismos.

Esto selecciona celdas individuales y elimina dobletes. Haga doble clic en esta selección para ver una nueva gráfica en la población unicelular CD45 positiva. De la gráfica de población unicelular CD45 positiva, seleccione violeta brillante 421 en el eje X frente a SSC-A en el eje Y.

Seleccione la población a la derecha en el eje 421 violeta brillante. Esta es la población de células B. Haga doble clic dos veces en esta población para crear dos nuevas gráficas con la población de células B.

Configure la primera gráfica de células B con PEA en el eje X y violeta brillante 421A en el eje Y. La población de la derecha corresponde a las células B intervasculares, y la población de la izquierda representa las células B intersticiales. Seleccione ambos.

Configure la segunda gráfica de células B con Alexa Fluor 700A en el eje X y SSC-A en el eje Y. La población de la izquierda corresponde a las células CD11b negativas, y los eventos a la derecha corresponden a las células CD11b positivas. Haga clic derecho en cada sección y, a continuación, haga clic en Propiedades de la puerta.

Haga clic en Count and Parent (Count and Parent (Recuento y padre) para mostrar el número de eventos y porcentajes de las poblaciones principales. Registre el número de eventos y porcentajes para un análisis posterior de los datos. Después de la eliminación de dobletes en un corazón ingenuo no lesionado, se espera que alrededor del 20% de las células CD45 positivas sean células B CD19 positivas.

De estas células, en promedio, el 5,5% se encuentran en el espacio intersticial. El 94,5% se encuentran en el espacio intravascular. De toda la población de células B encontradas en el corazón, solo alrededor del 1,6% corresponde a células B1 basadas en el marcador de superficie CD11b y el otro 98,4% corresponde a células B2.

Al analizar las células B del miocardio a través de citometría de flujo, es crucial perfundir y picar el corazón correctamente siguiendo el protocolo. La filtración adecuada del corazón digerido también es esencial para maximizar la recuperación de las células inmunes.